WO2012100598A1

WO2012100598A1 - 类风湿关节炎早期特异性抗原过氧化物还原酶iv

Info

Publication number: WO2012100598A1
Application number: PCT/CN2011/083629
Authority: WO
Inventors: 吴乔; 吴玉章
Original assignee: 中国人民解放军第三军医大学
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-12-07
Publication date: 2012-08-02
Also published as: CN102344916B; CN102344916A

Description

类风湿关节炎早期特异性抗原过氧化物还原酶 IV 技术领域

本发明涉及医学领域，特别涉及类风湿关节炎特异性抗原。

背景技术

类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis, RA)是一种以滑膜炎为基本病理改变,以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病，大多病情呈进行性，最终导致关节纤维性或骨性强直而严重致残，严重影响患者生活质量。未经正确治疗的类风湿关节炎可迁延不愈，甚至导致关节畸形。如早期发现、早期治疗可有效控制 RA的病情发展。因而早期诊断 RA—直是各国学者关注的问题，寻找特异性和敏感性都较高的血清标志物备受大家的关注。

2010年美国风湿病协会 (ACR)和欧洲抗风湿病联盟（ EULAR)提出了新的 RA分类标准。它要求参加评分的患者至少有一个临床上明确有滑膜炎的关节,而且滑膜炎的原因不能被其它疾病所解释。该标准根据受累关节的情况、血清抗体检查结果、急性期反应物、症状持续时间等项目的积分来诊断。总分为 10分 6分就能明确诊断 RA;小于 6分目前不能确诊 RA, 但患者有可能在将来满足诊断标准。

实验诊断方面,除过去的类风湿因子 (RF)外,还有抗瓜氨酸多肽 (CCP)抗体、抗 RA33 抗体、抗角蛋白抗体、抗核周因子抗体等抗体。 RF在 RA中的阳性率可高达 75%-80%,但其特异性较差,在其他疾病中也能检测到 RF,如系统性红斑狼疮、疟疾、结核等；甚至正常人血清中也可检测到 (健康人群阳性率 3%-5%,老年人 10%-30%)；在某些预防接种后也可能出现 RF 阳性的结果。抗 RA-33抗体的靶抗原是 33kD的核酸蛋白,是对 Hela细胞的核蛋白产生的特异性抗体,与 hnRNP有交叉反应。抗 RA-33在早期 RA中可以出现,有利于 RA的早期诊断。该抗体特异性较高,可达 99%,但敏感性仅 35.8%。通常 RA33总与 RA36同时出现,而后者更具特异性。在我国 RA患者中的敏感性为 28.9%-37.7%,其特异性为 89.8%-95.5%。因为约有 1/3 的系统性红斑狼疮和混合性结缔组织病患者的血清中亦可检测出抗 RA33 抗体,所以抗 RA33 抗体对 RA 诊断的特异性受到质疑。抗 CCP抗体的敏感性和特异性分别为 71.4%和 92.5%。但在符合 RA分类诊断标准的患者当中，仍然存在相当部分抗 CCP抗体阴性患者。过氧化物还原酶 IV和类风湿关节炎的相关性研究尚未有人报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种过氧化物还原酶 IV的新应用，该应用是通过在 RA滑膜组织中筛选出 RA备选抗原，再在备选抗原中筛选出过氧化物还原酶 IV并对其及其抗体和免疫复合物在早期和晚期 RA 患者血清中通过 ELISA进行特异性和敏感性检测，过氧化物还原酶 IV主要表达于 RA病变起始部位滑膜细胞胞浆，过氧化物还原酶 IV体外特异性刺激 RA 患者外周血单个核细胞（PBMC) 增殖并分泌 RA发病相关细胞因子 IL-17A、 TNF- α和 IFN- Y , 所以过氧化物还原酶 IV是新的 RA疾病相关抗原，该抗原抗体及其免疫复合物检测的新应用在早期 RA患者血清当中特异性和敏感性高，为类风湿关节炎的早期诊断及治疗提供了新思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

过氧化物还原酶 IV在制备类风湿关节炎特异性抗原中的应用。

进一步，所述过氧化物还原酶 IV抗原、表位肽、免疫复合物及其抗体在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用；

