CN103308586A - 发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法 - Google Patents

发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103308586A
CN103308586A CN2012100670606A CN201210067060A CN103308586A CN 103308586 A CN103308586 A CN 103308586A CN 2012100670606 A CN2012100670606 A CN 2012100670606A CN 201210067060 A CN201210067060 A CN 201210067060A CN 103308586 A CN103308586 A CN 103308586A
Authority
CN
China
Prior art keywords
electrophoresis
protein
gel
penicillium
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012100670606A
Other languages
English (en)
Inventor
元英进
程景胜
乔斌
吕晓敏
卢华
陈尧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN2012100670606A priority Critical patent/CN103308586A/zh
Publication of CN103308586A publication Critical patent/CN103308586A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了了一种发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法，包括如下步骤：(1)细胞质内蛋白的提取；(2)对细胞质外蛋白的提取；(3)二维凝胶电泳；(4)二维凝胶图像分析；(5)MALDI-TOF-MS对蛋白质的鉴定，利用本发明的方法可以快速地、高通量地、准确地寻找到青霉素发酵过程中与青霉素合成密切相关的蛋白水平，及其与青霉素生产水平的关系，发现差异表达蛋白，这些差异表达的蛋白质为进一步改造青霉菌的代谢路径提供了靶点，从而为获得高产菌株，提高青霉素的产量提供一定的理论，也为其他工业抗生素菌株的改造提供新的方法和思路。

Description

发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法
技术领域
本发明属于工业微生物领域，涉及一种新的发酵过程中细胞内和发酵培养基中蛋白质的鉴定。
背景技术
作为一个最大的全球销售类抗生素药物，用于工业发酵生产的产黄青霉经过多次菌种改良，并且人们已经清楚描述了关于青霉素的生物合成途径。由于可以获得产黄青霉的基因序列，使得现在在蛋白组学水平上研究青霉素G的生产成为可能。然而，除青霉素合成基因、代谢工程和微体蛋白组学分析外，很少有人研究该真菌细胞质内和细胞外的蛋白组，尤其是在可能直接或间接参与青霉素生物合成的工业发酵条件下的情况。据报道自溶导致青霉素V的降解、培养基滤过性等问题，这些与在产黄青霉的工业菌株批量培养中细胞内解朊作用和β-1-3-glucanolytic酶活性的增加密切相关。产黄青霉工业菌株在碳源和氮源受限时，丝氨酸和天门冬氨酰蛋白酶、金属蛋白酶都与自溶密切相关。可见探究工业发酵条件下产黄青霉的胞内外蛋白是非常有必要的，能够帮助我们理解其自溶和青霉素的降解机理。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便有效的发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)细胞质内蛋白的提取
在LB培养基中接种青霉菌，培养，从接种1h起至170h，选10个时间点，每个时间点收集1份细胞，对每份细胞进行蛋白提取，得到细胞内蛋白组，测定蛋白含量；
(2)对细胞质外蛋白的提取
在LB培养基中接种青霉菌，培养，在生长周期的OD540值分别在1～8之间取4份1L的发酵液，对每份发酵液进行蛋白提取，得到细胞外蛋白组，测定蛋白含量；
(3)二维凝胶
①等电聚焦电泳
将干燥的从青霉细胞内、外提取的各800μg蛋白样品用100～500μL溶胀液(rehydration buffer)溶解，用IPGphor仪聚焦蛋白，等电聚焦电泳的条件：30V电泳10-20h，500V电泳1～3h，1000V电泳1～3h，8000V电泳6～10h；
