CN109596729A - 大豆种子蛋白表达谱的构建方法及大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了大豆蛋白表达谱的构建方法及大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用，属于蛋白表达谱构建技术领域。本发明采用SDS‑PAGE等技术得到大豆蛋白电泳胶片，通过对大豆蛋白电泳胶片分级，对分级蛋白分别进行胰蛋白酶酶解和液相色谱法质谱联用(LC‑MS)鉴定大豆蛋白的种类和含量。大豆蛋白根据电泳进行分级鉴定，有助于检测低含量的蛋白，避免低丰度的蛋白被高丰度蛋白覆盖，从而得到更多蛋白。通过对大豆蛋白的分级鉴定，从生物信息学的角度出发找到大豆蛋白的功能特征，并进行蛋白的分类与数据库构建，为从事大豆蛋白相关研究提供技术和数据支撑。

Description

大豆种子蛋白表达谱的构建方法及大豆蛋白表达谱在分析生 物代谢途径中的应用

技术领域

本发明属于蛋白表达谱构建技术领域，具体涉及一种大豆种子蛋白表达谱的构建方法及大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用。

背景技术

种子是种子植物的繁殖体系，对延续物种起着重要作用，在植物的生命周期中占据核心地位。大豆干种子是人类主要的食用部分，还是重要的工业原料。大豆种子蛋白含量约占种子干重的40％左右，且富含人体所需的八种必需氨基酸。大豆种子蛋白主要储存在子叶部分，对于种子萌发、胚胎发育、抗性和抗营养性有着极其重要的影响。

随着蛋白按组学技术的发展，利用SDS-PAGE电泳技术为精确鉴定出大豆种子照分子量的大小分离，获得清晰的电泳图谱，同时为后续蛋白的分级、蛋白质的鉴定提供良好的基础。

目前，蛋白质谱已经广泛应用于各类有机物的结构分析，例如1994年，Kamo等用双向电泳技术对拟南芥的叶、茎、根、种子和愈伤组织的蛋白质组进行分析，并建立了相应的数据库；Satoni等对拟南芥种子萌发过程的蛋白质组进行分析，建立的数据库为研究种子萌发过程相应的基因表达提供了新证据。模式植物拟南芥种子鉴定出种子蛋白质1300多种。Won Kyong Cho等通过对水稻细胞壁进行蛋白质谱分析，找到了与水稻细胞壁相关的496个蛋白。

蛋白质的合成是一个复杂的过程，其中蛋白质丰度是衡量基因表达的一个最终指标，在生物体生命活动中具有重要作用的蛋白质通常都为高丰度蛋白质。在大豆种子蛋白质组学领域，Mooney等已研究得到大豆成熟干种子的双向电泳图谱，但是仅鉴定了部分蛋白，尚未有大豆干种子全蛋白的鉴定研究。而大豆种子蛋白质的研究对于种子的休眠、种子萌发、胚胎发育等具有重要意义，弄清干种子中的蛋白种类以及蛋白含量对大豆种子的营养特性、加工品质等具有指导意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大豆种子蛋白表达谱的构建方法及大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用，所述方法能够鉴定到包括多种低丰度蛋白在内的大豆种子蛋白。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种大豆种子蛋白表达谱的构建方法，包括以下步骤：

1)将大豆材料、抽提缓冲液和巯基乙醇混合，振荡，离心，收集的上清液为大豆总蛋白；

2)将所述步骤1)中的大豆总蛋白进行在SDS-PAGE凝胶中进行不连续垂直电泳2～3h，得到大豆蛋白电泳凝胶；所述SDS-PAGE凝胶中浓缩胶的质量浓度为3.5％～5％，所述SDS-PAGE凝胶中分离胶的质量浓度为12％；

3)将所述步骤2)中的大豆蛋白电泳凝胶依次进行染色和脱色液脱色，得到大豆蛋白电泳胶片；

4)将所述大豆蛋白电泳胶片进行划分成19级，得到19级胶条；所述划分的标准是按照大分子量到小分子量的顺序对大豆蛋白电泳胶片依次切胶条，将明显的蛋白条带单独切作一级，将弥散的蛋白条带切为一级；

5)将得到的19级胶条采用脱色剂分别进行脱色处理，将脱色19级胶条分别进行胰蛋白酶溶液水解，得到19级肽段；

6)将所述步骤5)中19级肽段中的每一级肽段进行质谱分析，将得到的质谱数据原始文件采用Maxquant在Photozome大豆蛋白数据库中进行搜库，得到大豆种子蛋白表达谱。

优选的，所述步骤1)中大豆材料的质量和抽提缓冲液、巯基乙醇的体积比为4～6mg：500μl：8～12μl。

优选的，所述抽提缓冲液为以下两种中的任意一种：一是包含0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷，质量浓度2％十二烷基硫酸钠，5mol/L尿素和质量浓度为0.1％溴酚蓝的水溶液，pH值为8.0；二是包含0.4mol/L蔗糖，0.01mol/L NaCl，0.002mol/L MgCl₂·6H₂O，0.05mol/LHepes的水溶液，pH值为7.8。