进一步，所述过氧化物还原酶 IV抗原、表位肽、免疫复合物及其抗体在制备类风湿关节炎早期诊断试剂中的应用；

进一步，过氧化物还原酶 IV在制备类风湿关节炎疫苗中的应用。

本技术方案分别利用免疫蛋白组学方法在 RA滑膜中筛选出 RA备选抗原及抗体，通过 TOF-TOF质谱法及免疫蛋白印迹（Western Blotting) 法进一步鉴定和验证备选抗原中的五号蛋白点为过氧化物还原酶 IV；利用 Western-blot检测 RA和骨性关节炎（OA) 滑膜组织中过氧化物还原酶 IV表达差异；通过免疫组织化学染色方法证实过氧化物还原酶 IV主要表达于 RA起始病变部位滑膜细胞胞浆；借助间接法 ELISA测定过氧化物还原酶 IV抗体在 RA血清中的特异性和敏感性；借助双抗体夹心 ELISA测定过氧化物还原酶 IV及其免疫复合物在 RA 血清中的特异性和敏感性；发现过氧化物还原酶 IV抗体和免疫复合物在晚期 RA患者（病程大于 2个月）中明显高于正常人，而过氧化物还原酶 IV在早期 RA患者（病程小于 2月）中明显高于正常人，并且高于经免疫抑制治疗的晚期 RA患者；通过细胞增殖实验证实了过氧化物还原酶 IV特异性刺激 RA 外周血单核细胞增殖，并分泌 IL-17、 TNF- α和 IFN- γ等与 RA发病相关细胞因子。根据上述结果，本发明得出如下结论：过氧化物还原酶 IV为 RA特异性疾病相关抗原。在上述研究基础上针对过氧化物还原酶 IV抗原进行改造等方式制备疫苗可能为 RA的特异性免疫治疗提供新的手段。

本发明的有益效果在于：过氧化物还原酶 IV在制备类风湿关节炎特异性抗原中的应用，其特异性和敏感性高，尤其适用于早期诊断试剂的应用，过氧化物还原酶 IV还为制备类风湿关节炎疫苗中提供了新思路。

附图说明为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图 1为 RA滑膜组织蛋白点 2-D分离后 Coomassie blue染色双向凝胶电泳图。

图 2为 RA患者血清与图 1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。

图 3为 OA患者血清与图 1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。

图 4为正常人血清与图 1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。

图 5为系统性红斑狼疮（SLE) 患者血清与图 1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。

图 6为 RA滑膜组织中特异性与 RA患者血清反应的双向凝胶电泳图，包含 12个蛋白点。

图 7为 TOF-TOF蛋白质串联质谱对第 5号蛋白点的鉴定图谱。

图 8为免疫印迹法蛋白定性检测电泳谱，其中 A为单向凝胶电泳图（1、 2为不同 RA滑膜组织， 3、 4为 Hela细胞阳性对照）， B为 RA滑膜组织双向凝胶电泳图。

图 9为免疫印迹法检测 RA患者和 OA患者滑膜组织中过氧化物还原酶 IV的差异表达电泳图（1、 2分别为 RA和 OA滑膜组织）。

图 10-A和图 10-B为苏木素 -依红（HE) 染色 RA滑膜组织的病理照片图，图 10-C和图 10-D为 RA滑膜组织过氧化物还原酶 IV免疫组化染色的病理照片图。

图 11为 PBMC增殖实验的刺激指数（stimulation index, SI) 分析图。

图 12为 CFSE染色流式细胞检测 PBMC增殖图。

图 13为 ELISA法检测过氧化物还原酶 IV刺激 PBMC IFN- y、 IL-17和 TNF- α分泌量的分析图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实验材料

1.1试剂

丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、 TEMED、过硫酸铵、十二烷基磺酸钠、 Tris、甘氨酸、溴酚蓝、二硫苏糖醇 (DTT)、 CHAPS, 低熔点琼脂糖、低分子量标准蛋白、 IPG 缓冲液、 IPG胶条 (pH3-ll L)、 IPG覆盖油、尿素和 PhastGel Blue R购自 Amersham Pharmacia Biotech; 碘乙酰胺购自 Sigma; 测序级胰蛋白酶购自 Promega; 蛋白酶抑制剂和 ECL Western blot检测试剂盒购自 Roche; 甲醇、冰乙酸和无水乙醇购自重庆川东化工 (集团)有限公司化学试剂厂；辣根酶标记山羊抗人 IgG ( H+L )、辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG ( H+L )、 Power VisionTM(IgG抗体 -HRP多聚体)复合物和 DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司；鼠抗人过氧化物还原酶 IV单克隆抗体购自 Abeam 公司（效价 1:12800 ) ; Recombinant human 过氧化物还原酶 IV购自 Lifescience公司；多聚甲醛购自北京化学试剂公司。

