CN107290438B - 一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽领域，特别涉及一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法。本发明的方法使用一种新的特殊的固定相填料色谱柱，以表面带正电荷的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。该类型色谱柱具有更高的选择性与灵敏度，以及较低的载碳量，在特定的色谱条件下，可以更准确有效地测定利拉鲁肽中有关物质的含量。本发明提供的检测方法主峰与前后杂质之间的分离度、理论塔板数和拖尾因子均可以满足方法要求。

Description

一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法
技术领域
本发明涉及多肽领域，特别涉及一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法。
背景技术
利拉鲁肽，是一种长效治疗2型糖尿病的胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物。GLP-1是人体内存在的一种生理性多肽，它能够根据体内葡萄糖水平高低，按需促进胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰岛素拮抗激素胰高血糖素的分泌，从而发挥降糖作用。然而，人体产生的GLP-1很不稳定，很快就会被体内的二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，因此若使用天然GLP-1降低血糖，需持续静脉输注或持续皮下注射。
利拉鲁肽是一种GLP-1类似物，与人GLP-1具有97％的序列同源性，人GLP-1可以结合并激活GLP-1受体。GLP-1受体为天然GLP-1的靶点，GLP-1是一种内源性肠促胰岛素激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。与天然GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天一次的给药方案。皮下注射给药后，其作用时间延长的机理包括：使吸收减慢的自联作用；与白蛋白结合；对二肽基肽酶IV(DPP-IV)和中性内肽酶(NEP)具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。利拉鲁肽的活性由其与GLP-1受体间特定的相互作用介导，导致环磷酸腺苷(cAMP)的增加。利拉鲁肽能够以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素的分泌，同时以葡萄糖浓度依赖的模式降低过高的胰高糖素的分泌。因此，当血糖升高时，胰岛素分泌受到刺激，同时胰高糖素分泌受到抑制。
化学合成的利拉鲁肽为31肽，分子式为C172H265N43O51，分子量为3751.20。外观为白色至类白色粉末或疏松块状物，有引湿性；几乎不溶于水。其结构式如式I所示：
Figure BDA0000955608070000021
式I
化学合成的利拉鲁肽在合成工艺中，难免引入一系列的杂质，如异构体杂质、缺损肽杂质等，这些杂质统称为有关物质，其存在将严重影响利拉鲁肽的产品质量。由于这些有关物质杂质毒性数据不明确，对于患者用药必然存在一定的潜在风险。因此，为了保证利拉鲁肽产品质量，提高患者用药安全性，对利拉鲁肽有关物质进行严格的质量控制具有非常重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法。本发明提供一种利拉鲁肽有关物质的高效液相色谱分析方法。本发明的方法中，使用了一种新的特殊的固定相填料色谱柱，以表面带正电荷的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。该类型色谱柱具有更高的选择性与灵敏度，以及较低的载碳量，在特定的色谱条件下，可以更准确有效地测定利拉鲁肽中有关物质的含量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法，其流动相A为0.03％(v/v)～0.3％(v/v)三氟乙酸水溶液；流动相B中水、乙腈、甲醇、三氟乙酸的体积比为(100～200)：(25～100)：(600～900)：(0.1～1)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的流动相A为0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液；流动相B中水、乙腈、甲醇、三氟乙酸的体积比为150：50：800：0.6。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的柱温为25～50℃。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的柱温为35℃。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的流速为0.3～1.0mLl/min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的流速为0.5mLl/min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的洗脱梯度为：