优选的，所述步骤2)中不连续垂直电泳的电压为100V；所述SDS-PAGE凝胶的厚度为0.8～1.5mm。

优选的，所述步骤3)中染色用染色液每升包括以下含量组分：2.25g考马斯亮蓝，440ml乙醇和60ml冰醋酸；所述脱色液每升包括以下含量组分200ml甲醇和50ml冰醋酸。

优选的，所述步骤4)中胰蛋白酶溶液水解前还包括以下步骤：将所述脱色19级胶条依次经10mmol/L的二硫苏糖醇溶液、乙腈、60mmol/L碘乙酰胺溶液、100mmol/L NH₄HCO₃溶液、ACN处理，处理后的胶条再进行冻干。

优选的，所述步骤4)中所述胰蛋白酶溶液的浓度为2.5～10ng/μl；所述胰蛋白酶溶液水解的温度为37℃；所述胰蛋白酶溶液水解的时间为20h；

所述胰蛋白酶溶液水解后还包括水解产物经C18 Cartridge脱盐；

所述步骤5)中脱色剂包含90～120mmol/L NH₄HCO₃和体积浓度为28～32％的ACN溶液。

优选的，所述步骤6)中搜库的参数设定如下：enzyme为Trypsin；missed cleavagesites设为2；固定修饰为Carbamidomethyl；动态修饰设定Oxidation和Acetyl；

所述Maxquant法搜库时，鉴定标准是蛋白的匹配肽段率≥20％。

本发明提供了所述的构建方法得到的大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用。

优选的，所述生物代谢途径包括核糖体相关途径、碳代谢途径、氧化磷酸化途径、光合作用途径、叶绿素代谢途径以及大豆特有的代谢途径；

所述大豆特有的代谢途径包括绿色种皮大豆中的次级产物的生物合成途径、蛋白输出途径、黄色种皮大豆中的谷胱甘肽代谢以及精氨酸的生物合成途径。

本发明提供了一种大豆种子蛋白表达谱的构建方法，采用SDS-PAGE电泳技术得到大豆蛋白电泳胶片，通过对大豆蛋白电泳胶片分级，得到的19级胶条带分别进行胰蛋白酶水解和液相色谱法质谱联用(LC-MS)来鉴定大豆蛋白的种类和含量。大豆蛋白电泳胶片的分级有助于检测低含量的蛋白，可以避免低丰度的蛋白被高丰度蛋白覆盖，从而获得更多种子蛋白。与2-DE双向电泳挖点鉴定蛋白数相比，整个SDS-PAGE胶条全部依次切下可以避免肉眼无法识别的低含量蛋白的漏掉，可以得到更多的蛋白。通过对大豆种子蛋白的鉴定，从生物信息学的角度出发找到大豆蛋白的功能特征，并进行蛋白的分类，建立大豆种子蛋白的表达谱数据，为从事大豆蛋白的研究者提供方便。

附图说明

图1为本发明实施例大豆蛋白表达谱的构建流程图，其中图1-a为原料大豆的外观图，图1-b为脱色后的大豆蛋白电泳凝胶的电泳图，图1-c为19级蛋白胶划分的标准，图1-d为胰蛋白酶溶液水解过程，图1-e为LC-MS/MS质谱分析；

图2为大豆蛋白功能注释分类；

图3为叶片类囊体膜蛋白SDS-PAGE检测；

图4为大豆黄绿色种皮叶片类囊体膜差异蛋白的生物学途径水平GO注释；

图5为大豆黄绿色种皮叶片类囊体膜差异蛋白的细胞组分水平GO注释；

图6为大豆黄绿色种皮叶片类囊体膜差异蛋白的分子功能水平GO注释；

图7为大豆黄绿色种皮叶片类囊体膜差异蛋白的KEGG功能分析；

图8为BN-PAGE电泳凝胶图。

具体实施方式

本发明提供了一种大豆种子蛋白表达谱的构建方法，包括以下步骤：

1)将大豆材料、抽提缓冲液和巯基乙醇混合，振荡，离心，收集的上清液为大豆总蛋白；

2)将所述步骤1)中的大豆总蛋白进行在SDS-PAGE凝胶中进行不连续垂直电泳2～3h，得到大豆蛋白电泳凝胶；所述SDS-PAGE凝胶中浓缩胶的质量浓度为3.5％～5％，所述SDS-PAGE凝胶中分离胶的质量浓度为12％；

3)将所述步骤2)中的大豆蛋白电泳凝胶依次进行染色和脱色液脱色，得到大豆蛋白电泳胶片；

4)将所述大豆蛋白电泳胶片进行划分成19级，得到19级胶条；所述划分的标准是按照大分子量到小分子量的顺序对大豆蛋白电泳胶片依次切胶条，将明显的蛋白条带单独切作一级，将弥散的蛋白条带切为一级；

