CN102344916A

CN102344916A - 类风湿关节炎特异性抗原

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Publication number: CN102344916A
Application number: CN2011100256315A
Authority: CN
Inventors: 吴乔; 吴玉章
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-01-24
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2031-01-24
Also published as: CN102344916B; WO2012100598A1

Abstract

本发明涉及医学领域，特别涉及过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎诊断试剂，所述过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎早期诊断试剂中的应用，过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎特异性抗原中的应用中，其特异性和敏感性高，尤其适用于早期诊断试剂的应用，过氧化物还原酶Ⅳ还为制备类风湿关节炎疫苗中提供了新思路。

Description

类风湿关节炎特异性抗原

技术领域

本发明涉及医学领域，特别涉及类风湿关节炎特异性抗原。

背景技术

类风湿关节炎(RA) 是一种以滑膜炎为基本病理改变, 以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病，大多病情呈进行性，最终导致关节纤维性或骨性强直而严重致残，严重影响患者生活质量。未经正确治疗的类风湿关节炎可迁延不愈, 甚至导致关节畸形。作为自身免疫性疾病，致病抗原驱动的自身反应性CD4⁺T细胞活化是类风湿关节炎发病的核心途径。

对于类风湿关节炎的诊断，现在主流仍然沿用1987 年美国风湿病学学会RA 的分类标准，其主要靠临床表现并排除其他关节炎从而对RA进行判断。另外，X线改变和类风湿因子也是判断RA的常用标准。但上述方法操作繁琐且特异性不高，且不适用于早期诊断。

众所周知，RA的病理改变从滑膜组织开始逐渐向软骨到骨发展。RA在早期若未得到有效治疗，将会引起关节功能障碍甚至劳动力丧失，并导致全身多脏器受累进而危及生命。如果能尽早对RA病情做出诊断，及早治疗，从而阻止或延缓其发展，将能有效的提高RA的治疗效果并减少其并发症的发生。而针对RA早期有高度敏感性和特异性的检测指标是实现RA早期诊断和治疗的前提。

早期诊断指标中，IL-8、IL-6水平在巨细胞病毒DNA阳性的类风湿关节炎患者中升高和CMV基因组出现之间存在联系，但特异性和敏感性低。在RA自身抗体作为检测指标方面：类风湿因子（RF）存在灵敏度低的缺点；在早期RF阴性的类风湿关节炎病人中可53.3% 的病人抗核周因子（APF）呈阳性，但APF抗原片的保存时间较短（仅为1～2周），检测稳定性低；Sa抗体在类风湿关节炎中阳性率为40%，特异性为98.9%，但类风湿关节炎早期仅约23%；过氧化物还原酶Ⅳ（在说明书附图中简称“Ⅳ”）和类风湿关节炎的相关性研究尚未有人报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种过氧化物还原酶Ⅳ的新应用，该应用是通过在RA滑膜组织中筛选出RA备选抗原，再在备选抗原中筛选出过氧化物还原酶Ⅳ并对其抗体在初诊和复诊RA患者血清中通过间接ELISA进行特异性和敏感性检测，过氧化物还原酶Ⅳ主要表达于RA病变起始部位滑膜细胞胞浆，过氧化物还原酶Ⅳ体外特异性刺激RA患者外周血单个核细胞（PBMC）增殖并分泌RA发病相关细胞因子IL-17、TNF-α和IFN-γ，所以过氧化物还原酶Ⅳ是新的RA疾病相关抗原，该抗体检测的新应用在初诊RA患者血清当中特异性和敏感性高，为类风湿关节炎的早期诊断及治疗提供了新思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎特异性抗原中的应用。