Figure BDA0000955608070000031
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的洗脱梯度为：
Figure BDA0000955608070000032
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的色谱柱为CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的色谱仪为ACQUITY I-CLASS(Waters)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法中所述多肽为利拉鲁肽。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的检测波长为210nm。
本发明的方法中，使用了一种新的特殊的固定相填料色谱柱，以表面带正电荷的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。该类型色谱柱具有更高的选择性与灵敏度，以及较低的载碳量，在特定的色谱条件下，可以更准确有效地测定利拉鲁肽中有关物质的含量。
进一步的，本发明还研究了流动相A、流动相B、柱温、流速和洗脱梯度对结果的影响。
由实施例3的实验表明，柱温3中主峰与前杂的分离度最大；所有柱温中主峰与后杂的分离度均符合分离要求；柱温1和柱温2中理论塔板数较大；所有柱温中拖尾因子基本一致；柱温2和柱温3分离出的杂质个数最多。综上所述，柱温2的仪器系统参数最好，因此，选择35℃作为本方法的柱温。
由实施例4的实验表明，流速3中主峰与前杂的分离度最大；流速3中主峰与后杂的分离度最大；流速1中理论塔板数最大；所有流速中拖尾因子基本相同；所有流速分离出的杂质个数相同。综上所述，流速3的仪器系统参数最好，因此，选择0.5ml/min作为本方法的流速。
由实施例5的实验表明，浓度1、浓度2、浓度3的流动相A中主峰与前杂的分离度基本相同；所有浓度的流动相A中主峰与后杂的分离度均符合分离要求；所有浓度的流动相A中理论塔板数基本相同；浓度1与浓度2的流动相A中拖尾因子大于浓度3与浓度4；浓度2的流动相A中所检出的杂质个数最多。综上所述，浓度2的流动相A的仪器系统参数最好，因此，选择0.05％的三氟乙酸水溶液作为本方法的流动相A。
由实施例6的实验表明，组分4的流动相B中主峰与前杂的分离度最大；所有组分的流动相B中主峰与后杂的分离度均符合分离要求；组分1的流动相B中理论塔板数最大；组分1的流动相B中拖尾因子最小；组分1的流动相B中所检出的杂质个数最多。综上所述，组分1的流动相B的仪器系统参数最好，因此，选择水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：50：800：0.6(体积比)作为本方法的流动相B。
综合上述最优条件，由实施例7的试验结果可知，本发明提供的检测方法主峰与前后杂质之间的分离度、理论塔板数和拖尾因子均可以满足方法要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1中仪器1的谱图；
图2示实施例1中仪器2的谱图；
图3示实施例2中色谱柱1的谱图；
图4示实施例2中色谱柱2的谱图；
图5示实施例2中色谱柱3的谱图；
图6示实施例3中柱温1的谱图；
图7示实施例3中柱温2的谱图；
图8示实施例3中柱温3的谱图；
图9示实施例3中柱温4的谱图；
图10示实施例4中流速1的谱图；
图11示实施例4中流速2的谱图；
图12示实施例4中流速3的谱图；
图13示实施例5中流动相A浓度1的谱图；
图14示实施例5中流动相A浓度2的谱图；
图15示实施例5中流动相A浓度3的谱图；
图16示实施例5中流动相A浓度4的谱图；
图17示实施例6中流动相B组分1的谱图；
图18示实施例6中流动相B组分2的谱图；
图19示实施例6中流动相B组分3的谱图；
图20示实施例6中流动相B组分4的谱图；
图21示实施例6中流动相B组分5的谱图；
图22示实施例7色谱图；
图23示对比例1色谱图；
图24示对比例2色谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的技术方案：
色谱条件：
仪器：ACQUITY I-CLASS(Waters)
色谱柱：CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm
流动相A：0.03％～0.3％三氟乙酸水溶液
流动相B：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝(100～200)：(25～100)：(600～900)：(0.1～1)(体积比)
流速：0.3～1.0ml/min
柱温：25～50℃
进样量：10ul
检测波长：210nm
洗脱梯度：
Figure BDA0000955608070000061
在本发明的一些实施例中，仪器与色谱条件如下：
仪器：ACQUITY I-CLASS(Waters)
