CN103233060A

CN103233060A - 一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法

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Publication number: CN103233060A
Application number: CN2013101500611A
Authority: CN
Inventors: 王春玲; 赵国忠; 王聪; 侯丽华
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2013-04-26
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2033-04-26
Also published as: CN103233060B

Abstract

本发明公开了一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，包括以下步骤：首先进行发酵过程中米曲霉菌体蛋白的二维电泳；质谱鉴定分析蛋白；构建了米曲霉的蛋白表达图谱。本发明的技术方案建立了米曲霉菌株的蛋白质表达图谱，从蛋白质水平提出了分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，提供了可能导致米曲霉发酵风味物质产生不同的原因。

Description

一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，所述真菌为米曲霉。

背景技术

米曲霉可以产复合酶，如：蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等，不产毒素，是食品工业中安全的工业菌株。这些复合酶分解后的原料易被人体吸收，营养价值大大提高，多种发酵食品中都用米曲霉来分解原料。

蛋白质组学研究是基于基因组测序技术和质谱鉴定技术而出现的一种研究方法，它的研究包括了一个细胞或一个微生物的全套蛋白质，也是后基因组计划中一个很重要的内容。研究蛋白质组学最经典的方法是先通过双向凝胶电泳分离蛋白再运用质谱鉴定确定蛋白序列。米曲霉蛋白质组学的研究相对较少，早些时候有研究者就通过二维电泳凝胶分离技术对米曲霉细胞内部蛋白进行了分离，但是后期鉴定蛋白功能的工作没有进行下去。直到2006年，日本的研究工作者利用蛋白质组学的方法探讨了米曲霉在固体和液体培养条件下胞外蛋白酶的分泌情况，通过质谱鉴定总共确定了29个蛋白，开辟了运用蛋白质组学研究蛋白分泌的先河。目前，还没有采用蛋白质组学的方法分析米曲霉发酵过程中蛋白表达的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，本发明为了探寻功能基因指导的蛋白表达分泌情况，通过绘制蛋白质组学图谱，分析其发酵过程中蛋白表达，寻找对其发酵起重要作用的蛋白及其调控基因，本发明以米曲霉为例

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，步骤如下：

⑴等电聚焦：收集发酵过程中菌丝体，PBS缓冲液洗涤3次，加入液氮研磨至粉末状，加入适量裂解液和50μg/ml DNase I、50 μg/ml RNase，混匀，冰浴15分钟，冰浴超声2分钟，14000 rpm，4度离心30分钟取上清，从冰箱中取出美国Bio-Rad公司的pH 4-7的IPG预制胶条，用溶胀缓冲液将胶条泡胀12小时；将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，并用上样缓冲液稀释至170μl，对好正、负极，盖上盖子，MultiphorII电泳系统进行等电聚焦；

⑵平衡：聚焦结束的胶条先将胶条放入平衡缓冲液I水平振荡15分钟，再将胶条转入平衡缓冲液II水平振荡15分钟；

⑶第二向SDS-PAGE电泳：第二次平衡结束后，将胶条从样品盘中移出，放到已配好的12%的SDS-PAGE凝胶上端，并将marker放到凝胶的一端，再用0.5%的琼脂糖将胶条和marker封严，不能产生气泡，并将胶板固定于电泳槽内，加入电泳缓冲液，接通电源，15mA/胶恒流电泳15分钟，然后250v恒压电泳，待溴酚蓝达到底部边缘时即可停止电泳，电泳结束后，撬开两层玻璃，取出凝胶，将凝胶放入装有染色液的水平盘内振荡过夜进行染色，染色后，将凝胶浸于脱色液中，水平摇床振荡脱色；

⑷蛋白点的胶内酶解：①凝胶平铺于染色盘上，切下用于质谱检测的蛋白点，用50 μL去离子水将其吹入96孔PCR板的小孔中，吸出去离子水后加入50 μL脱色液；

②在50℃条件下振荡15 分钟，将脱色液吸出，重复一次，直至胶块完全呈无色状；

③加50 μL去离子水，50℃振荡15 分钟，洗去残留的脱色液和胶块中的离子；

④加30 μL乙腈，静置5-10 分钟，胶块变为白色后吸出乙腈，室温静置20 分钟，使乙腈挥发；

⑤在胶块上面加6-12 μL的酶解液，使酶解液没过胶块，封好PCR板，37℃振荡过夜酶解；

⑸MALDI-TOF 4700 Proteome Analyser质谱仪鉴定蛋白

①把质谱样品板洗干净抛光，然后用异丙醇去极性后晾干，备用；

②在质谱样品板四周边缘六个孔上都点上ABI公司校准液，在中间点样孔处点上0.3 μL酶解液后再点上0.3 μL质谱自带基质溶液自然混合，晾干；

③冷风吹去样品板上的灰尘杂质，放入质谱仪测定；

④美国ABI公司的GPS 3.5软件对质谱数据进行分析，米曲霉蛋白质数据库检索。

而且，所述裂解液成分为：8M尿素，2M硫脲，0.5% g/%ml，CHAPS，2% g/%ml美国Bio-Rad公司pH4-7两性电解质，1wt%DTT，1mM PMSF。