进一步，所述过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用；

进一步，所述过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎早期诊断试剂中的应用；

进一步，过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎疫苗中的应用。

本技术方案分别利用免疫蛋白组学方法在RA滑膜中筛选出RA备选抗原及抗体，通过TOF-TOF质谱法及免疫蛋白印迹（Western Blotting）法进一步鉴定和验证备选抗原中的五号蛋白点为过氧化物还原酶Ⅳ；利用Western-blot检测RA和骨性关节炎（OA）滑膜组织中过氧化物还原酶Ⅳ表达差异；通过免疫组织化学染色方法证实过氧化物还原酶Ⅳ主要表达于RA起始病变部位滑膜细胞胞浆；借助间接法ELISA测定过氧化物还原酶Ⅳ抗体在RA血清中的特异性和敏感性；并发现过氧化物还原酶Ⅳ抗体滴度在初诊的早期RA患者（病程少于3个月）中明显高于正常人，并且高于经免疫抑制治疗的复诊RA患者；通过细胞增殖实验证实了过氧化物还原酶Ⅳ特异性刺激RA外周血单核细胞增殖，并分泌IL-17、TNF-α和IFN-γ等与RA发病相关细胞因子。根据上述结果，本发明得出如下结论：过氧化物还原酶Ⅳ为RA特异性疾病相关抗原。在上述研究基础上针对过氧化物还原酶Ⅳ抗原进行改造等方式制备疫苗可能为RA的特异性免疫治疗提供新的手段。

本发明的有益效果在于：过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎特异性抗原中的应用中，其特异性和敏感性高，尤其适用于早期诊断试剂的应用，过氧化物还原酶Ⅳ还为制备类风湿关节炎疫苗中提供了新思路。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为RA滑膜组织蛋白点2-D分离后Coomassie blue染色双向凝胶电泳图。

图2为RA患者血清与图1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。

图3为OA患者血清与图1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。

图4为正常人血清与图1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。

图5为系统性红斑狼疮（SLE）患者血清与图1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。

图6为RA滑膜组织中特异性与RA患者血清反应的双向凝胶电泳图，包含12个蛋白点。

图7为TOF-TOF蛋白质串联质谱对第5号蛋白点的鉴定图谱。

图8为免疫印迹法蛋白定性检测电泳谱,其中A为单向凝胶电泳图（1、2为不同RA滑膜组织，3、4为Hela细胞阳性对照），B为RA滑膜组织双向凝胶电泳图。

图9为免疫印迹法检测RA患者和OA患者滑膜组织中过氧化物还原酶Ⅳ的差异表达电泳图（1、2分别为RA和OA滑膜组织）。

图10-A和图10-B为苏木素-依红（HE）染色RA滑膜组织的病理照片图，图10-C和图10-D为RA滑膜组织过氧化物还原酶Ⅳ免疫组化染色的病理照片图。

图11为PBMC增殖实验的放射强度(cpm)分析图，其中A为cpm值分析图，B为刺激指数（stimulation index，SI）分析图。

图12为CFSE染色流式细胞检测PBMC增殖图。

图13为ELISA法检测过氧化物还原酶Ⅳ刺激PBMC IFN-γ、IL-17和TNF-α分泌量的分析图，其中，A为IFN-γ的分析图，B为IL-17的分析图，C为TNF-α的分析图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实验材料

1.1 试剂

丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、十二烷基磺酸钠、Tris、甘氨酸、溴酚蓝、二硫苏糖醇(DTT)、CHAPS、低熔点琼脂糖、低分子量标准蛋白、IPG缓冲液、IPG胶条(pH3-11 L)、IPG覆盖油、尿素和PhastGel Blue R购自Amersham Pharmacia Biotech；碘乙酰胺购自Sigma；测序级胰蛋白酶购自Promega；蛋白酶抑制剂和ECL Western blot 检测试剂盒购自Roche；甲醇、冰乙酸和无水乙醇购自重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂；辣根酶标记山羊抗人IgG（H+L）、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、Power VisionTM(IgG抗体-HRP多聚体)复合物和DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司；鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ单克隆抗体购自Abcam公司；Recombinant human 过氧化物还原酶Ⅳ购自Lifescience公司；多聚甲醛购自北京化学试剂公司。