5)将得到的19级胶条采用脱色剂分别进行脱色处理，将脱色19级胶条分别进行胰蛋白酶溶液水解，得到19级肽段；

6)将所述步骤5)中19级肽段中的每一级肽段进行质谱分析，将得到的质谱数据原始文件采用Maxquant在Photozome大豆蛋白数据库中进行搜库，得到大豆种子蛋白表达谱。

本发明将大豆材料、抽提缓冲液和巯基乙醇混合，振荡，离心，收集的上清液为大豆总蛋白。

在本发明中，所述大豆材料的制备方法包括以下步骤：将大豆成熟种子自然风干，研磨大豆种脐背面子叶部分，得到大豆材料。所述自然风干的程度优选为成熟种子的含水量优选为10～14％，更优选为12％。所述大豆材料的粒径优选为100～250目，更优选为200目。本发明对所述大豆品种没有特殊限制，采用本领域所熟知的大豆品种即可。在本发明实施例中，所述大豆品种为中品661。

在本发明中，所述大豆材料的质量、抽提缓冲液的体积、巯基乙醇的体积比优选为4～6mg：500μl：8～12μl，更优选为5mg：500μl：10μl。所述抽提缓冲液优选为为以下两种中的任意一种：一是包含0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷，质量浓度2％十二烷基硫酸钠，5mol/L尿素和质量浓度为0.1％溴酚蓝的水溶液，pH值为8.0；二是包含0.4mol/L蔗糖，0.01mol/LNaCl，0.002mol/L MgCl₂·6H₂O，0.05mol/L Hepes的水溶液，pH值为7.8。在本发明中，所述巯基乙醇在大豆蛋白提取的过程能够保护含有巯基的蛋白质不被氧化。所述抽提缓冲液在大豆蛋白提取的过程中能够抽提除去大豆中油脂成分。

本发明对所述混合、振荡的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的混合、振荡的方案即可。所述振荡的时间优选为5～10min，更优选为8min。在本发明中，所述离心的转速优选为10000～14000r/min，更优选为12000r/min。所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。

得到大豆总蛋白后，本发明将所述大豆总蛋白进行在SDS-PAGE凝胶中进行不连续垂直电泳2～3h，得到大豆蛋白电泳凝胶；SDS-PAGE凝胶中浓缩胶的质量浓度为3.5％～5％，SDS-PAGE板中分离胶的质量浓度为12％。

在本发明中，所述SDS-PAGE凝胶的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的凝胶制备方法即可。所述SDS-PAGE凝胶的厚度优选为0.8～1.5mm，更优选为1mm。所述不连续垂直电泳的电压优选为100V。所述不连续垂直电泳的时间优选为2.5h。本发明对所述不连续垂直电泳的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的不连续垂直电泳的方案即可。

得到大豆蛋白电泳凝后，本发明将所述大豆蛋白电泳凝胶依次进行染色和脱色液脱色，得到大豆蛋白电泳胶片。

本发明对所述染色和脱色的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的染色和脱色方法即可。所述染色用染色液优选包括以下含量组分：2.25g考马斯亮蓝，440ml乙醇，60ml冰醋酸和超纯水补足1L。染色的时间优选为10～20min，更优选为15min。

所述脱色液包括以下含量组分：200ml甲醇，50ml冰醋酸，超纯水补足1L。脱色后的大豆蛋白电泳凝胶的电泳图如图1-b所示。脱色的时间优选为3～10h，更优选为8h。

得到大豆蛋白电泳胶片后，本发明将所述大豆蛋白电泳胶片划分成19级，得到19级胶条；所述划分的标准是按照大分子量到小分子量的顺序对大豆蛋白电泳胶片依次切胶条，将明显的蛋白条带单独切作一级，将弥散的蛋白条带切为一级，具体划分的位置如图1-c所示。

SDS-PAGE蛋白胶分级鉴定与蛋白液体酶切相比的优点是：分级处理可以鉴定出更多的低丰度蛋白；结合SDS-PAGE电泳图谱切胶鉴定蛋白，可以根据分子量进行筛选，排除鉴定不精确的蛋白；与2-DE双向电泳挖点鉴定相比的优点是，避免了肉眼鉴定不到的蛋白点遗漏，可以得到更多的蛋白。

将得到的19级胶条采用脱色剂分别进行脱色处理，将脱色19级胶条分别进行胰蛋白酶溶液水解，得到19级肽段。

在本发明中，对所述19级胶条脱色处理的方法优选为：分别将每级胶条经180～220μl脱色剂清洗至透明，去除上清液，冻干。所述脱色剂优选为包含以下含量组分：100mmol/L NH₄HCO₃和体积浓度为30％ACN的水溶液。所述冻干的温度优选为-20～-40℃，更优选-30℃。所述冻干的时间优选为3～10h，更优选为5h。