而且，所述溶胀缓冲液的成分为wt%：8M尿素，2M硫脲，0.5% CHAPS，0.52%美国Bio-Rad公司pH4-7两性电解质，0.02%溴酚蓝，1%DTT。

而且，所述的等点聚焦程序为：

而且，所述的上样缓冲液成分为wt%：8 mL 0.5 M Tris pH 6.8，6.4 mL甘油，12.8 mL 10% SDS，3.2 mL巯基乙醇，1.6 mL 0.05%溴酚蓝，超纯水32 mL。

而且，所述平衡缓冲液I成分为wt%：50mM Tris-HCl pH6.8，6M尿素，30%甘油，2% SDS，2%DTT，0.02%溴酚蓝；

所述平衡缓冲液II成分为wt%：50mM Tris-HCl pH6.8 ，6M尿素，30%甘油，2% SDS，2.5%IAA，0.02%溴酚蓝。

而且，所述染色液成分为wt%：10%硫酸铵，10%磷酸，0.12%G250，20%甲醇；所述脱色液配置方法为：3%冰醋酸溶液。

而且，所述酶解液成分为wt%：25 mM碳酸氢铵，0.005 μg/μL测序级胰蛋白酶。

而且，所述质谱仪检测模式为：校正仪器使误差低于10 ppm，测试时采用正离子采集模式，采集范围为700-4 000 Da，激光强度调整为1000。

而且，所述米曲霉蛋白质数据库检索条件为：肽段和片段质量误差分别为± 0.1 Da和± 0.3 Da，允许有最多一个断裂位点的缺失，考虑甲硫氨酸的氧化和半硫氨酸的氨基甲酰胺变化修饰，MS或MS/MS的MASCOT报告中，定义统计显著性得分在95分以上的蛋白点认为可信。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明提供了微生物发酵过程中产生的蛋白的分泌情况，能够绘制相应的蛋白质组学图谱，进而能够找到相应微生物的特点蛋白及其调控基因。

2、本发明提供了微生物米曲霉菌体全蛋白表达图谱，确定了522个蛋白点及指导其合成的蛋白序列。

3、本发明提供的蛋白表达图谱为挖掘米曲霉发酵过程中对风味有重要影响的蛋白提供了研究基础。

附图说明

图1为本发明米曲霉蛋白质组学图谱（图中左边数字代表标准蛋白样品的分子量大小，图上面的4-7代表在pI为4-7的条件下的蛋白点）。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本实施例以米曲霉为例来说明分析的过程和方法，其他真菌参照本方法即可。

一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，步骤如下：

1.收集发酵过程中的米曲霉菌丝体，PBS洗涤3次，加入液氮研磨至粉末状，加入适量裂解液和50μg/ml DNase I、50 μg/ml RNase，混匀，冰浴15分钟，冰浴超声2分钟，14000 rpm，4度离心30分钟取上清。

2.从冰箱中取出IPG预制胶条，用溶胀缓冲液将胶条泡胀12小时。

3.将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，上样量为1mg，并用溶胀buffer稀释至170μl。

4.对好正、负极，盖上盖子，进行等电聚焦。

5.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。

①配制12%丙烯酰胺凝胶6块。

②平衡胶条：先将胶条放入平衡缓冲液I 水平振荡15分钟，再将胶条转入平衡缓冲液II水平振荡15分钟。

③第二次平衡结束后，将pH 4-7的IPG胶条从样品水化盘中移出，放到已配好的SDS-PAGE凝胶上端，并将marker放到凝胶的一端，再用0.5％的琼脂糖将胶条和marker封严，切忌不能产生气泡。并将胶板固定于电泳槽内。

④在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，15mA/胶恒流电泳15分钟，然后250v恒压电泳，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

⑤电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，将凝胶放入装有染色液的水平盘内，并将水平盘置水平摇床上水平振荡过夜染色。