②IPG胶条的平衡：
等电聚焦电泳结束后，将IPG胶条放入装有5-15ml SDS平衡液I的玻璃管中在摇床上振荡平衡10-20min，接着将胶条转移到装有5-15ml SDS平衡液II的玻璃管中在摇床上振荡平衡10-20min；
③SDS-PAGE电泳
将平衡后的胶条移至预制好的质量浓度为5％-15％的SDS-PAGE凝胶的胶面上，电泳条件：15℃，35V电泳1h后，用110V恒压电泳直到溴酚蓝到达凝胶前缘时即可结束电泳，获得二维凝胶；
④用考马斯亮蓝染色方法对步骤③获得的凝胶进行染色：
将凝胶置于固定液中，摇床上室温固定80-100min；取出，再浸泡于R250染色液，25-40℃摇床上振荡染色1.5-2.5h；所述固定液为体积比为45∶10∶45的甲醇、乙酸和水组成；
(4)二维凝胶图像分析
将染色的凝胶用图像扫描仪扫描，获得蛋白表达图谱，运用ImageMaster 2-D Elite软件对蛋白的表达丰度进行分析和标准化；
(5)MALDI-TOF-MS对蛋白质的鉴定
分离染色后的二维凝胶上的蛋白斑点，用体积浓度为50％的乙腈溶液脱色，所述乙腈溶液的溶剂为25mM的碳酸氢铵水溶液，乙腈脱水，冻干，放置于2.5μl的0.1mg/ml胰蛋白酶水溶液中，冰浴25-60min，再加入10μl的25mM碳酸氢铵水溶液，37℃放置10-14h；用1μl的体积浓度为10％的三氟乙酸水溶液停止酶解反应，得到多肽；对所述多肽除盐，将除盐后的多肽与0.6μl浓度为0.5mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液混合，在靶上点样，自然晾干；用MALDI-TOF-MS检测分析；所述α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液的溶剂为体积浓度为30％的乙腈水溶液。
所述R250染色液由45ml甲醇、10ml乙酸、0.25mg考马斯亮蓝R250和45ml的水混合制成。
本发明的优点：
本发明采用蛋白组学分析方法阐明了产黄青霉对工业过程的生理反应，证明了糖代谢和青霉素合成与蛋白质的动态变化有关，并且证明一些参与细胞氧化还原平衡、转运和蛋白水解过程的蛋白的改变，在调节青霉素产量变化和产黄青霉细胞行为方面起到重要作用。本发明可以用于与脂组学、代谢组学和蛋白翻译后修饰进行全面分析比较，探究现实工业发酵过程中青霉素生产的特定机理。
同时本发明提供了一种有效的青霉菌细胞内外蛋白的鉴定方法。
利用本发明的方法可以快速地、高通量地、准确地寻找到青霉素发酵过程中与青霉素合成密切相关的蛋白水平，及其与青霉素生产水平的关系，发现差异表达蛋白，这些差异表达的蛋白质为进一步改造青霉菌的代谢路径提供了靶点，从而为获得高产菌株，提高青霉素的产量提供一定的理论，也为其他工业抗生素菌株的改造提供新的方法和思路。
附图说明
图1为用于鉴定的产黄青霉工业生产菌株的细胞内和细胞外蛋白的典型2-DE图谱。
图2为表征产黄青霉发酵过程中与氧化还原有关的蛋白鉴定的热图。
图3为表征产黄青霉发酵过程中与糖代谢和蛋白水解有关的蛋白鉴定的热图。
图4为表征产黄青霉发酵过程中与ATP键、转运和信号传导有关的蛋白鉴定的热图。
图5为表征产黄青霉发酵过程中鉴定的与青霉素生产相关的蛋白变化代谢关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的提取
(1)细胞内蛋白的提取：
在LB培养基中接种青霉菌(本实施列采用的是产黄青霉菌(Penicillium chrysogenumCGMCC NO.3.4023))，培养，从接种2h起至170h，选10个时间点收集10份细胞(分别在2h，8h，20h，32h，50h，80h，98h，128h，140h and 170h收集)，每份细胞分别用冰浴的2mM苯甲基磺酰化氟-超纯水溶液洗涤3次；0℃收集洗涤后的细胞，在液氮中研磨成细胞粉末；取0.2g所述细胞粉末悬浮于裂解缓冲液中，再加入12μl DNase I和RNaseA的水溶液，冰浴放置20min，加入12μl浓度为1mM苯甲基磺酰化氟-异丙醇溶液，超声15秒/次，共3次，在20,000xg的转速下离心40min后，收集上清液，在-20℃的条件下与4倍于上清液体积的冰浴的丙酮混合，放置6h；在20,000xg的转速下离心40min，将沉淀物冻干，得到细胞内蛋白组，用Bradford方法测定蛋白含量；
裂解缓冲液的配制为：5mol尿素、2mol硫脲、30mg 3-((3-胆汁氨丙基)二甲基胺)-1-丙磺酸、20mmol Tris碱，加水定容至1L；
DNase I和RNaseA的水溶液的配制为：8mg DNaseI，3mg RNaseA、30mmol MgCl2、0.1molTris-HCl，调pH为7.0，加水定容至1L；
