CN101696238B

CN101696238B - 一种植物总蛋白提取液及其应用

Info

Publication number: CN101696238B
Application number: CN2009101933310A
Authority: CN
Inventors: 张二华; 梁炫强; 陈小平
Original assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2009-10-27
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2029-10-27
Also published as: CN101696238A

Abstract

本发明提供了一种植物总蛋白提取液及其应用。该提取液是含有重蒸酚和还原剂的水溶液；其中，重蒸酚含量为80-90％，还原剂为巯基乙醇或二硫苏糖醇。应用本提取液抽提蛋白之前需根据样品的特性先用三氯乙酸/丙酮或其它方法去除色素、油脂等杂质，残余三氯乙酸用丙酮或其它有机溶剂洗除，稍微晾干后加入本发明所提供的蛋白抽提液，混合均匀，室温静置至少10分钟即可抽提蛋白。本发明所提供的方法使用苯酚直接从植物样品干粉中抽提蛋白，可避开蛋白溶解能力的限制，使制得的蛋白样品能全面反映研究对象中蛋白的组成，可广泛用于各种植物组织样品特别是含杂质如色素、多糖、多酚较多的植物叶片、根、果实、块茎等的蛋白质组学研究。

Description

一种植物总蛋白提取液及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白质组学研究领域中的蛋白提取方法，具体涉及一种植物总蛋白提取提取液及其应用。

背景技术

现在植物蛋白的提取方法很多，最常用为TCA/丙酮沉淀法和酚提法。TCA/丙酮能有效抑制样品中各种酶的活性，但得到的蛋白经常会难以再溶解，并且会含有较多的杂质而不适于用双向电泳(2-DE)来分析。酚提法通常需要先用一种缓冲液从植物样品中溶出蛋白，再以苯酚从缓冲液中抽提蛋白，它可以通过用缓冲液反复抽提以除去酚相中杂质，得到的蛋白会比较纯净，但会受到蛋白在缓冲液中溶解能力的限制而丢失一些蛋白，从而影响到2-DE的最终结果。此外，在缓冲液中由于酶的活力无法被完全抑制，也会导致一些蛋白被修饰或降解。直接用缓冲液提取蛋白的方法更无法去除样品中水溶性杂质如色素、多糖及多酚等。这些物质会严重干扰到蛋白质的电泳，所以应用范围更加有限。植物材料中广泛存在的杂质对SDS-PAGE电泳的影响可能不大，但却会严重干扰到等电聚焦的过程，导致2-DE图像中出现严重的拖尾、横纵纹及弥散现象。进而影响到对2-DE图像的对比分析以及蛋白质的质谱鉴定，所以在制备用于2-DE的蛋白质样品时，需尽可能去除一切杂质。

发明内容

针对现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的首先是提供一种植物总蛋白提取液。

本发明的另一目的是提供上述植物总蛋白提取液的具体应用。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种植物总蛋白提取液，其特征在于：是含有重蒸酚和还原剂的水溶液；其中，，重蒸酚的重量含量为80-90％，还原剂的重量含量为0.2-3％，还原剂为巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。

优选地，所述巯基乙醇含量为1-3％(v/v)，所述二硫苏糖醇的含量为0.2-1％(w/v)。

优选的，所述植物总蛋白提取液是含2％体积的巯基乙醇和85％重量的重蒸酚的水溶液。

本发明还提供根据所述植物总蛋白提取液的应用，广泛用于各种植物组织样品特别是含杂质如色素、多糖、多酚较多的植物叶片、根、果实、块茎(根)等的蛋白质组学研究。

作为一种具体的应用，本发明还提供一种植物总蛋白提取方法，包括以下具体步骤：

(1)将植物组织在液氮中研磨粉碎，用-20℃预冷的含10-15％重量的三氯乙酸(TCA)的三氯乙酸/丙酮溶液连续洗涤至上清澄清透明，再以丙酮洗除残留三氯乙酸，晾干备用；对于油脂丰富的干果类材料(如花生、大豆、果仁等)，将材料粉碎后直接用有机溶剂(如环己烷石油醚)抽提脱脂，然后晾干有机溶剂后备用；

