CN102680602A - 多肽类提取物的特征图谱测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种多肽类提取物的特征图谱测定方法
。
目前，对于多组分生化药的质量分析和控制的手段还很落后，它的鉴别还多采用茚三酮显色反应，此反应不能区分不同来源的肽，无法准确反映现有多组分生化药的质量状况。
本发明包括
：
（
1
）
取不少于3批的多肽类提取物，加水配成适宜浓度，精密吸取
1μl
注入液相色谱仪，按照一定色谱条件进行试验，
将生成的图谱导入中药色谱特征图谱相似度评价系统，得到标准特征图谱
；（
2
）
取
对照品和供试品
加水配成适宜浓度的溶液，各精密吸取
1μl
，分别注入液相色谱仪，按一定的色谱条件测定，记录得供试品特征图谱；（
3
）将供试品特征图谱和标准特征图谱进行相似度比较。
本发明的
方法用于
多肽类提取物的特征图谱测定。
Description
技术领域：
本发明涉及一种多肽类提取物的质量控制方法，具体涉及一种多肽类提取物的特征图谱测定方法。
背景技术：
多组分生化药的主要成分包括多肽，氨基酸，核酸等物质，这些物质在紫外光区，在一定的色谱条件下，其中各个色谱峰的相对保留时间等参数具有一定的特征性。同时，目前对于多组分生化药的质量分析和控制的手段还很落后，质量标准还不完善，对于它的鉴别还多采用茚三酮显色反应，茚三酮反应是指在加热条件下，氨基酸或多肽与茚三酮反应生成紫色化合物的反应，此反应虽然具有灵敏度高的优点，但在应用时却不能够区分不同来源的肽，无法准确反映现有多组分生化药的质量状况。为此，我们将特征图谱方法应用到多组分生化药的鉴别中，从而更全面有效地对此类产品进行质量控制。
发明内容：
本发明的目的是提供一种多肽类提取物的特征图谱测定方法，该方法中供试品特征图谱与标准特征图谱相似度经计算大于0.8，本方法能够区分不同来源的多肽，对于提高此类产品的质量标准，保证药品质量，保障患者用药安全都有重要的意义。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
一种多肽类提取物的特征图谱测定方法，该方法包括如下步骤：
（1）取不少于3批的多肽类提取物，加水配成1ml含有多肽类提取物5mg浓度，精密吸取1μl注入液相色谱仪，按照指定色谱条件进行试验，将生成的图谱导入中药色谱特征图谱相似度评价系统，得到标准特征图谱；
（2）取对照品和供试品加水配成适宜浓度的溶液，各精密吸取1μl，分别注入液相色谱仪，按所述的指定色谱条件测定，记录得供试品特征图谱；
（3）通过将供试品特征图谱和标准特征图谱进行相似度比较进行测定。
所述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，所述的指定色谱条件为：高效液相色谱法测定，色谱柱选择C8，C18，ACQUITYULC HSS T3或同类型BEH柱，流动相A：1‰~1%三氟乙酸水溶液，流动相B：水、乙腈或甲醇、三氟乙酸或甲酸的比例为：400~100：100~400：0~1梯度洗脱，检测波长为210~390nm，柱温20~55℃，理论塔板数按对照品峰计算应不低于5000。
所述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，所述的梯度洗脱为：0到4.5分钟流动相A体积比为98%，流动相B的体积比为2%；4.5到7.5分钟流动相A体积比由98%线性下降到70%，流动相B体积比由2%线性上升到30%；7.5到8分钟流动相A体积比由70%线性上升到98%，流动相B体积比由30%线性下降到2%；8到10分钟维持上述比例进行洗脱，总洗脱时间为10分钟；流速为0.2~0.7ml/min。
所述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，供试品特征图谱与标准特征图谱相似度大于0.8。
有益效果：
本发明能够对不同来源的多肽，尤其是从动物骨骼，内脏，腺体提取的动物源性多肽进行区分，依据此方法可以进一步提高多组分生化药的质量标准，对多组分生化药的质量起到一定的控制作用。
附图说明：
附图1是标准特征图谱。
其中参数设置为：积分参数：峰宽4.90 阈值 4.80 积分时间1.0~5.0
相似度计算参数：自动匹配时间漂移1.0
具体实施方式：
实施例1：
一种多肽类提取物的特征图谱测定方法，该方法包括如下步骤：
（1）取不少于3批的多肽类提取物，加水配成适宜浓度，精密吸取1μl注入液相色谱仪，按照一定色谱条件进行试验，将生成的图谱导入中药色谱特征图谱相似度评价系统，得到标准特征图谱；