在本发明中，所述胰蛋白酶溶液水解前优选还包括以下步骤：将脱色后的胶条依次经10mmol/LD的二硫苏糖醇溶液、乙腈、60mmol/L碘乙酰胺溶液、100mmol/L NH₄HCO₃溶液、ACN处理，处理后的胶条再进行冻干。所述二硫苏糖醇溶液处理的时间优选为1.5h；所述二硫苏糖醇溶液处理的温度优选为37℃。所述乙腈处理的时间优选为5min，所述乙腈处理的温度优选为10～40℃，更优选为25℃。所述碘乙酰胺溶液处理的时间优选为20min；所述碘乙酰胺溶液处理的温度优选为0～10℃，更优选为4℃；所述碘乙酰胺溶液处理时优选在避光条件下进行。所述NH₄HCO₃溶液处理的时间优选为15min；所述NH₄HCO₃溶液处理的温度优选为23～28℃，更优选为25℃。所述ACN处理的时间优选为4～8min，更优选为5min。所述冻干的方案同上述冻干方案。

在本发明中，所述胰蛋白酶溶液的浓度优选为2.5～10ng/μl，更优选为4～8ng/μl，更优选为6ng/μl。所述胰蛋白酶溶液水解的温度优选为37℃。所述胰蛋白酶溶液水解的时间优选为18～22h，更优选为20h。胰蛋白酶的体积相对于胶条的质量添加的体积为40～100μl，更优选为60μl。

在本发明中，所述胰蛋白酶溶液水解后优选还包括：将酶解得到的酶解液经C18Cartridge脱盐，得到19级肽段。本发明对水解产物进行所述C18 Cartridge脱盐处理的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的脱盐方案即可。

所述脱盐后优选将得到的脱盐酶解液进行OD₂₈₀肽段定量。

得到19级肽段后，本发明将所述19级肽段中的每一级肽段进行质谱分析，得到质谱数据原始文件。在本发明中，所述质谱分析前优选将酶解液的浓度进行调整。由于是1-DE电泳胶内酶解，酶解液浓度很低，所以未检测浓度。

质谱分析优选委托上海中科新生命公司进行。LC-MS质谱分析取酶解后产物进行LC-MS/MS分析，每个样品进样一次。采用纳升级流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡。样品上样到色谱柱Thermo scientific EASY column(2cm*100μm 5μm-C18)，再经分析柱Thermoscientific EASY column(75μm*100mm 3μm-C18)分离，流速为300nL/min。相关液相梯度如下：0min-50min，B液线性梯度从0％-35％；50min-55min，B液线性梯度从35％-100％；55min-60min，B液维持在100％。肽段经色谱分离后使用Q-Exactive质谱仪(Thermo Scientific)进行质谱分析。分析时长：60min；检测方式：正离子；母离子扫描范围：300-1800m/z；一级质谱分辨率：70,000atm/z200；AGC target：3e6；一级Maximum IT：50ms；多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2scan)，二级质谱分辨率：17,500atm/z 200，Microscans：1，Isolationwindow：2m/z，二级Maximum IT：60ms，MS2 Activation Type：HCD，Normalized collisionenergy：27eV，Dynamic exclusion：60.0s，Underfillratio：0.1％。

质谱分析后，本发明将得到的质谱数据原始文件采用Maxquant(MQ)法在Photozome大豆蛋白数据库中进行搜库鉴定到不同数量的大豆蛋白。

在本发明中，所述Proteome Discoverver软件采用Mascot 2.2进行数据库检索。蛋白数据库为Gmax_275_Wm82.a2.v1.protein.fasta(下载链接http://www.soybase.org)。所述搜库的参数设定优选如下：enzyme为Trypsin；missed cleavagesites设为2；固定修饰为Carbamidomethyl(C)；动态修饰设定Oxidation(M)和Acetyl(ProteinN-term)。

在本发明中，所述Maxquant法搜库时，鉴定标准优选是蛋白的匹配肽段率≥20％。为了避免漏掉每个条带上的重要蛋白，所以设定的分子量范围大于实际分子量。利用MQ法进行搜库在Photozome_Gmax_Wm82中鉴定到3399个蛋白。

本发明对3399个大豆蛋白进行筛选分类。根据GO注释结果按生物进程、分子结构、分子功能将其分为30种主要类型(图2)。类型包括：生殖、多生物体假体、生殖过程、信号传递、多细胞组织过程、发育过程、细胞成分组织或生物发生、生物调节、定位、对刺激的反应、单生物体假体、细胞过程、代谢过程、膜部分、细胞器部分、膜大分子复合物、细胞外区域、细胞、细胞、细胞部分、核酸结合转录因子活性、营养储备活性、电子载体活性、抗氧化活性、酶调节活性、转运活性、结构分子活性、结合活性、催化活性。

一种蛋白可能有多种功能，参与多个生命活动。根据GO注释发现：在生物学过程分类中，细胞过程、代谢过程、单个组织过程以及刺激反应的蛋白功能比较多，而在分子功能和细胞组成分类中，细胞、细胞器以及催化功能的蛋白较多。