(2)以1-5ml/克植物鲜重的比例加入权利要求1、2或3中所述的植物总蛋白提取液，旋涡混合1分钟，室温静置；旋涡混合一般1分钟足够，室温静置优选至少10分钟；

(3)于4℃、10,000g离心至少20分钟，吸取上层酚相；下层沉淀可依步骤(2)重复抽提2-3次，合并所得酚相；

(4)将收集到的酚相与5-10倍体积-20℃预冷的含0.1M醋酸铵的甲醇混合，置于0至-20℃沉淀至少10分钟；

(5)于4℃、10,000g离心至少20分钟，弃上清，沉淀用无水甲醇洗涤3-5次，晾干或冻干即得植物蛋白干粉。

优选地，所述步骤(1)中，三氯乙酸/丙酮溶液中三氯乙酸的重量含量为10％。。

优选地，所述步骤(2)中，植物总蛋白提取液的添加比例为2-4ml/克植物鲜重；抽提时间为10分钟。

优选地，所述步骤(3)中，所述重复抽提为3次。

优选地，所述步骤(4)为，将收集到的酚相加5-6倍体积的-20℃预冷的含0.1M醋酸铵的甲醇，沉淀温度为-20℃；沉淀时间为10分钟。

优选地，所述步骤(5)中，沉淀洗涤次数为3次。

相比现有技术，本发明具有如下优点：

本发明的蛋白提取液主要由苯酚组成。直接利用苯酚从植物组织干粉中抽提蛋白，可减少因一些蛋白在缓冲液中难溶而无法提取的问题；使制备的样品更能全面反映研究对象中蛋白的组成，本发明可广泛用于各种植物组织样品特别是色素、多糖、多酚类含量较多的植物叶片、根、果实、块茎等组织的蛋白质组学研究，应用前景十分广阔。

附图说明

图1为依据本方法制备的花生叶片全蛋白样品双向电泳图谱。

图2为依据本方法制备的花生幼荚果的全蛋白样品双向电泳图谱。

图3为依据缓冲液/酚提法制备的花生叶片全蛋白样品双向电泳图谱。

图4为依据本方法制备的甘薯叶片全蛋白样品双向电泳图谱。

图5为依据TCA/丙酮沉淀法制备的甘薯叶片全蛋白样品双向电泳图谱。

具体实施方式

试剂：

尿素(电泳级)，硫尿，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，SDS，DTT，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，甘氨酸购自Amresco，(三丁基膦)TBP，2-乙烯基吡啶(2-VP)，CHAPS(3-[(3-Cholanidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)购自sigma，其它均为普通市售分析纯级试剂。

以下实施例中涉及的百分数，除标明外均为重量含量。

实施例1

(1)新鲜花生叶片2g，加液氮研磨粉碎后加入10ml冷冻的10％TCA/丙酮(含1％(v/v)巯基乙醇)洗涤，10,000g离心5min后倾去上清。重复此过程直至上清清澈透明；加入10ml-20℃预冷的丙酮洗涤两次以除去残留的TCA，然后于通风橱室温晾干；

(2)加入3ml上述蛋白提取液混合均匀，于室温静置10min抽取蛋白，10,000g离心20分钟，转出上清，重复此过程2次；

(3)合并所有酚相，加入5倍体积-20℃预冷甲醇(含0.1M醋酸铵)混合均匀，于-20℃沉淀蛋白10min，离心沉淀后用甲醇洗涤3次，室温晾干；

(4)用上样缓冲液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4％，0.01％溴酚兰)溶解蛋白，BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml，取200ul直接用于等电聚焦(IEF)。(11cm pH3-10IPG水化6h，IEF程序为：100-10,000V 5h线性升压，10,000V保持至总伏时数达到60,000V^＊H。

(5)将已聚焦好的固相预制胶条(IPG胶条)取出，沥干表面矿物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M，甘油30％，SDS 2％，溴酚兰0.01％)平衡12min。

(6)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15％)，恒压80V至蛋白完全转出IPG胶条，再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部约0.5cm处时，关掉电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝G-250染色。。

由图1可以看出花生叶片蛋白在2-DE凝胶上得到了良好的分离，背景清晰且可识别点数较多，偏酸偏碱端以及小分子量区域的蛋白都分离的很好，点形圆润且边界分明。这表明由本方法提取的蛋白很纯净，杂质很少。