色谱柱：CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm
流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液
流动相B：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：50：800：0.6(体积比)
流速：0.5ml/min
柱温：35℃
进样量：10ul
检测波长：210nm
洗脱梯度：
Figure BDA0000955608070000062
Figure BDA0000955608070000071
实验试剂与样品：
乙腈：HPLC级，Merck
甲醇：HPLC级，Merck
三氟乙酸：HPLC级，J&K Chemical
利拉鲁肽：丹麦，诺和诺德，批号CS6G809。
溶液配制：
介质溶液：取二水合磷酸氢二钠1.42g、丙二醇14g、苯酚5.5g，加水溶解至1L，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至8.15。
供试品溶液：取利拉鲁肽适量，置20ml容量瓶中，加介质溶液溶解并定容，摇匀静止3小时，制成每1ml含利拉鲁肽约0.5mg的溶液。
本发明提供的多肽有关物质的高效液相色谱分析方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
仪器与色谱条件：
仪器：条件变动项
色谱柱：CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm
流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液
流动相B：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：50：800：0.6(体积比)
流速：0.5ml/min
柱温：35℃
进样量：10ul
检测波长：210nm
洗脱梯度见表1：
表1洗脱梯度
Figure BDA0000955608070000072
Figure BDA0000955608070000081
分别以以下两种不同型号的仪器进行试验，精密量取供试品溶液10ul注入色谱仪，记录色谱图。
仪器1：UPLC：ACQUITY I-CLASS(Waters)
仪器2：HPLC：e 2695(Waters)
试验结果见表2：
表2试验结果
仪器系统参数 仪器1 仪器2
主峰与前杂分离度 0.57 未分离
主峰与后杂分离度 2.30 未分离
理论塔板数(按主峰计) 25128 23588
拖尾因子(按主峰计) 3.84 2.61
杂质个数 17 15
实验结论：
由仪器系统参数结果可知，仪器1中主峰与前杂的分离度为0.57，仪器2未分离；仪器1中主峰与后杂的分离度为2.30，仪器2未分离；仪器1中理论塔板数较大；仪器2中拖尾因子较小；仪器1分离出的杂质个数较多。
综上所述，仪器1的仪器系统参数最好，因此，选择ACQUITY I-CLASS(Waters)作为本方法的仪器。
实施例2
仪器与色谱条件：
仪器：ACQUITY I-CLASS(Waters)
色谱柱：条件变动项
流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液
流动相B：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：50：800：0.6(体积比)
流速：0.5ml/min
柱温：35℃
进样量：10ul
检测波长：210nm
洗脱梯度见表3：
表3洗脱梯度
Figure BDA0000955608070000091
分别以以下两种不同型号的色谱柱进行试验，精密量取供试品溶液10ul注入色谱仪，记录色谱图。
色谱柱1：CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm(Waters)
色谱柱2：CORTECS C18 150mm×4.6mm，2.7μm(Waters)
色谱柱3：Peptide Map C18 150mm×4.6mm，2.7μm(Agilent)
试验结果见表4：
表4试验结果
仪器系统参数 色谱柱1 色谱柱2 色谱柱3
主峰与前杂分离度 0.57 0.43 0.39
主峰与后杂分离度 2.30 2.72 3.26
理论塔板数(按主峰计) 25128 1157 5458
拖尾因子(按主峰计) 3.84 6.96 4.18
杂质个数 17 13 10
实验结论：
由仪器系统参数结果可知，色谱柱1中主峰与前杂的分离度最大；所有色谱柱中主峰与后杂的分离度均符合要求；色谱柱1中理论塔板数最大；色谱柱1中拖尾因子最小；色谱柱1分离出的杂质个数最多。
综上所述，色谱柱1的仪器系统参数最好，因此，选择CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm(Waters)作为本方法的色谱柱。
实施例3
仪器与色谱条件：
仪器：ACQUITY I-CLASS(Waters)
色谱柱：CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm
流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液