鉴定到大豆蛋白后，本发明将每一级胶片得到的蛋白数据进行统计，发现几乎每一条带都有几百种蛋白，为了得到每一条带更精确的蛋白数据，根据每一条带的位置估计出在这一条带中蛋白的分子量，将不在此分子量范围内的蛋白过滤掉。蛋白过滤之后还剩下1799种蛋白，为了研究每一条带的主要蛋白，选取每条带中丰度值排名最高的前十个蛋白的含量进行统计。结果发现排名前十的蛋白丰度值占据了过滤后蛋白总丰度值的68％以上，说明每条带高丰度值前10蛋白能代表这个条带的主要蛋白。

将3399蛋白按照丰度值排列，找到排名前50的高丰度蛋白。发现这50个高丰度蛋白中已知蛋白有30个，未知蛋白20个。已知蛋白的主要功能是种子贮藏蛋白、种子成熟蛋白、酶蛋白和脂质蛋白等。未知蛋白即尚未报道的未研究过的蛋白，其功能未知。

本发明提供了所述的构建方法得到的大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用。

在本发明中，所述生物代谢途径包括核糖体相关途径、碳代谢途径、氧化磷酸化途径、光合作用途径、叶绿素代谢途径以及大豆特有的代谢途径；所述大豆特有的代谢途径包括绿色种皮大豆中的次级产物的生物合成途径、蛋白输出途径、黄色种皮大豆中的谷胱甘肽代谢以及精氨酸的生物合成途径。

下面结合实施例对本发明提供的一种大豆种子蛋白表达谱的构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1材料与方法

1.1实验材料

本研究所用材料为中品661，种植于北京顺义区，于2016年10月收获种子用作实验。

1.2方法

1.2.1中品661大豆种子的总蛋白的提取

将中品661成熟种子自然风干后(种子含水量约为12％)，用雕刻刀磨取大豆种脐背面子叶部分得到大豆粉，称取5mg大豆粉，加入500μl抽提缓冲液(0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷Tris,2％十二烷基硫酸钠SDS,5mol/L尿素Urea，0.1％溴酚蓝Bromophenol blue，pH8.0)，加入10μl巯基乙醇，在放振荡器振荡5分钟，12000r/min离心10分钟，提取上清液即为总蛋白。

1.2.2SDS-PAGE电泳

采用不连续垂直电泳仪电泳，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，凝胶厚度1mm，100V恒压电泳。电泳2～3h，当溴酚蓝迁移至凝胶底部时终止电泳，凝胶用考马斯亮蓝R250染色液(2.25g考马斯亮蓝R250，440ml乙醇，60ml冰醋酸，超纯水定容1L)染色3h，最后用脱色液(200ml甲醇，50ml冰醋酸，超纯水定容1L)脱色，直至背景色透明。

1.2.3蛋白分级处理

提取总蛋白后，取5μl样品进行SDS-PAGE电泳，获得大豆蛋白电泳胶片后，用刀片将整块蛋白胶划分为19级，划分标准如图1-c，主要依据是明显的已知的蛋白条带单独切作一带，不明显的未知的蛋白条带切为一条带，每条带之间依次挨个切，这样既避免了低丰度蛋白的遗漏，也能将质谱得到的蛋白按照分子量进行筛选。蛋白分级处理完成后，将每个胶条分别进行胶内酶解。

1.2.4胶内酶解

样品加入200μl脱色剂(100mM NH₄HCO₃+30％ACN)，清洗至透明，去除上清，冻干。加入10mM DTT(二硫苏糖醇)，37℃孵化1.5h。去上清，加入100％ACN(乙腈)，5min后吸去。加入60mmol/L IAA(碘乙酰胺)，避光反应20min。去上清，加入100mmol/L NH₄HCO₃，室温15min。去上清，加入100％ACN，5min后吸去，冻干加入5ng/μl Trypsin溶液，在37℃条件下反应过夜，20h左右。经C18 Cartridge(Sigma)脱盐后，进行OD₂₈₀肽段定量。

1.2.5LC-MS/MS质谱分析以及数据库搜索

质谱分析和数据库搜索主要是由中科新生命公司进行，质谱数据原始文件(rawfile)通过Proteome Discoverver软件采用Mascot 2.2进行数据库检索，蛋白数据库为Gmax_275_Wm82.a2.v1.protein.fasta(下载链接http://www.soybase.org)。其中搜库参数设定如下：enzyme为Trypsin；missed cleavage sites设为2；固定修饰为Carbamidomethyl(C)；动态修饰设定Oxidation(M)和Acetyl(ProteinN-term)。数据库检索鉴定到的蛋白质必须通过设定的过滤参数匹配肽段率≥20％。将肽段进行数据库搜索，对匹配到的蛋白质进行分析。