(2)细胞外蛋白的提取：
在LB培养基中接种青霉菌(同本实施例步骤(1))，培养，在生长周期的OD540值分别在1～8之间取4份(OD540值分别1.0、3.5、6.0和8.0)、每份1L发酵液，在4℃，20,000xg的转速下离心40min，上清液通过0.45μm孔径过滤，滤液加入冰浴三氯乙酸至三氯乙酸终浓度为10mg/100ml进行沉淀，用体积浓度为85％的丙酮水溶液洗涤沉淀5次，得到细胞外蛋白组，用Bradford方法测定蛋白含量。
本实施例是以产黄青霉(Penicillium chrysogenum CGMCC NO.3.4023)为例进行说明，但并不对本发明作任何限定，实验证明，用青霉菌的其它菌株也可以完成本发明，例如：产黄青霉(Penicillium chrysogenum CGMCC NO.3.5252)、产黄青霉(Penicillium chrysogenumCGMCC NO.3.5130)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum CGMCC NO.3.4024)。
实施例2
一种发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)二维凝胶电泳
①等电聚焦电泳
将干燥的从青霉细胞内、外提取的各800μg蛋白样品(实施例1提取)用350μL溶胀液(rehydration buffer)溶解，用IPGphor仪聚焦蛋白，等电聚焦电泳的条件：30V电泳13h，500V电泳1h，1000V电泳1h，8000V电泳10h；
②IPG胶条的平衡：
等电聚焦电泳结束后，将IPG胶条放入装有10ml SDS平衡液I的玻璃管中在摇床上振荡平衡15min，接着将胶条转移到装有10ml SDS平衡液II的玻璃管中在摇床上振荡平衡15min；
③SDS-PAGE电泳
将平衡后的胶条移至预制好的质量浓度为10％的SDS-PAGE凝胶的胶面上，电泳条件：15℃，35V电泳1h后，用110V恒压电泳直到溴酚蓝到达凝胶前缘时即可结束电泳，获得二维凝胶；
④用考马斯亮蓝染色方法对步骤(3)获得的凝胶进行染色：
将凝胶置于固定液中，摇床上室温固定90min；取出，再浸泡于R250染色液，25℃摇床上振荡染色2h；所述固定液为体积比为45∶10∶45的甲醇、乙酸和水组成；
(2)二维凝胶图像分析
将考马斯亮蓝染色的凝胶用图像扫描仪(GE Healthcare)选择传输模式扫描染色的凝胶，获得图像。图像用ImageMaster 2-DElite3.01版本(GE Healthcare)按照操作说明进行分析。一些关键参数设定为常数，灵敏度为8150，操作大小设置为10，噪声系数设置为1，背景设置为20，每次蛋白丰度被标准化，使蛋白点的体积相对胶上全部蛋白点的体积相分离，倍增因子为100，在蛋白点检测和背景减除过后，将各二维凝胶胶块对齐，寻找相互对应蛋白点，从而得到定量分析，用斑点强度比计算倍数的改变，分离对应于1g/L接种尺寸的蛋白丰度与对照明显不同的斑点(p＜0.05)；见图1(图1(A)为细胞内蛋白，图1(B)为细胞外蛋白)；
(3)MALDI-TOF-MS对蛋白质的鉴定
分离染色后的二维凝胶上的蛋白斑点，用体积浓度为50％的乙腈溶液脱色，所述乙腈溶液的溶剂为25mM的碳酸氢铵水溶液，乙腈脱水，冻干，放置于2.5μl的胰蛋白酶水溶液中，冰浴30min，再加入10μl的25mM碳酸氢铵水溶液，37℃放置12h；用1μl的体积浓度为10％的三氟乙酸水溶液停止酶解反应，得到多肽；对所述多肽除盐，将除盐后的多肽与0.6μl浓度为0.5mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA a-cyano-4-hydroxyoinnamic acid)基质溶液混合，在靶上点样，自然晾干；用MALDI-TOF-MS(Bruker Daltonics，Karlsruhe，德国)检测分析；质谱的工作电压为19kV，采用反射模式，m/z比的范围为600-4000；MALDI-TOF-MS得到的单一同位素蛋白分子质量用m/z软件分析；质谱图用胰蛋白酶自酶解的多肽内部校正，用于校正的m/z比分别是842.509和2211.105，以获得质量测定特定的100pm的精确度；MALDI-TOF-MS获得的单一同位素多肽质量采用MASCOT程序在NCBInr数据库中搜索；搜索条件：Carbamidomethylation(C)作为固定修饰，可变修饰为氧化(M)和Gln-pyro-Glu(N-term Q)；多肽质量的允许误差为100ppm，未剪切点的个数设置为1；蛋白得分超过70即认为显著(p＜0.05)，鉴定蛋白的信息，以组建代谢途径；发酵2h的水平设定为1.0作比较；分析倍数的改变后，再用软件Expander4.1Win分析已鉴定蛋白的热图和改变趋势。(见图2、图3、图4)所述α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液的溶剂为体积浓度为30％的乙腈水溶液。