1.2 仪器

IPGphor等电聚焦仪、SE600垂直电泳仪、MultiTempIII循环水浴和TE50X 电转仪购自Amersham Pharmacia Biotech公司；550型酶联仪和GS-800图像扫描系统Bio-Rad 公司；MALDI-TOF质谱仪购自Bruker 公司；低温高速离心机购自中国科学院武汉科学仪器厂；脱色摇床购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；LEICA AM 2135型切片机购自Leica公司；BX-50型Olympus显微镜和PM-20型Olympus显微摄像系统Olympus公司；紫外分光光度仪Backmen 公司。

主要试剂配制

1.3.1 样品裂解液贮液：40 mmol/L Tris，7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，质量分数为4％的CHAPS，1ml/管分装，-70℃冻存。

1.3.2 10mg/ml RNase A，-20℃冻存备用。

1.3.3 mg/ml DNase Ⅰ，-20℃冻存备用。

1.3.4 20×蛋白酶抑制剂：1粒蛋白酶抑制剂溶解于350μL纯水中。

1.3.5 1 mol/L DTT，-20℃冻存备用。

1.3.6 IPG buffer，4℃保存备用。

1.3.7 样品裂解液工作液：40mmol/L Tris，7 mol/L 尿素，2mol/L硫脲，质量分数为4％的CHAPS，100μg/ml DNase Ⅰ，25μg/ml RNase A，1×蛋白酶抑制剂，0.8％ IPG buffer，60 mmol/L DTT。

1.3.8 溶涨液贮液：7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，质量分数为2％的CHAPS，痕量溴酚蓝，-70℃冻存。

1.3.9 溶涨液工作液：溶涨液贮液中加入质量分数为1％的IPG buffer，60 mmol/L DTT(临用前加)。

1.3.10 平衡缓冲液： 50 mmol/L Tris-Cl pH 8.8, 6 mol/L urea, 体积分数为30％的glycerol, 质量分数为2％的SDS, 溴酚蓝痕量。

1.3.11 质量分数为0.5％低熔点琼脂：质量分数为0.5％的低熔点琼脂溶解于SDS-PAGE电泳缓冲液。

1.3.12 30％丙烯酰胺贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉丙烯酰胺溶解于100ml纯水中，过滤，4℃贮存于棕色瓶中。

1.3.13 4×分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-Cl(pH 8.8)

1.3.14 10％SDS：10g SDS溶解于50ml H2O中，定容至100ml。

1.3.15 10％过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶解于1ml纯水中。

1.3.16 SDS-PAGE电泳缓冲液：94g甘氨酸，12.1g Tris，50ml 10％ SDS，溶解于水并定容至1000ml。

1.3.17 考马斯亮蓝染色液贮液：溶解1片PhastGel Blue R于80ml水中，搅拌5-10min，加入120mL甲醇，搅拌直至染料完全溶解，过滤溶液备用。

1.3.18 考马斯亮蓝染色液工作液(0.1％)：染色液贮液与体积分数为20％乙酸按体积比为1：1的比例混合。

1.3.19 脱色液：体积分数为30％乙醇，体积分数为10％乙酸溶于水中。

1.3.20 转移缓冲液(39mm 甘氨酸，48mmTris碱，质量分数为0.037％的SDS，体积分数为20％甲醇)：称取甘氨酸2.9g，Tris碱5.8g，SDS 0.037g，并加入200ml甲醇，最后加水补充至总体积为1000ml。