2结果与分析

2.1总蛋白的鉴定

本研究利用了Maxquant(MQ法)进行数据库搜索，鉴定标准是蛋白的匹配肽段率≥20％。数据库为Photozome大豆蛋白数据库(Photozome_Gmax_Wm82)。对蛋白数据进行统计发现，利用MQ法进行搜库，在Photozome_Gmax_Wm82中鉴定到3399个蛋白。

选用MQ法鉴定Photozome_Gmax_Wm82中鉴定到3399个蛋白19条带总共鉴定到3399个蛋白，对这些蛋白进行筛选分类。根据GO注释结果按生物进程、分子结构、分子功能将其分为30种主要类型(图2)。一种蛋白可能有多种功能，参与多个生命活动。根据GO注释发现：在生物学过程分类中，细胞过程、代谢过程、单个组织过程以及刺激反应的蛋白功能比较多，而在分子功能和细胞组成分类中，细胞、细胞器以及催化功能的蛋白较多。

2.2蛋白分级鉴定

分级进行蛋白质谱后对每一级进行了统计分析，统计结果发现：每一个条带都鉴定出来几百种蛋白，但是按照分子量大小设置一个阈值过滤后得到更加准确的蛋白，排除了很多不在条带的分子量范围内的蛋白。为了避免漏掉每个条带上的重要蛋白，所以设定的分子量范围大于实际分子量(见表2)。

将每一级的蛋白数据进行统计，发现几乎每一条带都有几百种蛋白，为了得到每一条带更精确的蛋白数据，根据每一条带的位置估计出在这一条带中蛋白的分子量，将不在此分子量范围内的蛋白过滤掉。蛋白过滤之后还剩余1799种蛋白，为了研究每一条带的主要蛋白，选取每条带中丰度值排名最高的前十个蛋白进行分析。分析发现排名前十的蛋白丰度值占据了过滤后蛋白总丰度值的68％以上，说明每条带高丰度值前10蛋白能代表这个条带的主要蛋白(见表2)。

表2各个条带的蛋白数统计

2.3高丰度蛋白鉴定

将3399蛋白按照丰度值排列，找到排名前50的高丰度蛋白。发现这50个高丰度蛋白中已知蛋白有30个，未知蛋白20个。已知蛋白的主要功能是种子贮藏蛋白、种子成熟蛋白、酶蛋白和脂质蛋白等。

表3排名前50的高丰度蛋白

2.4低丰度蛋白鉴定

按照丰度值排列，对丰度值最低的50个蛋白进行统计发现，这些蛋白的功能主要是酶蛋白(10个)和调节类蛋白(11个)，这些低丰度蛋白中没有发现贮藏蛋白。根据GO注释对其进行分类，低丰度蛋白主要生物进程是参与新陈代谢过程和细胞过程，细胞组成类最多的是细胞和细胞组成部分，分子功能类最多的是催化功能和结合蛋白。

表4丰度值最低的50个蛋白的功能注释结果

本方法鉴定出的蛋白最高丰度值为8.9E+10，丰度值在1E+7以上的蛋白有1767个，剩下的低丰度蛋白为1632个，其中丰度低于1E+6的蛋白有457个，丰度值为0(定性检测到此蛋白，定量时由于丰度低，图谱无法识别，即默认为丰度值为0)的蛋白有207个。本方法提取的是大豆种子的全蛋白，不管丰度大小都能提取出来，至于低丰度蛋白的鉴定则是通过分级处理来实现的，本研究鉴定出的蛋白远远高于前人鉴定到的蛋白数量。

实施例2

对大豆种皮色近等基因系3388(黄色)和3385(绿色)幼嫩叶片进行类囊体膜蛋白的提取(每1g大豆叶片加入约5ml预冷的提取缓冲液，提取缓冲液为0.4mol/L蔗糖，0.01mol/L NaCl，0.002mol/L MgCl₂·6H₂O，0.05mol/L Hepes，pH＝7.8)及液体酶切，进而进行分段质谱分析。按照分子量将蛋白共分为3段：分子量小于25KDa，分子量在25KDa和45KDa之间(见图3)，分子量大于45KDa，排除分子量不在选定区域大小的蛋白，经鉴定绿色种皮3385中共检测到2170种蛋白，黄色种皮3388中共检测到1730种蛋白，其中绿色种皮中特异性表达的蛋白1140种，黄色种皮中特异性表达的蛋白700种；共检测到相同蛋白1030种，在这1030种蛋白中含量差异大于3倍的蛋白68种，绿色种皮中含量高的23种，黄色种皮中含量高的45种。

将差异蛋白利用DAVID软件进行功能注释分析，将差异蛋白主要分为3类：生物学过程(Biological Process，BP)、细胞组分(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)。绿色种皮大豆的叶片类囊体膜蛋白参与生物学途径的占55.2％，参与细胞组分的占60.5％，参与分子功能的占68.8％；而黄色种皮大豆的叶片类囊体膜蛋白参与生物学途径的占55.6％，参与细胞组分的占61.2％，参与分子功能的占63.5％。