1.2仪器

IPGphor等电聚焦仪、 SE600垂直电泳仪、 MultiTempIII循环水浴和 TE50X 电转仪购自 Amersham Pharmacia Biotech公司； 550型酶联仪和 GS-800 图像扫描系统 Bio-Rad 公司； MALDI-TOF质谱仪购自 Bruker公司；低温高速离心机购自中国科学院武汉科学仪器厂；脱色摇床购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司； LEICA AM 2135 型切片机购自 Leica公司； BX-50型 Olympus显微镜和 PM-20型 Olympus显微摄像系统 Olympus公司；紫外分光光度仪 Backmen公司。

1.3主要试剂配制

1.3.1 样品裂解液贮液： 40 mmol/L Tris， 7 mol/L尿素， 2 mol/L硫脲，质量分数为 4% 的 CHAPS , 1ml/管分装， -70°C冻存。

1.3.2 lOmg/ml RNase A, -20°C冻存备用。

1.3.3 mg/ml DNase I， -20°C冻存备用。

1.3.4 20 X蛋白酶抑制剂： 1粒蛋白酶抑制剂溶解于 350 μ L纯水中。

1.3.5 1 mol/L DTT, -20°C冻存备用。

1.3.6 IPG buffer, 4°C保存备用。

1.3.7 样品裂解液工作液： 40mmol/L Tris， 7 mol/L尿素， 2mol/L硫脲，质量分数为 4% 的 CHAPS , 100 μ g/ml DNase I， 25 μ g/ml RNase A， I X蛋白酶抑制剂， 0.8 % IPG buffer, 60 mmol/L DTT。

1.3.8 溶涨液贮液： 7 mol/L尿素， 2 mol/L硫脲，质量分数为 2%的 CHAPS , 痕量溴酚蓝， -70°C冻存。

1.3.9 溶涨液工作液：溶涨液贮液中加入质量分数为 1 %的 IPG buffer , 60 mmol/L DTT (临用前加)。

1.3.10 平衡缓冲液： 50 mmol/L Tris-Cl H 8.8, 6 mol/L urea, 体积分数为 30 %的 glycerol, 质量分数为 2%的 SDS, 溴酚蓝痕量。

1.3.11 质量分数为 0.5 %低熔点琼脂：质量分数为 0.5 %的低熔点琼脂溶解于 SDS-PAGE 电泳缓冲液。

1.3.12 30 %丙烯酰胺贮液： 30g丙烯酰胺， 0.8g甲叉丙烯酰胺溶解于 100ml纯水中，过滤， 4°C贮存于棕色瓶中。

1.3.13 4 X分离胶缓冲液： 1.5 mol/L Tris-Cl(pH 8.8)

1.3.14 10 SDS: lOg SDS溶解于 50ml H₂O中，定容至 100ml。

1.3.15 10 %过硫酸铵： O.lg过硫酸铵溶解于 lml纯水中。

1.3.16 SDS-PAGE电泳缓冲液： 94g甘氨酸， 12.1g Tris, 50ml 10 % SDS , 溶解于水并定容至 1000ml。

1.3.17 考马斯亮蓝染色液贮液：溶解 1 片 PhastGel Blue R 于 80ml 水中，搅拌 5- lOmin, 加入 120mL甲醇，搅拌直至染料完全溶解，过滤溶液备用。

1.3.18 考马斯亮蓝染色液工作液 (0.1 %): 染色液贮液与体积分数为 20 %乙酸按体积比为 1： 1的比例混合。

1.3.19 脱色液：体积分数为 30 %乙醇，体积分数为 10 %乙酸溶于水中。

1.3.20 转移缓冲液 (39mm甘氨酸， 48mmTris 碱，质量分数为 0.037 %的 SDS，体积分数为 20 %甲醇)：称取甘氨酸 2.9g， Tris碱 5.8g， SDS 0.037g, 并加入 200ml甲醇，最后加水补充至总体积为 1000ml。