（2）取对照品和供试品加水配成适宜浓度的溶液，各精密吸取1μl，分别注入液相色谱仪，按一定的色谱条件测定，记录得供试品特征图谱；
（3）将供试品特征图谱和标准特征图谱进行相似度比较。
所述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，所述的一定的色谱条件为：高效液相色谱法测定，色谱柱可以选择C8，C18，ACQUITYULC HSS T3或同类型BEH柱，流动相A：1‰~1%三氟乙酸水溶液，流动相B：水、乙腈或甲醇、三氟乙酸或甲酸的比例为：400~100：100~400：0~1梯度洗脱，检测波长为210~390nm，柱温20~55℃，理论塔板数按对照品峰计算应不低于5000。
实施例2：
所述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，取不少于3批的注射用骨肽I成品，按时实施例1所述的一定的色谱条件进行测定，将生成的图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004,1.0A版），生成标准特征图谱。
取制作标准特征图谱以外的注射用骨肽I成品，按下面的试验方法试验，
对照品溶液 取黄嘌呤对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含黄嘌呤约3.6μg的溶液。
供试品溶液 取本品，加水制成每1ml含多肽类物质约5mg的溶液，作为供试品溶液。
照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）测定。
色谱条件与系统适用性试验仪器：Waters ACQUITY UPLC；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3 或同类型BEH柱）；流动相A：1‰三氟乙酸水溶液，流动相B：水：乙腈：三氟乙酸（400：100：0.5），超声15分钟；按表1进行线性梯度洗脱，流速为每分钟0.3ml；检测波长为257nm；柱温37℃；采样速率：5点/秒。理论塔板数按黄嘌呤峰计算应不低于5000。
表1 梯度洗脱表
| 时间（分钟） | 流动相A（%） | 流动相B（%） | 曲线 |
| 0～4.5 | 98 | 2 | 6 |
| 4.5～7.5 | 98～70 | 2～30 | 5 |
| 7.5～8.0 | 70～98 | 30～2 | 6 |
| 8.0～10.0 | 98 | 2 | 6 |
测定法 供试品溶液与对照品溶液进样量分别为1μl，记录色谱图，供试品色谱图应与标准特征图谱基本一致。将供试品色谱图导入中药色谱特征图谱相似度评价系统（2004,1.0B版），与标准特征图谱比较，进行相似度计算。数据见表2。
表2
| 批号 | 相似度 |
| 标准特征图谱.Scp | 1.000 |
| 090102.cdf | 0.894 |
| 090213.cdf | 0.884 |
| 090301.cdf | 0.835 |
| 090415.cdf | 0.901 |
| 090509.cdf | 0.960 |
| 0910202.cdf | 0.948 |
| 0911209.cdf | 0.979 |
| 1001213.cdf | 0.884 |
| 1002109.cdf | 0.931 |
| 1003129.cdf | 0.979 |
| 1003201.cdf | 0.971 |
| 1004113.cdf | 0.945 |
| 1004216.cdf | 0.942 |
结果表明：13批供试品检测图谱与标准特征图谱相似度均达到80%以上。
实施例3：
一种多肽类提取物的特征图谱测定方法，该方法包括：取不少于3批的多肽类提取物，加水配成适宜浓度，精密吸取1μl注入液相色谱仪，按照一定色谱条件进行试验，将生成的图谱导入中药色谱特征图谱相似度评价系统，生成标准特征图谱；再取对照品和供试品加水配成适宜浓度的溶液，各精密吸取1μl，分别注入液相色谱仪，按一定的色谱条件测定，记录得供试品特征图谱；最后将供试品特征图谱和标准特征图谱进行相似度比较。
所述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，所述的色谱条件包括：高效液相色谱法测定，色谱柱优选ACQUITYULC HSS T3或同类型BEH柱，流动相A：1%三氟乙酸水溶液，B：水：甲醇：甲酸（200：200：0.5）梯度洗脱，检测波长为210nm，柱温20℃，理论塔板数按对照品峰计算应不低于5000。