实施例3
一种发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)二维凝胶电泳
①等电聚焦电泳
将干燥的从青霉细胞内、外提取的各800μg蛋白样品(实施例1提取)用300μL溶胀液(rehydration buffer)溶解，用IPGphor仪聚焦蛋白，等电聚焦电泳的条件：30V电泳15h，500V电泳3h，1000V电泳3h，8000V电泳9h；
②IPG胶条的平衡：
等电聚焦结束后，将IPG胶条放入装有5ml SDS平衡液I的玻璃管中在摇床上振荡平衡10min，接着将胶条转移到装有5ml SDS平衡液II的玻璃管中在摇床上振荡平衡10min；
③SDS-PAGE电泳
将平衡后的胶条移至预制好的质量浓度为5％的SDS-PAGE凝胶的胶面上，电泳条件：15℃，35V电泳1h后，用110V恒压电泳直到溴酚蓝到达凝胶前缘时即可结束电泳，获得二维凝胶；
④用考马斯亮蓝染色方法对步骤③获得的凝胶进行染色：
将凝胶置于固定液中，摇床上室温固定80min；取出，再浸泡于R250染色液，30℃摇床上振荡染色1.5h；所述固定液为体积比为45∶10∶45的甲醇、乙酸和水组成；
(2)二维凝胶图像分析
同实施例2；
(3)MALDI-TOF-MS对蛋白质的鉴定
分离染色后的二维凝胶上的蛋白斑点，用体积浓度为50％的乙腈溶液脱色，所述乙腈溶液的溶剂为25mM的碳酸氢铵水溶液，乙腈脱水，冻干，放置于2.5μl的胰蛋白酶水溶液中，冰浴25min，再加入10μl的25mM碳酸氢铵水溶液，37℃放置11h；用1μl的体积浓度为10％的三氟乙酸水溶液停止酶解反应，得到多肽；对所述多肽除盐，将除盐后的多肽与0.6μl浓度为0.5mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液混合，在靶上点样，自然晾干；用MALDI-TOF-MS检测分析；质谱的工作电压为19kV，采用反射模式，m/z比的范围为600-4000；MALDI-TOF-MS得到的单一同位素蛋白分子质量用m/z软件分析；质谱图用胰蛋白酶自酶解的多肽内部校正，用于校正的m/z比分别是842.509和2211.105，以获得质量测定特定的100pm的精确度；MALDI-TOF-MS获得的单一同位素多肽质量采用MASCOT程序在NCBInr数据库中搜索；搜索条件：Carbamidomethylation(C)作为固定修饰，可变修饰为氧化(M)和Gln-pyro-Glu(N-term Q)；多肽质量的允许误差为100ppm，未剪切点的个数设置为1；蛋白得分超过70即认为显著(p＜0.05)，鉴定蛋白的信息，以组建代谢途径；发酵2h的水平设定为1.0作比较；分析倍数的改变后，再用软件Expander4.1Win分析已鉴定蛋白的热图和改变趋势。
实施例4
一种发酵中青霉菌细胞内、外蛋白质组的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)二维凝胶电泳
①等电聚焦电泳
将干燥的从青霉细胞内、外提取的各800μg蛋白样品用100μL溶胀液(rehydrationbuffer)溶解，用IPGphor仪聚焦蛋白，等电聚焦电泳的条件：30V电泳10h，500V电泳1.5h，1000V电泳1.5h，8000V电泳8h；
②IPG胶条的平衡：
等电聚焦结束后，将IPG胶条放入装有15ml SDS平衡液I的玻璃管中在摇床上振荡平衡20min，接着将胶条转移到装有15ml SDS平衡液II的玻璃管中在摇床上振荡平衡20min；
③SDS-PAGE电泳
将平衡后的胶条移至预制好的质量浓度为15％的SDS-PAGE凝胶的胶面上，电泳条件：15℃，35V电泳1h后，用110V恒压电泳直到溴酚蓝到达凝胶前缘时即可结束电泳，获得二维凝胶；
④用考马斯亮蓝染色方法对步骤(3)获得的凝胶进行染色：
将凝胶置于固定液中，摇床上室温固定100min；取出，再浸泡于R250染色液，40℃摇床上振荡染色2.5h；所述固定液为体积比为45∶10∶45的甲醇、乙酸和水组成；
(2)二维凝胶图像分析
将染色的凝胶用图像扫描仪扫描，获得蛋白表达图谱，运用ImageMaster 2-D Elite软件对蛋白的表达丰度进行分析和标准化；
(3)MALDI-TOF-MS对蛋白质的鉴定