1.3.21 TBS(50mM Tris碱，150mM氯化钠，pH7.5) ：称取6.05g Tris碱，8.76g氯化钠，用HCl调节pH值至7.5，加水至总体积为1L，2-8℃保存3个月。

1.3.22 TBST：将1mLTween 20加入1L TBS中，2-8℃保存3个月。

1.3.23 1％封闭液：加入10mL封闭液贮液到90mlTBS中，在-15~-25℃稳定保存。

1.3.24 0.5％封闭液：加入5mL封闭液贮液到95mLTBS中，在-15~-25℃稳定保存。

1.3.25 一抗（血清）：用0.5％的封闭液稀释一抗。

1.3.26 POD标记的抗鼠或兔IgG：用100μL纯水将冻干粉溶解，得到二抗贮液。用0.5％的封闭液稀释得到工作液。40mU/mL二抗通常足够用来检测。该贮液在2-8℃可以保存12个月，但工作液需要新鲜配置。

1.3.27 ECL检测溶液：将溶液A与溶液B以体积比为1:1的比例混合，该溶液现配现用。

1.3.28 0.01M PBS：50mL0.2mol/L PB加8.8g NaCl，双蒸水定容至1000mL。

1.3.29 RIPA裂解液：1.5M Nacl 1mL，100mM Tris-HCL(pH7.4) 5mL，加质量分数为10％SDS 100uL，500mM DTT 100uL，NP-40 100uL，Complete Mini（蛋白酶抑制剂）1片，三蒸水定容至10 mL。

1.3.30 包被液： 0.85M（PH 9.6）碳酸盐缓冲液：1.59g Na₂CO₃加2.93g NaHCO₃，三蒸水定容1000mL。

1.3.31 洗涤液：0.01M pH7.4 PBS＋吐温-20（T）使最终质量分数为 0.05％。

1.3.32 底物溶液：磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0~5.5)：0.1M柠檬酸24.3mL加入25.7ml 0.2M Na₂HPO₄·12H₂O 加入邻苯二胺40.0mg，定容至50mL，临用前加0.15mL体积分数为 30％的H₂O₂。

1.3.33 终止剂：22.2mL硫酸加入蒸馏水177.8mL。

1.4 样品： 5例RA滑膜组织由北京大学附属人民医院风湿免疫科栗占国教授提供；534例 RA（其中初诊67例、复诊467例）、65例OA、120例SLE、10例硬皮病（scleroderma）、15例皮肌炎（dermatomyositis）及120例正常对照（NC）血液标本源自西南医院。

双向凝胶电泳法筛选RA滑膜组织中的备选抗原

2.1样品制备

2.1.1 取出-70℃冻存的RA滑膜组织样品，室温平衡约10min，加入样品裂解液工作液充分研磨，涡旋器上振荡约20-30min后，室温放置1-2h，使细胞蛋白充分溶解，经过超声裂解后4℃12000rpm 1小时。

2.1.2 样品溶液的蛋白定量 (DC Protein Assay，BIO-RAD COMPANY)。

2.1.2.1 配制蛋白标准液(0.25mg/ml～1.5mg/ml蛋白)：先将BSA溶解于水配制10mg/mL的BSA母液，然后用样品裂解液稀释成0、0.25、0.5、1.0、1.5mg/ml五个不同浓度的BSA溶液。

2.1.2.2 样品液的稀释：用样品裂解液将样品液稀释10、20倍备用。

2.1.2.3 准备工作液试剂A￠：每1ml试剂A加入20μL试剂S(该工作液试剂A￠可稳定1周，即使1天以后形成了沉淀。如果形成了沉淀，加热溶液并振荡。不要用加样枪头吹打，因为容易堵塞枪头而改变加入样品中的试剂体积) 。

2.1.2.4 样品及标准品A655值的测定：吸取5μL标准液和样品加入干净、干燥的微孔板。每孔加入25μL试剂A￠或试剂A。每孔加入200μL试剂B。15min后，655nm测吸光值。1h内吸光值稳定。

2.1.2.5 建立线性方程，计算样品蛋白浓度。

实验方法

2.2.1 2D-PAGE第一向——等电聚焦

2.2.1.1 取出-20℃冻存的IPG strip，室温平衡数分钟。

2.2.1.2 样品和溶涨液在IPG holder中混合，达到合适的上样量，去掉IPG胶条的保护膜，胶面朝下，避免产生气泡，放入溶涨液中。IPG胶条上覆盖一层矿物油，盖上盖子，溶涨过夜。