流动相B：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：100：750：0.6(体积比)
流速：0.5ml/min
柱温：条件变动项
进样量：10ul
检测波长：210nm
洗脱梯度见表5：
表5洗脱梯度
Figure BDA0000955608070000101
分别以以下不同的柱温进行试验，精密量取供试品溶液10ul注入色谱仪，记录色谱图。
柱温1：30℃
柱温2：35℃
柱温3：40℃
柱温4：45℃
试验结果见表6：
表6试验结果
仪器系统参数 柱温1 柱温2 柱温3 柱温4
主峰与前杂分离度 0.60 0.54 0.70 0.54
主峰与后杂分离度 3.17 3.32 3.30 2.76
理论塔板数(按主峰计) 5489 5131 4397 4158
拖尾因子(按主峰计) 4.44 4.63 4.49 4.30
杂质个数 13 15 15 13
实验结论：
由仪器系统参数结果可知，柱温3中主峰与前杂的分离度最大；所有柱温中主峰与后杂的分离度均符合分离要求；柱温1和柱温2中理论塔板数较大；所有柱温中拖尾因子基本一致；柱温2和柱温3分离出的杂质个数最多。
综上所述，柱温2的仪器系统参数最好，因此，选择35℃作为本方法的柱温。
实施例4
仪器与色谱条件：
仪器：ACQUITY I-CLASS(Waters)
色谱柱：CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm
流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液
流动相B：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：50：800：0.6(体积比)
流速：条件变动项
柱温：35℃
进样量：10ul
检测波长：210nm
洗脱梯度见表7：
表7洗脱梯度
Figure BDA0000955608070000111
分别以以下不同的流速进行试验，精密量取供试品溶液10ul注入色谱仪，记录色谱图。
流速1：0.3ml/min
流速2：0.4ml/min
流速3：0.5ml/min
试验结果见表8：
表8试验结果
仪器系统参数 流速1 流速2 流速3
主峰与前杂分离度 0.60 0.65 0.67
主峰与后杂分离度 3.11 3.13 3.21
理论塔板数(按主峰计) 6352 5976 5661
拖尾因子(按主峰计) 4.85 4.81 4.83
杂质个数 13 13 13
实验结论：
由仪器系统参数结果可知，流速3中主峰与前杂的分离度最大；流速3中主峰与后杂的分离度最大；流速1中理论塔板数最大；所有流速中拖尾因子基本相同；所有流速分离出的杂质个数相同。
综上所述，流速3的仪器系统参数最好，因此，选择0.5ml/min作为本方法的流速。
实施例5
仪器与色谱条件：
仪器：ACQUITY I-CLASS(Waters)
色谱柱：CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm
流动相A：条件变动项
流动相B：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：50：800：0.6(体积比)
流速：0.5ml/min
柱温：30℃
进样量：10ul
检测波长：210nm
洗脱梯度见表9：
表9洗脱梯度
Figure BDA0000955608070000121
分别以以下不同浓度的流动相A进行试验，精密量取供试品溶液10ul注入色谱仪，记录色谱图。
浓度1：0.03％的三氟乙酸水溶液
浓度2：0.05％的三氟乙酸水溶液
浓度3：0.075％的三氟乙酸水溶液
浓度4：0.1％的三氟乙酸水溶液
试验结果见表10：
表10试验结果
仪器系统参数 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4
主峰与前杂分离度 0.51 0.51 0.50 0.34
主峰与后杂分离度 3.61 3.32 2.62 2.79
理论塔板数(按主峰计) 6683 6073 6112 6325
拖尾因子(按主峰计) 4.42 4.10 3.53 3.07
杂质个数 15 18 15 12
实验结论：
由仪器系统参数结果可知，浓度1、浓度2、浓度3的流动相A中主峰与前杂的分离度基本相同；所有浓度的流动相A中主峰与后杂的分离度均符合分离要求；所有浓度的流动相A中理论塔板数基本相同；浓度1与浓度2的流动相A中拖尾因子大于浓度3与浓度4；浓度2的流动相A中所检出的杂质个数最多。
综上所述，浓度2的流动相A的仪器系统参数最好，因此，选择0.05％的三氟乙酸水溶液作为本方法的流动相A。
实施例6
仪器与色谱条件：
仪器：ACQUITY I-CLASS(Waters)
色谱柱：CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm
流动相A：0.05％的三氟乙酸水溶液
流动相B：条件变动项
流速：0.5ml/min
柱温：35℃
进样量：10ul
检测波长：210nm
洗脱梯度见表11：
表11洗脱梯度
Figure BDA0000955608070000141