分离染色后的二维凝胶上的蛋白斑点，用体积浓度为50％的乙腈溶液脱色，所述乙腈溶液的溶剂为25mM的碳酸氢铵水溶液，乙腈脱水，冻干，放置于2.5μl的胰蛋白酶水溶液中，冰浴60min，再加入10μl的25mM碳酸氢铵水溶液，37℃放置14h；用1μl的体积浓度为10％的三氟乙酸水溶液停止酶解反应，得到多肽；对所述多肽除盐，将除盐后的多肽与0.6μl浓度为0.5mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液混合，在靶上点样，自然晾干；用MALDI-TOF-MS检测分析；质谱的工作电压为19kV，采用反射模式，m/z比的范围为600-4000；MALDI-TOF-MS得到的单一同位素蛋白分子质量用m/z软件分析；质谱图用胰蛋白酶自酶解的多肽内部校正，用于校正的m/z比分别是842.509和2211.105，以获得质量测定特定的100pm的精确度；MALDI-TOF-MS获得的单一同位素多肽质量采用MASCOT程序在NCBInr数据库中搜索；搜索条件：Carbamidomethylation(C)作为固定修饰，可变修饰为氧化(M)和Gln-pyro-Glu(N-term Q)；多肽质量的允许误差为100ppm，未剪切点的个数设置为1；蛋白得分超过70即认为显著(p＜0.05)，鉴定蛋白的信息，以组建代谢途径；发酵2h的水平设定为1.0作比较；分析倍数的改变后，再用软件Expander4.1Win分析已鉴定蛋白的热图和改变趋势。
所述α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液的溶剂为体积浓度为30％的乙腈水溶液。
实施例5
一种发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)二维凝胶电泳
①等电聚焦电泳
将干燥的从青霉细胞内外提取的各800μg蛋白样品用500μL溶胀液(rehydrationbuffer)溶解，用IPGphor仪聚焦蛋白，等电聚焦电泳的条件：30V电泳20h，500V电泳2h，1000V电泳2h，8000V电泳6h；
②IPG胶条的平衡：
等电聚焦结束后，将IPG胶条放入装有10ml SDS平衡液I的玻璃管中在摇床上振荡平衡13min，接着将胶条转移到装有10ml SDS平衡液II的玻璃管中在摇床上振荡平衡13min；
③SDS-PAGE电泳
将平衡后的胶条移至预制好的质量浓度为10％的SDS-PAGE凝胶的胶面上，电泳条件：15℃，35V电泳1h后，用110V恒压电泳直到溴酚蓝到达凝胶前缘时即可结束电泳，获得二维凝胶；
④用考马斯亮蓝染色方法对步骤(3)获得的凝胶进行染色：
将凝胶置于固定液中，摇床上室温固定95min；取出，再浸泡于R250染色液，摇床上振荡染色2.2h；所述固定液为体积比为45∶10∶45的甲醇、乙酸和水组成；
(2)二维凝胶图像分析
将染色的凝胶用图像扫描仪扫描，获得蛋白表达图谱，运用ImageMaster 2-D Elite软件对蛋白的表达丰度进行分析和标准化；
(3)MALDI-TOF-MS对蛋白质的鉴定
分离染色后的二维凝胶上的蛋白斑点，用体积浓度为50％的乙腈溶液脱色，所述乙腈溶液的溶剂为25mM的碳酸氢铵水溶液，乙腈脱水，冻干，放置于2.5μl的胰蛋白酶水溶液中，冰浴45min，再加入10μl的25mM碳酸氢铵水溶液，37℃放置10h；用1μl的体积浓度为10％的三氟乙酸水溶液停止酶解反应，得到多肽；对所述多肽除盐，将除盐后的多肽与与0.6μl浓度为0.5mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液混合，在靶上点样，自然晾干；用MALDI-TOF-MS检测分析；质谱的工作电压为19kV，采用反射模式，m/z比的范围为600-4000；MALDI-TOF-MS得到的单一同位素蛋白分子质量用m/z软件分析；质谱图用胰蛋白酶自酶解的多肽内部校正，用于校正的m/z比分别是842.509和2211.105，以获得质量测定特定的100pm的精确度；MALDI-TOF-MS获得的单一同位素多肽质量采用MASCOT程序在NCBInr数据库中搜索；搜索条件：Carbamidomethylation(C)作为固定修饰，可变修饰为氧化(M)和Gln-pyro-Glu(N-term Q)；多肽质量的允许误差为100ppm，未剪切点的个数设置为1；蛋白得分超过70即认为显著(p＜0.05)，鉴定蛋白的信息，以组建代谢途径；发酵2h的水平设定为1.0作比较；分析倍数的改变后，再用软件Expander4.1Win分析已鉴定蛋白的热图和改变趋势。所述α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液的溶剂为体积浓度为30％的乙腈水溶液。