⑥脱色：将收集染色液，将凝胶浸于脱色液中，水平摇床振荡。最后换成超纯水再洗涤30分钟。

6.蛋白点的胶内酶解

①凝胶平铺于干净的Dodeca白色染色盘上，用注射器针头切下实验中研究的用于质谱检测的蛋白点，用50 μL去离子水将其吹入96孔PCR板的小孔中。

②吸出去离子水后加入50 μL脱色液，在50℃条件下振荡15 分钟，将脱色液吸出。重复一次，直至胶块完全呈无色状。

③加50 μL去离子水，50℃振荡15 分钟，洗去残留的脱色液和胶块中的离子。

④加30 μL乙腈，静置5-10 分钟，胶块变为白色后吸出乙腈，如果胶块中的水比较多，胶块不能变白，可重复一次。室温静置20 分钟，使乙腈挥发。

⑤在胶块上面加6-12 μL的酶解液，使酶解液恰好没过胶块，封好PCR板，37℃振荡过夜酶解。

7.质谱仪鉴定蛋白

①把质谱样品板洗干净抛光，然后用异丙醇去极性后晾干，备用。

②在质谱样品板四周边缘六个孔上都点上ABI校准液，在中间点样孔处点上0.3 μL酶解液后再点上0.3 μL基质溶液自然混合，晾干。

③冷风吹去样品板上的灰尘杂质，放入质谱仪测定。

④ABI的GPS 3.5软件对质谱数据进行分析，米曲霉蛋白质数据库检索。

具体操作如下：

一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，步骤如下：

1、收集发酵酱油大曲过程中的米曲霉3.042菌丝体，PBS洗涤并用液氮研磨至粉末状，加入200μL裂解液和50μg/ml DNase I、50 μg/ml RNase，混匀、冰浴、冰浴超声2分钟，4度离心取上清。

2、IPG预制胶条用溶胀缓冲液将胶条泡胀12小时，放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，上样量为1mg，并用上样缓冲液稀释至170μl，对好正、负极，进行等电聚焦。

等点聚焦程序为：

。

3、将胶条放入平衡缓冲液I 水平振荡15分钟，再将胶条转入平衡缓冲液II水平振荡15分钟。第二次平衡结束后，将IPG胶条从样品水化盘中移出，放到已配好的12wt%丙烯酰胺凝胶上端，并将marker放到凝胶的一端，再用0.5wt%的琼脂糖将胶条和marker封严，切忌不能产生气泡。并将胶板固定于电泳槽内。加入电泳缓冲液后，接通电源，15mA/胶恒流电泳15分钟，然后250v恒压电泳，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。取出凝胶，进行染色。染色后将凝胶浸于脱色液中，水平摇床振荡。最后换成超纯水再洗涤30分钟。

4、凝胶平铺于干净的Dodeca白色染色盘上，用注射器针头切下实验中研究的用于质谱检测的蛋白点，用50 μL去离子水将其吹入96孔PCR板的小孔中。吸出去离子水后加入50 μL脱色液，在50℃条件下振荡15 分钟，将脱色液吸出。重复一次，直至胶块完全呈无色状。加50 μL去离子水，50℃振荡15 分钟，洗去残留的脱色液和胶块中的离子。加30 μL乙腈，静置5-10 分钟，胶块变为白色后吸出乙腈，如果胶块中的水比较多，胶块不能变白，可重复一次。室温静置 20 分钟，使乙腈挥发。在胶块上面加6-12 μL的酶解液，使酶解液恰好没过胶块，封好PCR板，37℃振荡过夜酶解。

5、在质谱样品板四周边缘六个孔上都点上ABI校准液，在中间点样孔处点上0.3 μL酶解液后再点上0.3 μL基质溶液自然混合，晾干，冷风吹去样品板上的灰尘杂质，放入质谱仪中检测。

6、ABI的GPS 3.5软件对质谱数据进行分析，选用米曲霉RIB40蛋白质数据库检索。

7、根据检索到的蛋白的注释，找到调控该蛋白的基因序列。

以下百分比均为重量百分比，有特殊标明的除外。

上样缓冲液成分为wt%：8 mL 0.5 M Tris pH 6.8，6.4 mL甘油，12.8 mL 10% SDS，3.2 mL巯基乙醇，1.6 mL 0.05%溴酚蓝，超纯水32 mL。

PBS缓冲液配置方法为：NaCl 8 g，Na₂HPO₄ 1.44 g，NaH₂PO₄ 0.24 g，KCl 0.2 g，pH 7.4，用超纯水在1000 mL容量瓶中定容，灭菌备用。