分别以以下不同组分的流动相B进行试验，精密量取供试品溶液10ul注入色谱仪，记录色谱图。
组分1：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：50：800：0.6(体积比)
组分2：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：125：725：0.6(体积比)
组分3：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：150：700：0.6(体积比)
组分4：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：200：650：0.6(体积比)
组分5：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：225：625：0.6(体积比)
试验结果见表12：
表12试验结果
仪器系统参数 组分1 组分2 组分3 组分4 组分5
主峰与前杂分离度 0.57 0.81 0.78 0.88 0.47
主峰与后杂分离度 2.30 3.13 2.87 3.38 2.33
理论塔板数(按主峰计) 25128 6734 4974 5806 4864
拖尾因子(按主峰计) 3.84 4.49 4.87 4.49 3.89
杂质个数 17 14 11 13 16
实验结论：
由仪器系统参数结果可知，组分4的流动相B中主峰与前杂的分离度最大；所有组分的流动相B中主峰与后杂的分离度均符合分离要求；组分1的流动相B中理论塔板数最大；组分1的流动相B中拖尾因子最小；组分1的流动相B中所检出的杂质个数最多。
综上所述，组分1的流动相B的仪器系统参数最好，因此，选择水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：50：800：0.6(体积比)作为本方法的流动相B。
实施例7
仪器与色谱条件：
仪器：ACQUITY I-CLASS(Waters)
色谱柱：CORTECS C18+150mm×4.6mm，2.7μm
流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液
流动相B：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：50：800：0.6(体积比)
流速：0.5ml/min
柱温：35℃
进样量：10ul
检测波长：210nm
洗脱梯度见表13：
表13洗脱梯度
Figure BDA0000955608070000151
试验结果见表14：
表14试验结果
Figure BDA0000955608070000152
实验结论：
由仪器系统参数结果可知，主峰与前后杂质之间的分离度、理论塔板数和拖尾因子均可以满足方法要求。
对比例1
仪器与色谱条件：
仪器：ACQUITY I-CLASS(Waters)
色谱柱：CORTECS C18 150mm×3.0mm，1.6μm
流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液
流动相B：水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝100：25：875：0.6(体积比)
流速：0.3ml/min
柱温：30℃
进样量：10ul
检测波长：210nm
洗脱梯度见表15：
表15洗脱梯度
Figure BDA0000955608070000161
试验结果见表16：
表16试验结果
Figure BDA0000955608070000162
实验结论：
由仪器系统参数结果可知，主峰与后杂之间未实现基线分离，理论塔板数较低，拖尾因子较大，不满足方法要求。
对比例2
仪器与色谱条件：
仪器：Agilent 1260
色谱柱：Kromasil 250mm×4.6mm，3.5μm
流动相A：100mmol/L磷酸二氢铵溶液：异丙醇＝70：30(体积比)(用85％磷酸调节pH值至3.0)
流动相B：异丙醇：水＝70：30(体积比)
流速：0.5ml/min
柱温：50℃
进样量：20ul
检测波长：215nm
洗脱梯度见表17：
表17洗脱梯度
Figure BDA0000955608070000171
试验结果见表18：
表18试验结果
Figure BDA0000955608070000172
实验结论：
由仪器系统参数结果可知，理论塔板数高，拖尾因子适合，但主峰与前、后杂之间均未实现基线分离，不满足方法要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述多肽为利拉鲁肽；色谱柱为CORTECS C18+ 150mm×4.6mm，2.7μm；
其流动相A为体积浓度为0.05%三氟乙酸水溶液；流动相B中水、乙腈、甲醇、三氟乙酸的体积比为150：50：800：0.6；
其柱温为35℃；
流速为0.5 ml/min；
洗脱梯度为：
Figure 1
。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，色谱仪为ACQUITY I-CLASS Waters。
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