实施例2

(1)新鲜花生嫩荚果2g，加液氮研磨粉碎后加入10ml冷冻的TCA/丙酮(含1％巯基乙醇)洗涤，10,000g离心5min后倾去上清。重复此过程直至上清清澈透明；加入10ml-20℃预冷的80％丙酮洗涤两次以上以除去残留的TCA，然后于通风橱室温晾干；

(2)加入3ml上述蛋白提取液混合均匀，于室温静置10min抽取蛋白，10,000g离心后转出上清，重复此过程2次；

(3)合并所有酚相，加入5倍体积甲醇(含0.1M醋酸铵)于-20℃沉淀蛋白10min，离心沉淀后用甲醇洗涤3次，冷冻干燥。

(4)用上样缓冲液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4％，0.01％溴酚兰)溶解蛋白，BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml，取200ul直接用于等电聚焦。(11cm pH3-10IPG水化至少6h，IEF程序为：100-10,000V 5h线性升压，10,000V保持5h或至总伏时数至60,000V^＊H)。

(5)将已聚焦好的IPG胶条取出，沥干表面矿物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M，甘油30％，SDS 2％，溴酚兰0.01％)平衡12min。

(6)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15％)，恒压80V至蛋白转出胶条，再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部约0.5cm时，关掉电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝G-250染色。

由图2可以看出花生嫩荚果的蛋白在2-DE凝胶上也可以很好的分离，背景清晰，蛋白点圆润且边界分明，整张凝胶只有很少的横纵条纹和拖尾。特别是凝胶中部的几个高丰度蛋白，也都能很好的分离开，这显示由本方法制备的花生荚果蛋白杂质含量很少，基本不会影响到蛋白的电泳分离。

比较实施例1

(1)新鲜花生叶片2g，加液氮研磨粉碎后加入10ml冷冻的TCA/丙酮(含1％巯基乙醇)洗涤，10,000g离心5min后倾去上清。重复此过程直至上清清澈透明；加入10ml-20℃预冷的80％丙酮洗涤两次以上以除去残留的TCA，然后于通风橱室温晾干；

(2)加入3ml蛋白提取液(尿素9M，β-ME2％(v/v)，Tris 50mM，pH7.5)混合均匀，再加入3ml TRis-HCI饱和酚(pH 7.5)混合均匀后室温静置10分钟浸提蛋白，于4℃、10,000g离心10分钟后取上层酚相与5倍体积-20℃预冷的含0.1M醋酸铵的甲醇混合，置于-20℃沉淀蛋白10分钟；在于4℃、10,000g离心10分钟，沉淀用甲醇洗涤3次，晾干；

(3)用上样缓冲液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS4％，0.01％溴酚兰)溶解蛋白，BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml，取200ul直接用于2-DE分析。(11cm pH3-10IPG水化至少6h，IEF程序为：100-10,000V 5h线性升压，10,000V保持5h或至总伏时数至60,000V^＊H。

(4)聚焦完成后的胶条采用两步平衡法进行处理，先用5ml含1％DTT的SDS平衡液(尿素6M，甘油30％，SDS2％，溴酚兰0.01％)平衡12min还原蛋白，再用含碘乙酰胺25mg/L的SDS平衡液平衡12min以烷基化蛋白。

(5)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15％)，恒压80V至蛋白转出胶条，再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部约0.5cm时，关掉电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝G-250染色。

对比图1和图3可以看出，在图3中蛋白较为集中在中间区域，且蛋白的丢失严重，蛋白点数明显比图1要少，蛋白可能在一开始就没有被提取出来或者是在平衡过程中丢失；底部的拖尾则显示蛋白在处理过程中有降解。

实施例3

(1)新鲜甘薯叶片2g，加液氮研磨粉碎后加入10ml冷冻的TCA/丙酮(含1％巯基乙醇)洗涤，10,000g离心5min后倾去上清。重复此过程直至上清清澈透明；加入10ml-20℃预冷的80％丙酮洗涤两次以上以除去残留的TCA，然后于通风橱室温晾干；

(3)合并所有酚相，加入5倍体积-20℃预冷的甲醇(含0.1M醋酸铵)于-20℃沉淀蛋白10min，离心沉淀后用甲醇洗涤3次，冷冻干燥。

(4)用上样缓冲液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4％，0.01％溴酚兰)溶解蛋白，BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml，取200ul直接用于2-DE分析。(11cm pH3-10IPG水化至少6h，IEF程序为：100-10,000V 5h线性升压，10,000V保持5h或至总伏时数至60,000V^＊H)。