1.3.21 TBS(50mM Tris碱， 150mM氯化钠， ρΗ7·5) ：称取 6.05g Tris碱， 8.76g氯化钠，用 HC1调节 pH值至 7.5，加水至总体积为 1L， 2-8°C保存 3个月。

1.3.22 TBST: 将 lmLTween 20加入 1L TBS中， 2-8°C保存 3个月。

1.3.23 1 %封闭液：加入 10mL封闭液贮液到 90mlTBS中，在 -15~-25 °C稳定保存。

1.3.24 0.5 %封闭液：加入 5mL封闭液贮液到 95mLTBS中，在 -15~-25 °C稳定保存。

1.3.25 一抗（血清）：用 0.5 %的封闭液稀释一抗。

1.3.26 POD标记的抗鼠或兔 IgG: 用 100 μ L纯水将冻干粉溶解，得到二抗贮液。用 0.5 %的封闭液稀释得到工作液。 40mU/mL 二抗通常足够用来检测。该贮液在 2-8 °C可以保存 12个月，但工作液需要新鲜配置。

1.3.27 ECL检测溶液：将溶液 A与溶液 B 以体积比为 1:1 的比例混合，该溶液现配现用。

1.3.28 0.01M PBS : 50mL0.2mol/L PB加 8.8g NaCl, 双蒸水定容至 1000mL。

1.3.29 RIPA裂解液： 1.5M Nacl lmL, lOOmM Tris-HCL(pH7.4) 5mL，加质量分数为 10 SDS lOOuL, 500mM DTT lOOuL, NP-40 lOOuL, Complete Mini (蛋白酶抑制剂） 1片，三蒸水定容至 10 mL。

1.3.30 包被液： 0.85M (PH 9.6 ) 碳酸盐缓冲液： 1.59g Na₂C0₃力 B 2.93g NaHC0₃，三蒸水定容 1000mL。

1.3.31 洗涤液： 0.01M pH7.4 PBS十吐温 -20 (T) 使最终质量分数为 0.05 %。

1.3.32底物溶液：磷酸盐-柠檬酸缓冲液 (pH5.0~5.5): 0.1M柠檬酸 24.3mL加入 25.7ml

0.2M Na₂HP0₄ · 12H₂0加入邻苯二胺 40.0mg，定容至 50mL，临用前加 0.15mL体积分数为

30 %的 ¾0₂。

1.3.33 终止剂： 22.2mL硫酸加入蒸馏水 177.8mL。

1.4 样品： 5 例 RA 滑膜组织由北京大学附属人民医院风湿免疫科栗占国教授提供； 534 例 RA (其中早期 67 例、晚期 467 例）、 65 例 OA、 120 例 SLE、 10 例硬皮病 ( scleroderma )、 15例皮肌炎（dermatomyositis) 及 120例正常对照（NC) 血液标本源自西南医院。

2、双向凝胶电泳法筛选 RA滑膜组织中的备选抗原

2.1样品制备

2.1.1 取出 -70°C冻存的 RA滑膜组织样品，室温平衡约 lOmin, 加入样品裂解液工作液充分研磨，涡旋器上振荡约 20-30min后，室温放置 l-2h，使细胞蛋白充分溶解，经过超声裂解后 4°C 12000rpm 1小时。

2.1.2 样品溶液的蛋白定量 (DC Protein Assay, BIO-RAD COMPANY)。

2.1.2.1 配制蛋白标准液 (0.25mg/ml〜1.5mg/ml蛋白）：先将 BSA溶解于水配制 10mg/mL 的 BSA母液，然后用样品裂解液稀释成 0、 0.25、 0.5、 1.0、 1.5mg/ml五个不同浓度的 BSA 溶液。

2.1.2.2样品液的稀释：用样品裂解液将样品液稀释 10、 20倍备用。

2.1.2.3 准备工作液试剂 Α' : 每 1ml试剂 A加入 20 μ L试剂 S (该工作液试剂 A'可稳定 1 周，即使 1天以后形成了沉淀。如果形成了沉淀，加热溶液并振荡。不要用加样枪头吹打，因为容易堵塞枪头而改变加入样品中的试剂体积）。