经生物学过程分析，结果如图4所示。图4为大豆黄绿色种皮叶片类囊体膜差异蛋白的生物学途径水平GO注释。黄绿色种皮大豆类囊体膜蛋白都参与大量的翻译、蛋白折叠、信号传导等过程。同时它们都在光合作用的过程中发挥功能，但绿色种皮大豆类囊体膜中特有的是与光合系统Ⅰ捕光色素、电子传递及叶绿素生物合成相关的蛋白，黄色种皮大豆类囊体膜中特有的是与光合系统Ⅱ稳定性相关的蛋白。

经过细胞组分分析，结果如图5所示。图5为大豆黄绿色种皮叶片类囊体膜差异蛋白的细胞组分水平GO注释。膜组分、大分子复合物以及各系统亚基所占比例最大，说明两种材料中差异蛋白膜组分仍是不可或缺的重要组成成分。它们同时参与光合系统Ⅰ和光合系统Ⅱ的组成，但是参与光合系统Ⅰ反应中心的组成在绿色种皮大豆中特有，叶绿体基质的组成在黄色种皮的大豆中特有。

经分子功能分析，结果见图6所示。图6为大豆黄绿色种皮叶片类囊体膜差异蛋白的分子功能水平GO注释。黄绿色种皮大豆参与核糖体的结构组成功能所占的比例最大，核糖体是负责转录翻译的，这一结果与生物学过程中参与翻译途径为主相吻合。同时差异蛋白的分子功能集中体现在结合GTP、结合NAD蛋白及结合叶绿素。其中黄色种皮大豆类囊体膜蛋白中有电子载体活性、结合铁离子等特有的分子功能，绿色种皮大豆类囊体膜蛋白中有结合色素、结合FMN特有的途径。

经过KEGG通路分析，结果见图7。图7为大豆黄绿色种皮叶片类囊体膜差异蛋白的KEGG功能分析结果。黄绿色种皮大豆类囊体膜蛋白参与多种KEGG代谢途径，主要包括代谢途径、核糖体相关途径、碳代谢途径、氧化磷酸化途径、光合作用途径、叶绿素代谢途径以及一些特有的途径，例如绿色种皮大豆中的次级产物的生物合成途径、蛋白输出途径等、黄色种皮大豆中的谷胱甘肽代谢以及精氨酸的生物合成途径，这些途径的差异可能造成大豆种皮颜色的差异，但有待于进一步验证。

实施例3

大豆材料为JACK，黄色种皮3388和绿色种皮3385。分别取1g大豆叶片，加入约5ml预冷的提取缓冲液(0.4mol/L蔗糖，0.01mol/L NaCl，0.002mol/L MgCl₂·6H₂O，0.05mol/LHepes，pH＝7.8)，在冰浴中研磨至匀浆，用4层擦镜纸过滤，5000g 4℃离心10min，类囊体膜用洗涤缓冲液(0.33M Sorbitol，0.05M Bis-Tris，pH＝7.0)洗涤数次至无杂质，然后用适量的悬浮缓冲液(0.025M Bis-Tris，20％甘油，pH＝7.0)悬浮沉淀，样品于-80℃保存备用，注意提取过程要一直保持低温，防止蛋白发生降解。样品进行蓝绿温和凝胶电泳。BN-PAGE胶采用的是3.5％～12％的浓度梯度，预先配制好3.5％和12％的胶，放在冰上防止胶凝。

表5 BN-PAGE中不同浓度胶的配制

将3.5％和12％的胶分别加到两个胶槽中，浓度高的分离胶靠近混合液流出的管子，调整好输出阀门的流速，首先排除软管中的气泡，然后将凝胶溶液注入事先安装好的玻璃板中间；打开阀门，12％的胶先流出，之后3.5％的胶会慢慢渗透到12％的胶中，两种浓度的胶在搅拌子的作用下不断混匀，由此形成了一个从底部到顶部由高浓度到低浓度的梯度；胶制好后用水封面，置于4℃过夜，慢慢形成梯度胶。

样品处理时，用含1％DM的上述悬浮缓冲液按照1:1的体积加入类囊体膜悬浮液中增溶，在涡旋仪上轻轻涡旋。置于冰上15min，期间用手弹样品数次以增加增溶效果，18000g离心15min。将上清转移到新的离心管中，加入1/10体积的上样缓冲液，轻轻振荡混匀。电泳槽中加入阴极缓冲液Ⅰ没过胶孔，每个泳道按照10μg类囊体膜蛋白上样，电泳槽外倒入1×阳极缓冲液，电泳前事先接通冷凝水，保证整个电泳都在4℃进行。初始电压50V，以后每隔20min电压增加25V，一直加到150V，当前端的样品指示剂跑至分离胶的1/2至2/3处时，电泳槽内的缓冲液更换为不含考马斯亮蓝G 250的阴极缓冲液Ⅱ，继续电泳至样品指示剂跑到胶的底部，停止电泳。