(5)将已聚焦好的IPG胶条取出，沥干表面矿物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M，甘油30％，SDS 2％，0.01％溴酚兰)平衡12min。

(6)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15％)，恒压80V至蛋白转出胶条，再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部0.5cm时，关掉电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝G-250染色。。

甘薯叶片含有较多的多糖多酚类物质，通常方法很难得到合格的蛋白样品，由图4可以看出由本方法制备的蛋白样品虽然在2-DE凝胶的中部有一条明显的水平条纹，但多数蛋白还是得到了很好的分离，蛋白点尖锐清晰，特别是位于凝胶底部的小分子量蛋白也都得到了很好了分离。相比由TCA/丙酮沉淀法制备的样品(图5)可明显得出，本方法能有效去除甘薯叶片中的多数多糖多酚类物质，得到可以良好分离的蛋白样品，而用TCA/丙酮沉淀法获得的蛋白基本上无法用于2-DE分析。

比较实施例2

(2)用上样缓冲液(尿素7M，硫尿2M，CHAP 4％，0.01％溴酚兰)溶解蛋白，BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml，取200ul直接用于2-DE分析。(11cm pH3-10IPG水化至少6h，IEF程序为：100-10,000V 5h线性升压，10,000V保持5h或至总伏时数至60,000V^＊H。

(3)聚焦完成后的胶条采用两步平衡法进行处理，先用5ml含1％DTT的平衡液平衡12min还原蛋白，再用含碘乙酰胺25mg/L的平衡液平衡12min以烷基化蛋白。

(4)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15％)，恒压80V至蛋白转出胶条，再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部0.5cm时，关掉电源，取出凝胶，用胶体考马斯亮蓝(G-250)法染色。

由TCA/丙酮沉淀法制备的蛋白样品颜色发褐，溶解性很差，其2-DE图谱见图5，由于杂质含量太多，整张图像只能分辨出少量几个大点，而对多数蛋白则不能进行有效分离，背景较深，点的弥散及拖尾现象严重。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种植物总蛋白提取液，其特征在于：是含有重蒸酚和还原剂的水溶液；其中，重蒸酚的重量含量为80-90％，还原剂的重量含量为0.2-3％，还原剂为巯基乙醇或二硫苏糖醇。

2.根据权利要求1所述的植物总蛋白提取液，其特征为：所述巯基乙醇的体积含量为1-3％，所述二硫苏糖醇的重量含量为0.2-1％。

3.根据权利要求1所述的植物总蛋白提取液，其特征在于：是含2％体积的巯基乙醇和85％重量的重蒸酚的水溶液。

4.根据权利要求1、2或3所述植物总蛋白提取液的应用，其特征在于：所述植物总蛋白提取液用于提取植物蛋白。

5.一种植物总蛋白提取方法，其特征在于包括以下具体步骤：

(1)将植物组织在液氮中研磨粉碎，用-20℃预冷的含10-15％重量的三氯乙酸的三氯乙酸/丙酮溶液连续洗涤至上清澄清透明，再以丙酮洗除残留三氯乙酸，晾干备用；对于干果类材料，将材料粉碎后直接用有机溶剂抽提脱脂，然后晾干有机溶剂后备用；

(2)以1-5ml/克植物鲜重的比例加入权利要求1、2或3中所述的植物总蛋白提取液，旋涡混合，室温静置；

(3)于4℃、10,000g离心至少20分钟，吸取上层酚相；下层沉淀依步骤(2)重复抽提2-3次，合并所得酚相；

6.根据权利要求5所述的植物总蛋白提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中，三氯乙酸/丙酮溶液中三氯乙酸的重量含量为10％。

7.根据权利要求5所述的植物总蛋白提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中，植物总蛋白提取液的添加比例为2-4ml/克植物鲜重。

8.根据权利要求5所述的植物总蛋白提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述重复抽提为3次。

9.根据权利要求5所述的植物总蛋白提取方法，其特征在于：所述步骤(4)为：将收集到的酚相加5-6倍体积的-20℃预冷的含0.1M醋酸铵的甲醇，沉淀温度为-20℃；沉淀时间为10分钟。

10.根据权利要求5所述的植物总蛋白提取方法，其特征在于：所述步骤(5)中，沉淀洗涤次数为3次。