上面各实施例中SDS平衡液I组成为：50mmol/L Tris-HCl，pH＝8.8，质量浓度为2％的十二烷基磺酸钠，质量浓度为1％的二硫苏糖醇，6mol/L尿素，质量浓度为30％的甘油，痕量的溴酚蓝，总体积为1L，余量为水，-40℃保存，其中二硫苏糖醇是在使用前加入的。
上面各实施例中SDS平衡液II组成为：50mmol/L Tris-HCl，pH＝8.8，质量浓度为2％的十二烷基磺酸钠，质量浓度为2.5％的碘乙酰胺，6mol/L尿素，质量浓度为30％的甘油，痕量的溴酚蓝，总体积为1L，余量为水，-20℃保存，其中碘乙酰胺是在使用前加入的。
上面各实施例中R250染色液由45ml甲醇、10ml乙酸、0.25mg考马斯亮蓝R250和45ml的水混合制成。
上面各实施例中胰蛋白酶水溶液：按照说明书将酶溶解配制为0.1ug/ul酶液，用25mMNH4HCO3稀释10倍。
上面各实施例中溶胀液配制：8M的尿素、20mgCHAPS(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、3g二硫苏糖醇(DTT)、50ml(v/v)固相pH梯度(IPG)缓冲液pH4-7(GE Healthcare)和痕量的溴酚蓝，加水定容至1L；
表1实施例1和实施例2产黄青霉菌发酵过程中提取鉴定的细胞质内蛋白数
Figure BDA0000143500510000081
表2实施例1和实施例2产黄青霉菌发酵过程中鉴定的细胞外蛋白数

Claims (2)

1.一种发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法，其特征是包括如下步骤：
(1)细胞质内蛋白的提取
在LB培养基中接种青霉菌，培养，从接种1h起至170h，选10个时间点，每个时间点收集1份细胞，对每份细胞进行蛋白提取，得到细胞内蛋白组，测定蛋白含量；
(2)对细胞质外蛋白的提取
在LB培养基中接种青霉菌，培养，在生长周期的OD540值分别在1～8之间取4份1L的发酵液，对每份发酵液进行蛋白提取，得到细胞外蛋白组，测定蛋白含量；
(3)二维凝胶电泳
①等电聚焦电泳
将干燥的从青霉细胞内、外提取的各800μg蛋白样品用100～500μL溶胀液溶解，用IPGphor仪聚焦蛋白，等电聚焦电泳的条件：30V电泳10-20h，500V电泳1～3h，1000V电泳1～3h，8000V电泳6～10h；
②IPG胶条的平衡：
等电聚焦电泳结束后，将IPG胶条放入装有5-15ml SDS平衡液I的玻璃管中在摇床上振荡平衡10-20min，接着将胶条转移到装有5-15ml SDS平衡液II的玻璃管中在摇床上振荡平衡10-20min；
③SDS-PAGE电泳
将平衡后的胶条移至预制好的质量浓度为5％-15％的SDS-PAGE凝胶的胶面上，电泳条件：15℃，35V电泳1h后，用110V恒压电泳直到溴酚蓝到达凝胶前缘时即可结束电泳，获得二维凝胶；
④用考马斯亮蓝染色方法对步骤③获得的凝胶进行染色：
将凝胶置于固定液中，摇床上室温固定80-100min；取出，再浸泡于R250染色液，25-40℃摇床上振荡染色1.5-2.5h；所述固定液为体积比为45∶10∶45的甲醇、乙酸和水组成；
(4)二维凝胶图像分析
将染色的凝胶用图像扫描仪扫描，获得蛋白表达图谱，运用ImageMaster 2-D Elite软件对蛋白的表达丰度进行分析和标准化；
(5)MALDI-TOF-MS对蛋白质的鉴定
分离染色后的二维凝胶上的蛋白斑点，用体积浓度为50％的乙腈溶液脱色，所述乙腈溶液的溶剂为25mM的碳酸氢铵水溶液，乙腈脱水，冻干，放置于2.5μl的0.1mg/ml胰蛋白酶水溶液中，冰浴25-60min，再加入10μl的25mM碳酸氢铵水溶液，37℃放置10-14h；用1μl的体积浓度为10％的三氟乙酸水溶液停止酶解反应，得到多肽；对所述多肽除盐，将除盐后的多肽与0.6μl浓度为0.5mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液混合，在靶上点样，自然晾干；用MALDI-TOF-MS检测分析；所述α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液的溶剂为体积浓度为30％的乙腈水溶液。
2.根据权利要求1所述的一种发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法，其特征是所述R250染色液由45ml甲醇、10ml乙酸、0.25mg考马斯亮蓝R250和45ml的水混合制成。