2.2.1.3 仪器运行参数如下：

等电聚焦运行参数：温度，20℃；最大电流，50mA per IPG strip；样品体积，350μl(180mm IPG strip)或250μl(130mm IPG strip)；30V，10-12小时(溶涨)；200V，1小时；500V，1小时；500-8000V，30min；8000V, 5-6小时(IPG 3-10L)，6-7小时(IPG 4-7)。

2.2.1.4 达到适当的总电压-时间积(Total Volt-hours,Vh)后，取出胶条于平衡液中平衡。

2.2.2 平衡

2.2.2.1 100mg DTT溶解于10mL平衡缓冲液中(平衡缓冲液Ⅰ)。取出IPG胶条分别放入玻璃管中，在振荡仪上振荡平衡15min。

2.2.2.2 400mg碘乙酰胺溶解于10mL平衡缓冲液(平衡缓冲液Ⅱ)，将胶条转移到平衡缓冲液Ⅱ中，盖上盖，在振荡仪上振荡平衡15min。

2.2.3 2D-PAGE第二向——SDS-PAGE

2.2.3.1 灌胶

2.2.3.2 按仪器说明书装好灌胶膜具，倒入凝胶溶液，在每块胶的上面加入纯水以得到平的凝胶上样平面。室温条件下至少聚合2h。

2.2.3.3 电泳槽中装满电泳缓冲液，并打开恒温水浴系统，调节温度为15℃。

2.2.3.4 将平衡好的IPG胶条浸入纯水中1秒中，以除掉多余的平衡缓冲液，将胶条放在滤纸上除去多余水份。

2.2.3.5 将IPG胶条小心的放置在SDS胶面上，并轻压使IPG胶条与SDS胶面充分结合，上面覆盖0.5％低熔点琼脂糖溶液，使琼脂糖在5min内凝固。

2.2.3.6 将胶盒插入电泳槽中，开始电泳。

2.2.3.7 SDS电泳运行条件：使用SE600电泳仪，具体方法如下：温度，15℃；电流时间，10mA/胶，15min；25mA/胶，3-4 hours。

2.2.3.8 当溴酚蓝迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。

染色和图像分析

2.3.1 染色

电泳完成后用新鲜配制的考马斯亮蓝染色液工作液(0.1％)，染色4h或过夜，用脱色液脱色直至背景干净。

2.3.2. 凝胶图像采集和图像分析

采用GS-800图像分析系统对二维电泳凝胶扫描，利用PDQuest 7.0软件(Bio-Rad)进行凝胶图像分析。

2.4.1 转印过程：

2.4.1.1 SDS电泳完成后，将胶切角标示后，以适量的转移缓冲液将凝胶在室温平衡15min。

2.4.1.2 戴上手套，切6张滤纸和1张PVDF膜，大小与胶相同，并将滤纸浸泡在转移缓冲液中。

2.4.1.3 以100％甲醇湿润PVDF膜15秒，然后转入纯水中浸润3min，最后在转移缓冲液中平衡15min。

2.4.1.4 组装转运三明治，由负极到正极依次为：滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸

2.4.1.5 将三明治放入转运仪中，根据凝胶面积按0.65mA/cm²，接通电源，电转移时间根据具体情况来决定。

2.4.1.6 转运结束后，用丽春红S染色。

2.4.1.7 PVDF膜充分漂洗后，进行特异性抗体杂交，显色。

2.4.1.8 膜的封闭：将膜放入塑料袋中，根据滤膜面积加入1％封闭液， 4℃封闭过夜。

2.4.1.9 一抗与PVDF膜孵育：将大肠癌患者血清或正常人血清以1：200的浓度与PVDF膜孵育。

2.4.1.10 漂洗：TBST 洗涤两次，每次10min；0.5％的封闭液洗涤两次，各10min。

2.4.1.11 POD标记二抗与PVDF膜孵育：根据滤膜面积加入二抗稀释液，平放在平缓摇动的平台上于室温温育30min。

2.4.1.12 漂洗：用大量TBST洗涤4次，每次15min。

2.4.2 显色过程：将膜暴露在检测试剂中后，必须快速进行显色反应，以免发光反应消退。所有的过程必须在暗室中进行。

2.4.2.1 将一个透明的、与膜大小相同的透明塑料袋中装满清洗液，然后将膜放入袋中，用10ml的玻璃移液管轻轻滚动以赶出多余的液体。

2.4.2.2 加入预先混合好的检测液。

2.4.2.3 将膜插入显色盒中，蛋白面朝上。

2.4.2.4 关灯，将一张胶片放在膜上，并关上显色盒。曝光10-60s。

2.4.2.5 马上换一张新的胶片放在膜上，关上显色盒，并将刚才曝光的胶片进行显色。显色过程中，可以打开红光监测。

2.4.2.6 从第一张胶片的信号强度上推测第二张胶片的适宜曝光时间。发光反应在1-2min后就达到高峰，并且持续20-30min，1h后，信号强度会下降至高峰的60-70％。如果信号太强，可以等待10min后，在进行第二次曝光。

结论：应用免疫蛋白组学的方法，通过设置OA、正常人和SLE血清对照后筛查出特异性与RA血清反应的12个滑膜组织蛋白点作为RA备选抗原，详见图1-图6。

从RA备选抗原中鉴定出过氧化物还原酶Ⅳ及其差异表达和病变组织分布

3.1 MALDI-TOF/TOF质谱鉴定

3.1.1 酶解消化

3.1.1.1 考马斯亮蓝染色凝胶的脱色：将电泳染色后凝胶中的蛋白点切下，用干净的解剖刀将凝胶切成1-2mm²大小，用超纯水清洗几次后，用含50％乙腈，25 mmol/L NH₄HCO₃溶液浸泡胶点，振荡20min后弃去溶液，重复1～2次至胶点中蓝色褪尽。

3.1.1.2 酶切：真空离心干燥约20min，使胶片完全脱水体积缩小，加入5～10μl胰酶溶液(0.01μg/μl，含25mmol/L NH₄HCO₃)，4℃放置20-30min，待酶液完全吸收，补充5-10μl 25mmol/L NH₄HCO₃，37℃保温15h。

3.1.1.3 肽提取：加5％ TFA 50～100μl于40℃保温1h，吸出上清，加入2.5％ TFA，50％乙腈50-100μl于30℃保温1h，吸出上清，合并上清液，冰冻干燥。干燥后样品用3～5μl 0.5％的TFA溶液溶解。样品用C18 Ziptip(Millipore， USA)脱盐，脱盐步骤按照说明书操作。

3.1.2 MALDI-TOF/TOF分析：将酶切好样品送北京华大基因组公司，采用MALDI-TOF/TOF质谱的方法分析。

3.1.3 数据库查询及参数设定：

如图7显示，最大允许的肽质量数误差为：400ppm；每条肽考虑一次不完全切割；等电点的范围为：3-10；采用Mascot和NCBI BLAST 进行序列的同源性分析。

过氧化物还原酶Ⅳ单抗凝胶电泳法验证质谱鉴定

一维验证：从液氮中取出冻存的组织，精确称重后按1:10(w/v)加入RIPA裂解液。冰浴下充分研磨匀浆，将匀浆液吸入一1.5mL离心管中，置冰上裂解60min。4℃离心，12000g×60min。取上清并分装，-70℃冻存备用。样品溶液的蛋白定量（同前述方法）。配制10％分离胶和5％积层胶；上样前样品处理：根据蛋白定量调整蛋白浓度，蛋白样品上样量为50mg(总体积20mL)。电泳：积层胶电压80V，分离胶电压改120V。用Abcam公司鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ单克隆抗体作为一抗，北京中杉生物技术公司辣根酶标记山羊抗人IgG（H+L）为二抗，电转膜，杂交，显影等步骤同前述方法。结果详见图8。