2.1.2.4样品及标准品 Α655值的测定：吸取 5 μ L标准液和样品加入干净、干燥的微孔板。每孔加入 25 L试剂 A'或试剂 Α。每孔加入 200 L试剂 B。 15min后， 655nm测吸光值。 lh内吸光值稳定。

2.1.2.5 建立线性方程，计算样品蛋白浓度。

2.2 实验方法

2.2.1 2D-PAGE第一向——等电聚焦。

2.2.1.1 取出 -20 °C冻存的 IPG strip, 室温平衡数分钟。 2.2.1.2样品和溶涨液在 IPG holder中混合，达到合适的上样量，去掉 IPG胶条的保护膜，胶面朝下，避免产生气泡，放入溶涨液中。 IPG 胶条上覆盖一层矿物油，盖上盖子，溶涨过夜。

2.2.1.3 仪器运行参数如下：

等电聚焦运行参数：温度， 20 °C ; 最大电流， 50mA per IPG strip; 样品体积， 350 μ 1(180mm IPG strip)或 250 l(130mm IPG strip); 30V, 10-12 小时 (溶涨)； 200V, 1 小时； 500V, 1小时; 500-8000V, 30min; 8000V, 5-6小时 (IPG 3-10L), 6-7小时 (IPG 4-7)。

2.2.1.4达到适当的总电压-时间积 (Total Volt-hours ,Vh)后，取出胶条于平衡液中平衡。

2.2.2 平衡

2.2.2.1 lOOmg DTT溶解于 10mL平衡缓冲液中 (平衡缓冲液 I )。取出 IPG胶条分别放入玻璃管中，在振荡仪上振荡平衡 15min。

2.2.2.2 400mg碘乙酰胺溶解于 10mL平衡缓冲液 (平衡缓冲液 II )，将胶条转移到平衡缓冲液 II中，盖上盖，在振荡仪上振荡平衡 15min。

2.2.3 2D-PAGE第二向—— SDS-PAGE

2.2.3.1 灌胶

胶的浓度 10 % 12.5 %

30 %丙烯酰胺贮液 33.3ml 41.7 ml

1.5M Tris-HCl 25 ml 25 ml

10 % SDS 1 ml 1 ml

纯水 40.2 ml 31.8 ml

10 %过硫酸铵 500μ1 500μ1

TEMED 33μ1 33 μΐ

总体积 100 ml 100 ml

2.2.3.2 按仪器说明书装好灌胶膜具，倒入凝胶溶液，在每块胶的上面加入纯水以得到平的凝胶上样平面。室温条件下至少聚合 2h。

2.2.3.3 电泳槽中装满电泳缓冲液，并打开恒温水浴系统，调节温度为 15°C。

2.2.3.4将平衡好的 IPG胶条浸入纯水中 1 秒中，以除掉多余的平衡缓冲液，将胶条放在滤纸上除去多余水份。

2.2.3.5 将 IPG胶条小心的放置在 SDS胶面上，并轻压使 IPG胶条与 SDS胶面充分结合，上面覆盖 0.5 %低熔点琼脂糖溶液，使琼脂糖在 5min内凝固。

2.2.3.6 将胶盒插入电泳槽中，开始电泳。

2.2.3.7 SDS 电泳运行条件：使用 SE600 电泳仪，具体方法如下：温度， 15°C ; 电流时间， 10mA/胶， 15min; 25mA/胶， 3-4 hours。 2.2.3.8 当溴酚蓝迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。