CN2012100670606A 2012-03-14 2012-03-14 发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法 Pending CN103308586A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012100670606A CN103308586A (zh) 2012-03-14 2012-03-14 发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012100670606A CN103308586A (zh) 2012-03-14 2012-03-14 发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103308586A true CN103308586A (zh) 2013-09-18

Family

ID=49134039

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012100670606A Pending CN103308586A (zh) 2012-03-14 2012-03-14 发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103308586A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106770872A (zh) * 2017-01-13 2017-05-31 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种用于肉鸡血清蛋白质组的鉴定方法
CN108007997A (zh) * 2017-12-06 2018-05-08 上海市农业科学院 一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法
CN108441526A (zh) * 2017-02-04 2018-08-24 扬州大学 一种利用海洋真菌大规模生产penicilone类化合物的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102175635A (zh) * 2011-03-17 2011-09-07 天津大学 检测维生素c工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法
CN102344916A (zh) * 2011-01-24 2012-02-08 中国人民解放军第三军医大学 类风湿关节炎特异性抗原
CN102359988A (zh) * 2011-06-29 2012-02-22 浙江大学 结核杆菌耐药蛋白的筛选方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102344916A (zh) * 2011-01-24 2012-02-08 中国人民解放军第三军医大学 类风湿关节炎特异性抗原
CN102175635A (zh) * 2011-03-17 2011-09-07 天津大学 检测维生素c工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法
CN102359988A (zh) * 2011-06-29 2012-02-22 浙江大学 结核杆菌耐药蛋白的筛选方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOHAMMAD-SAEID JAMI ET AL: "Proteome Analysis of the Penicillin Producer Penicillium chrysogenum", 《MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS》 *
吴红金: "蛋白质组学技术对冠心病血瘀证相关蛋白的研究", 《中西医结合心脑血管病杂志》 *
杨保军 等: "昆虫病原线虫共生菌胞内外蛋白的提取及杀虫活性比较", 《中国生物防治》 *
汪晓军 等: "蛋白质组学在医学真菌研究中的应用进展", 《中国真菌学杂志》 *
黄碧芳: "不同温度对虎奶菇胞内胞外蛋白差异表达的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（农业科技辑）》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106770872A (zh) * 2017-01-13 2017-05-31 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种用于肉鸡血清蛋白质组的鉴定方法