结果：图8-A显示了过氧化物还原酶Ⅳ单抗一维验证质谱鉴定结果，1、2分别为两个不同RA患者滑膜组织；3、4为Hela细胞阳性对照；从而证实质谱鉴定的5号蛋白点在不同RA滑膜组织中均有表达。

二维验证：用上述二维凝胶电泳相同的方法分离RA组织蛋白点，转膜后孵育Abcam公司鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ单克隆抗体，显影后与RA血清杂交后出现的蛋白点位置比对。

结果：图8-B为过氧化物还原酶Ⅳ单抗二维验证质谱鉴定结果，过氧化物还原酶Ⅳ单抗与RA滑膜组织反应点与图2 RA血清反应的5号点位置相同；说明在RA血清中确实存在能与滑膜组织反应的过氧化物还原酶Ⅳ抗体。

过氧化物还原酶Ⅳ在RA和OA滑膜组织中的差异表达

SDS-PAGE电泳：采用3.2中同样方法制备RA和OA蛋白样品。电泳：积层胶电压80V，分离胶电压改120V。电转膜，杂交，显影等步骤同前述方法。结果详见图9。

结果：图9显示过氧化物还原酶Ⅳ在RA滑膜组织中表达明显高于OA,1、2分别为RA和OA滑膜组织，上方条带为β-actin内参（42Kd），下方为目的条带（31Kd）；

3.4 过氧化物还原酶Ⅳ在病变组织中分布

免疫组化染色采用Power Vision TM二步法，按说明书使用方法进行操作，具体方法如下：

3.4.1 石蜡包埋组织切片（4μm～5μm），60℃烤箱加热24h。

3.4.2 二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化。纯二甲苯脱蜡两次（分别为5min、7min），100％、100％、95％、80％、70％梯度酒精水化至水。

3.4.3 PBS浸泡5min×2，滴加3％甲醇-H₂O₂ 封闭，室温10min，消除内源性过氧化物酶。

3.4.4 PBS浸泡5min×3，微波抗原修复，0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH=6）浸泡，微波炉内加热，中档6min，间歇2min，低档5min，室温冷却20min。

3.4.5 5％正常山羊血清室温封闭10min。

3.4.6 倾去血清，加入1:50 稀释的过氧化物还原酶Ⅳ单抗，湿盒内4℃冰箱过夜。用PBS代替一抗作为阴性对照。

3.4.7 PBS浸泡，5min×3，滴加Power VisionTM复合物50μL，37℃孵育，30min。

3.4.8 PBS浸泡，5min×3，DAB显色，使用DAB显色试剂盒，A、B、C液各一滴加入0.85ml蒸馏水中，充分混匀后加至玻片，室温显色10min。

3.4.9 自来水冲洗，苏木素复染15s～30s，1％盐酸酒精分化，饱和碳酸锂蓝化。

3.4.10 常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、DPX封片保存。

3.4.11 显微镜下观察，照相。结果详见图10。

图10-A、B（分别100×和200×）显示RA滑膜组织HE染色，表现为滑膜细胞增生，滑膜组织中大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主；图10-C、D（分别100×和200×）显示，过氧化物还原酶Ⅳ在滑膜组织中的分布，免疫组织化学染色证实过氧化物还原酶Ⅳ主要表达于滑膜细胞胞浆；