裂解液配置方法为：8M尿素，2M硫脲，0.5%（w:v g/%ml）CHAPS, 2%（w:v g/%ml）美国Bio-Rad公司pH4-7两性电解质，1%DTT，1mM PMSF。

溶胀缓冲液的配置方法为：8M尿素，2M硫脲，0.5% CHAPS，0.52%美国Bio-Rad公司pH4-7两性电解质，0.02%溴酚蓝，1%DTT。

平衡缓冲液I配置方法为：50mM Tris-HCl pH6.8，6M尿素，30%甘油，2% SDS，2%DTT，0.02%溴酚蓝。

平衡缓冲液II配置方法为：50mM Tris-HCl pH6.8 ，6M尿素，30%甘油，2% SDS，2.5%IAA，0.02%溴酚蓝。

染色液配置方法为：10%硫酸铵，10%磷酸，0.12%G250，20%甲醇。

脱色液配置方法为：3%冰醋酸溶液。

酶解液配置方法为：25 mM碳酸氢铵，0.005 μg/μL测序级胰蛋白酶。

质谱仪检测模式为：校正仪器使误差低于10 ppm，测试时采用正离子采集模式，采集范围为700-4 000 Da，激光强度调整为1000。

检索条件为：肽段和片段质量误差分别为± 0.1 Da和± 0.3 Da，允许有最多一个断裂位点的缺失，考虑甲硫氨酸的氧化和半硫氨酸的氨基甲酰胺变化修饰。MS或MS/MS的MASCOT报告中，定义统计显著性得分在95分以上的蛋白点认为可信。

图中染色点部分即标号的蛋白点，蛋白点的基因序列和氨基酸序列都可以根据基因名称（即accession number号）在NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站上搜素到它对应的基因序列或氨基酸序列。

以下是本发明根据上述方法，检索到的蛋白的注释的accession number，即可找到调控该蛋白的基因序列， accession number如下（其中重复的编号为找到的多个蛋白点为同一个基因编码所致）：

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Claims

1.一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴等电聚焦：收集发酵过程中菌丝体，PBS缓冲液洗涤3次，加入液氮研磨至粉末状，加入适量裂解液和50μg/ml DNase I、50 μg/mlRNase，混匀，冰浴15分钟，冰浴超声2分钟，14000 rpm，4度离心30分钟取上清，从冰箱中取出美国Bio-Rad公司的pH 4-7的IPG预制胶条，用溶胀缓冲液将胶条泡胀12小时；将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，并用上样缓冲液稀释至170μl，对好正、负极，盖上盖子，MultiphorII电泳系统进行等电聚焦；

⑸MALDI-TOF 4700 Proteome Analyser质谱仪鉴定蛋白

③冷风吹去样品板上的灰尘杂质，放入质谱仪测定；

2.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述裂解液成分为：8M尿素，2M硫脲，0.5% g/%ml，CHAPS，2%g/%ml美国Bio-Rad公司pH4-7两性电解质，1wt%DTT，1mM PMSF。

3.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述溶胀缓冲液的成分为wt%：8M尿素，2M硫脲，0.5% CHAPS，0.52%美国Bio-Rad公司pH4-7两性电解质，0.02%溴酚蓝，1%DTT。

4.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述的等点聚焦程序为：

。

5.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述的上样缓冲液成分为wt%：8 mL 0.5 M Tris pH 6.8，6.4 mL甘油，12.8 mL 10% SDS，3.2 mL巯基乙醇，1.6 mL 0.05%溴酚蓝，超纯水32 mL。

6.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述平衡缓冲液I成分为wt%：50mM Tris-HCl pH6.8，6M尿素，30%甘油，2% SDS，2%DTT，0.02%溴酚蓝；

7.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述染色液成分为wt%：10%硫酸铵，10%磷酸，0.12%G250，20%甲醇；所述脱色液配置方法为：3%冰醋酸溶液。

8.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述酶解液成分为wt%：25 mM碳酸氢铵，0.005 μg/μL测序级胰蛋白酶。

9.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述质谱仪检测模式为：校正仪器使误差低于10 ppm，测试时采用正离子采集模式，采集范围为700-4 000 Da，激光强度调整为1000。

10.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述米曲霉蛋白质数据库检索条件为：肽段和片段质量误差分别为± 0.1 Da和± 0.3 Da，允许有最多一个断裂位点的缺失，考虑甲硫氨酸的氧化和半硫氨酸的氨基甲酰胺变化修饰，MS或MS/MS的MASCOT报告中，定义统计显著性得分在95分以上的蛋白点认为可信。