实施例4：
根据实施例1所述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，梯度洗脱的方式是：0到4.5分钟流动相A体积比为98%，流动相B的体积比为2%；4.5到7.5分钟流动相A体积比由98%线性下降到70%，流动相B体积比由2%线性上升到30%；7.5到8分钟流动相A体积比由70%线性上升到98%，流动相B体积比由30%线性下降到2%；8到10分钟维持上述比例进行洗脱，总洗脱时间为10分钟；流速为0.2~0.7ml/min。
实施例5：
上述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，所述的高效液相色谱的专属性实验
取不同原料来源的多肽产品
注射用骨肽 批号：090201 25mg
注射用复方骨肽 批号：090203 30mg
注射用鹿瓜多肽 批号：090207 8mg
注射用小牛血去蛋白提取物 批号：090202 200mg
注射用肌氨肽苷 批号：090101 7mg
取上述产品分别加水溶解并稀释制成每1ml中含多肽类物质5mg的溶液。按权利要求书所述方法测定，上述产品的多肽溶液的色谱图中各色谱峰的出峰时间、峰型、峰高等均有不同。表明该方法对不同来源的多肽有较好的鉴别意义。
实施例6：
上述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，所述的高效液相色谱的稳定性实验
取4批骨肽注射液，按技术方案中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。样品室温度20℃，分别在3个不同时间点取样检测。记录色谱图。进行了4次试验，所得图谱与标准特征图谱进行相似度计算，结果均不小于0.8，表明供试品溶液在4.5小时内是稳定的。
实施例7：
上述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，所述的高效液相色谱的重现性实验
取供试品配制成每1ml中含多肽5mg的溶液，精密量取1ul分别连续进样6次，记录色谱图。图谱一致，6针图谱重合，结果表明重复性良好。
根据以上方法学考察结果，表明该方法测定多肽类产品的特征图谱专属性，稳定性，重现性均较好，能够准确测定该产品的特征图谱。
Claims (4)
1.一种多肽类提取物的特征图谱测定方法，其特征是：该方法包括如下步骤：
（1）取不少于3批的多肽类提取物，加水配成1ml含有多肽类提取物5mg浓度，精密吸取1μl注入液相色谱仪，按照指定色谱条件进行试验，将生成的图谱导入中药色谱特征图谱相似度评价系统，得到标准特征图谱；
（2）取对照品和供试品加水配成适宜浓度的溶液，各精密吸取1μl，分别注入液相色谱仪，按所述的指定色谱条件测定，记录得供试品特征图谱；
（3）通过将供试品特征图谱和标准特征图谱进行相似度比较进行测定。
2.根据权利要求1所述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，其特征是：所述的指定色谱条件为：高效液相色谱法测定，色谱柱选择C8，C18，ACQUITYULC HSS T3或同类型BEH柱，流动相A：1‰~1%三氟乙酸水溶液，流动相B：水、乙腈或甲醇、三氟乙酸或甲酸的比例为：400~100：100~400：0~1梯度洗脱，检测波长为210~390nm，柱温20~55℃，理论塔板数按对照品峰计算应不低于5000。
3.根据权利要求2所述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，其特征是：所述的梯度洗脱为： 0到4.5分钟流动相A体积比为98%，流动相B的体积比为2%；4.5到7.5分钟流动相A体积比由98%线性下降到70%，流动相B体积比由2%线性上升到30%；7.5到8分钟流动相A体积比由70%线性上升到98%，流动相B体积比由30%线性下降到2%；8到10分钟维持上述比例进行洗脱，总洗脱时间为10分钟；流速为0.2~0.7ml/min。
4.根据权利要求1或2或3所述的多肽类提取物的特征图谱测定方法，其特征是：供试品特征图谱与标准特征图谱相似度大于0.8。
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- 2012-05-24 CN CN2012101640063A patent/CN102680602A/zh active Pending
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