用刀片切取BN-PAGE电泳凝胶中如图8中方框内的蛋白，将每个样本的胶条分别放入离心管进行蛋白酶解。经LC-MS/MS质谱分析，数据原始文件(raw file)通过ProteomeDiscoverver1.4软件采用Mascot2.2进行数据库检索，蛋白数据库为uniprot。其中搜库参数设定如下：enzyme为Trypsin；missed cleavage sites设为2；固定修饰为Carbamidomethyl(C)；动态修饰设定Oxidation(M)和Acetyl(Protein N-term)。数据库检索鉴定到的蛋白质必须通过设定的过滤参数匹配肽段率≥20％。将肽段进行数据库搜索，对匹配到的蛋白质进行分析。

利用了Maxquant(MQ法)进行数据库搜索，使用MASCOT等质谱匹配软件对LCMSMS数据进行分析，鉴定标准是蛋白的匹配肽段率≥20％。数据库为Uniprot大豆蛋白数据库。对蛋白数据进行统计发现，在Uniprot中受体JACK鉴定到148个蛋白，3385大豆鉴定到224个蛋白，P_35S:GmSG转基因大豆鉴定到336个蛋白，这些蛋白都定位于叶绿体中，其中鉴定到3者相同蛋白114个，3388和3385相同蛋白177个。与JACK比，3385和3388中特异蛋白有63个，其中有功能注释的有22个；JACK中特异蛋白有36个，有功能注释的有15个，它们分别参与ATP合成酶、细胞色素及光合系统反应中心的相关过程。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种大豆蛋白表达谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将大豆材料、抽提缓冲液和巯基乙醇混合，振荡，离心，收集的上清液为大豆总蛋白；

2)将所述步骤1)中的大豆总蛋白在SDS-PAGE凝胶中进行不连续垂直电泳2～3h，得到大豆蛋白电泳凝胶；所述SDS-PAGE凝胶中浓缩胶的质量浓度为3.5％～5％，SDS-PAGE凝胶中分离胶的质量浓度为12％；

3)将所述步骤2)中的大豆蛋白电泳凝胶依次进行染色和脱色液脱色，得到大豆蛋白电泳胶片；

4)将所述大豆蛋白电泳胶片进行划分成19级，得到19级胶条；所述划分的标准是按照大分子量到小分子量的顺序对大豆蛋白电泳胶片依次切胶条，将明显的蛋白条带单独切作一级，将弥散的蛋白条带切为一级；

5)将得到的19级胶条采用脱色剂分别进行脱色处理，将脱色19级胶条分别进行胰蛋白酶溶液水解，得到19级肽段；

6)将所述步骤5)中19级肽段中的每一级肽段进行质谱分析，将得到的质谱数据原始文件采用Maxquant法在Photozome大豆蛋白数据库中进行搜库，得到大豆种子蛋白表达谱。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中大豆材料的质量和抽提缓冲液、巯基乙醇的体积比为4～6mg：500μl：8～12μl。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述抽提缓冲液为以下两种中的任意一种：一是包含0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷，质量浓度2％十二烷基硫酸钠，5mol/L尿素和质量浓度为0.1％溴酚蓝的水溶液，pH值为8.0；二是包含0.4mol/L蔗糖，0.01mol/LNaCl，0.002mol/L MgCl₂·6H₂O，0.05mol/LHepes的水溶液，pH值为7.8。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中不连续垂直电泳的电压为100V；所述SDS-PAGE凝胶的厚度为1～1.5mm。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中染色用染色液每升包括以下组分：2.25g考马斯亮蓝，440ml乙醇和60ml冰醋酸；

所述脱色液每升包括以下组分：200ml甲醇和50ml冰醋酸。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中水解前还包括以下步骤：将所述脱色19级胶条分别依次经10mmol/L的二硫苏糖醇溶液、乙腈、60mmol/L碘乙酰胺溶液、100mmol/LNH₄HCO₃溶液和ACN处理，处理后的胶条再冻干。

7.根据权利要求1或6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中所述胰蛋白酶溶液的浓度为2.5～10ng/μl；

所述水解的温度为37℃；所述水解的时间为20h；

所述水解后还包括将得到的水解产物经C18Cartridge脱盐；

所述步骤5)中脱色剂包含90～120mmol/L NH₄HCO₃和体积浓度为28～32％的ACN溶液。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤6)中搜库的参数设定如下：enzyme为Trypsin；missed cleavage sites设为2；固定修饰为Carbamidomethyl；动态修饰设定Oxidation和Acetyl；

所述Maxquant法搜库时，鉴定标准是蛋白的匹配肽段率≥20％。

9.权利要求1～8任意一项所述的构建方法得到的大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述生物代谢途径包括核糖体相关途径、碳代谢途径、氧化磷酸化途径、光合作用途径、叶绿素代谢途径以及大豆特有的代谢途径；

所述大豆特有的代谢途径包括绿色种皮大豆中的次级产物的生物合成途径、蛋白输出途径、黄色种皮大豆中的谷胱甘肽代谢以及精氨酸的生物合成途径。