CN108441526A (zh) * 2017-02-04 2018-08-24 扬州大学 一种利用海洋真菌大规模生产penicilone类化合物的方法
CN108441526B (zh) * 2017-02-04 2021-06-22 扬州大学 一种利用海洋真菌大规模生产penicilone类化合物的方法
CN108007997A (zh) * 2017-12-06 2018-05-08 上海市农业科学院 一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Niu et al. Modified TCA/acetone precipitation of plant proteins for proteomic analysis
Park et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers
Ramautar et al. CE‐MS for metabolomics: Developments and applications in the period 2016–2018
Deracinois et al. Comparative and quantitative global proteomics approaches: an overview
Rogers et al. Proteolytic post-translational modification of proteins: proteomic tools and methodology
CN104076098B (zh) 等重二甲基化标记蛋白质定量方法
Butt et al. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: A systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection
JP2012524252A5 (zh)
CN103308586A (zh) 发酵中青霉菌细胞内外蛋白质组的鉴定方法
CN102816832A (zh) 桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及用途
CN106268649A (zh) 一种磁性纳米材料及其在磷酸肽富集中的应用
Rabilloud The whereabouts of 2D gels in quantitative proteomics
Zeng et al. Proteomic analysis of SARS associated coronavirus using two-dimensional liquid chromatography mass spectrometry and one-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis followed by mass spectroemtric analysis
Anjo et al. Unraveling mesenchymal stem cells’ dynamic secretome through nontargeted proteomics profiling
CN104949949A (zh) 含有罗丹明基团及苯并呋咱基团的化合物及制备方法与应用
CN104749263B (zh) 麦角硫因的检测方法
CN108774240A (zh) 一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针
CN103694342B (zh) 检测人老龄化的多肽标志物
CN103163225A (zh) 一种高灵敏全血环孢素a定量检测试剂盒及其制备
CN109557228A (zh) 一种利用特征标记肽段鉴别燕窝及其掺假物的方法
CN105865886A (zh) 一种利用毛细管电泳快速检测虾原肌球蛋白的方法
CN109136166B (zh) 一种适于双向电泳的水稻叶片质膜磷酸化蛋白的提取方法
CN103304625B (zh) 青霉菌细胞内外蛋白质组的提取
CN109100461A (zh) 一种利用蛋白组学技术区分有机大米和非有机大米的方法
CN105418560B (zh) 长波长肼比色荧光探针及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130918