3.5 过氧化物还原酶Ⅳ抗原体外特异性刺激RA外周血单核细胞增殖

3.5.1 ³H-TdR掺入法

应用淋巴细胞分离液分离RA、SLE、皮肌炎、硬皮病、OA及正常人外周血单核细胞，按照2×10⁵/孔在96孔锥形板中培养。分别设置未刺激、过氧化物还原酶Ⅳ抗原刺激（50ug/mL）和PHA刺激阳性对照组，共培养3天。各组细胞于终止培养前18～24 h掺入³H-TdR 3.7×10⁶ Bq/孔，到达相应的观察时间点后终止培养，弃上清，用多头细胞收集仪收集样品于玻璃纤维滤纸上，烘干。将收集了不同样品的滤纸分别夹入液闪瓶，加入闪烁液，在β液闪仪中测每分钟脉冲计数值（cpm）。PBMC增殖分别用cpm值（详见图12-A）和刺激指数stimulation index（SI=待测样本cpm/阴性对照cpm）（详见图12-B）表示。

3.5.2 CFSE标记流式细胞术检测PBMC增殖

新鲜分离的RA患者及各对照组外周血单个核细胞细胞数调至8×10⁶/L,700g ×5分钟离心后，用1ml含5%FBS的0.01M PBS重悬。 CFSE（贮存浓度10 mmol/L）用DMSO稀释至5mmol/L, 取1.1ul CFSE工作液加入110ul 0.01M PBS中，再逐滴的加入到细胞中, 混匀, 置37℃孵育10 min后，加入10ml含5%FBS的0.01M PBS终止反应。700g×5分钟离心去上清，充分上述操作3次。RPMI1640完全培养液悬浮细胞, 调整细胞数为2×10⁵/L。接种96孔板, 每孔200 μL。每个样品各设3个过氧化物还原酶Ⅳ刺激孔（50ug/孔）, 3个阴性对照孔（50ul 0.01M PBS）和3个PHA刺激孔（25 mg/L）, 37℃、5% CO₂继续培养3d。应用流式细胞仪（Beckman FC500）将每个样品分析10 000个细胞。获取的数据经Cell Quest软件分析。首先通过前散射（FS）和侧散射（SS）二维散点图, 划出淋巴细胞区。所得结果用柱状图显示，如图12。

结论：³H-TdR掺入法和CFSE标记流式细胞术两种方法同时证实过氧化物还原酶Ⅳ抗原体外特异性刺激RA外周血单核细胞增殖，说明过氧化物还原酶Ⅳ为RA特异性抗原。

过氧化物还原酶Ⅳ抗原体外特异性刺激RA外周血单核细胞分泌IL-17A、TNF-α和INF-γ

新鲜分离的RA患者及各对照组外周血单个核细胞，48孔板培养，每孔1×10⁶/L，每个样品各设3个过氧化物还原酶Ⅳ刺激孔（50ug/孔）, 3个阴性对照孔（50ul 0.01M PBS）和3个PHA刺激孔（25 mg/L）, 37℃、5% CO₂培养3d。12000rpm×5分钟4℃离心，收集上清。按照如下预包被人IL-17A、TNF-α和INF-γ ELSIA试剂盒说明书进行操作：加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入底物A、B各50μL，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入50μL终止液，加入终止液后应立即测定结果。在450nm波长处测定各孔的OD值。根据标准曲线，计算线性回归方程，最终得出检测样本各细胞因子浓度。如图14所示，A、B、C分别表示INF-γ、IL-17A和TNF-α，结果显示，过氧化物还原酶Ⅳ抗原体外刺激RA PBMC分泌与RA发病相关细胞因子，IL-17A、TNF-α和INF-γ。而不刺激OA、正常人及SLE等其他自身免疫性疾病患者PBMC分泌上述细胞因子。

结论: 过氧化物还原酶Ⅳ抗原体外特异性刺激RA患者PBMC分泌IL-17A、TNF-α和INF-γ。IL-17A、TNF-α和INF-γ均为参与RA疾病发生的重要细胞因子，说明过氧化物还原酶Ⅳ为RA特异性的疾病相关性抗原。

在上述实施例的基础上针对过氧化物还原酶Ⅳ抗原进行改造等方式制备疫苗可能为RA的特异性免疫治疗提供新的手段。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎特异性抗原中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎早期诊断试剂中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎疫苗中的应用。