2.3染色和图像分析

2.3.1 染色

电泳完成后用新鲜配制的考马斯亮蓝染色液工作液 (0.1 %)，染色 4h 或过夜，用脱色液脱色直至背景干净。

2.3.2. 凝胶图像采集和图像分析

采用 GS-800 图像分析系统对二维电泳凝胶扫描，利用 PDQuest 7.0软件 (Bio-Rad)进行凝胶图像分析。

2.4Western blot

2.4.1 转印过程：

2.4.1.1 SDS 电泳完成后，将胶切角标示后，以适量的转移缓冲液将凝胶在室温平衡 15min。

2.4.1.2 戴上手套，切 6张滤纸和 1张 PVDF膜，大小与胶相同，并将滤纸浸泡在转移缓冲液中。

2.4.1.3 以 100 %甲醇湿润 PVDF膜 15秒，然后转入纯水中浸润 3min，最后在转移缓冲液中平衡 15min。

2.4.1.4 组装转运三明治，由负极到正极依次为：滤纸 -凝胶 -PVDF膜-滤纸。

2.4.1.5 将三明治放入转运仪中，根据凝胶面积按 0.65mA/cm²，接通电源，电转移时间根据具体情况来决定。

2.4.1.6 转运结束后，用丽春红 S染色。

2.4.1.7 PVDF膜充分漂洗后，进行特异性抗体杂交，显色。

2.4.1.8 膜的封闭：将膜放入塑料袋中，根据滤膜面积加入 1 %封闭液， 4°C封闭过夜。 2.4.1.9 一抗与 PVDF 膜孵育：将大肠癌患者血清或正常人血清以 1 : 200 的浓度与 PVDF膜孵育。

2.4.1.10 漂洗： TBST洗涤两次，每次 lOmin; 0.5 %的封闭液洗涤两次，各 10min。 2.4.1.11 POD标记二抗与 PVDF膜孵育：根据滤膜面积加入二抗稀释液，平放在平缓摇动的平台上于室温温育 30min。

2.4.1.12漂洗：用大量 TBST洗涤 4次，每次 15min。

2.4.2 显色过程：将膜暴露在检测试剂中后，必须快速进行显色反应，以免发光反应消退。所有的过程必须在暗室中进行。 2.4.2.1 将一个透明的、与膜大小相同的透明塑料袋中装满清洗液，然后将膜放入袋中，用 10ml的玻璃移液管轻轻滚动以赶出多余的液体。

2.4.2.2加入预先混合好的检测液。

2.4.2.3 将膜插入显色盒中，蛋白面朝上。

2.4.2.4 关灯，将一张胶片放在膜上，并关上显色盒。曝光 10-60s。

2.4.2.5 马上换一张新的胶片放在膜上，关上显色盒，并将刚才曝光的胶片进行显色。显色过程中，可以打开红光监测。

2.4.2.6 从第一张胶片的信号强度上推测第二张胶片的适宜曝光时间。发光反应在 1- 2min后就达到高峰，并且持续 20-30min， lh后，信号强度会下降至高峰的 60-70 %。如果信号太强，可以等待 lOmin后，在进行第二次曝光。

结论：应用免疫蛋白组学的方法，通过设置 OA、正常人和 SLE血清对照后筛查出特异性与 RA血清反应的 12个滑膜组织蛋白点作为 RA备选抗原，详见图 1-图 6。

3、从 RA备选抗原中鉴定出过氧化物还原酶 IV及其差异表达和病变组织分布

3.1 MALDI-TOF/TOF质谱鉴定

3.1.1 酶解消化

3.1.1.1 考马斯亮蓝染色凝胶的脱色：将电泳染色后凝胶中的蛋白点切下，用干净的解剖刀将凝胶切成 l-2mm²大小，用超纯水清洗几次后，用含 50%乙腈， 25 mmol/L NH₄HC0₃ 溶液浸泡胶点，振荡 20min后弃去溶液，重复 1〜2次至胶点中蓝色褪尽。

3.1.1.2 酶切：真空离心干燥约 20min，使胶片完全脱水体积縮小，加入 5〜10 μ 1胰酶溶液 (0.01 g/ l，含 25mmol/L NH₄HC0₃)， 4°C放置 20-30min，待酶液完全吸收，补充 5-10 μ 1 25mmol/L NH₄HC0₃， 37 °C保温 15h。

3.1.1.3 肽提取：加 5 % TFA 50〜100 μ 1于 40°C保温 lh，吸出上清，加入 2.5 % TFA, 50 %乙腈 50-100 μ 1于 30°C保温 lh，吸出上清，合并上清液，冰冻干燥。干燥后样品用 3〜 5 μ 1 0.5 %的 TFA溶液溶解。样品用 C18 Ziptip(Millipore, USA)脱盐，脱盐步骤按照说明书操作。

3.1.2 MALDI-TOF/TOF 分析：将酶切好样品送北京华大基因组公司，采用 MALDI- TOF/TOF质谱的方法分析。

3.1.3 数据库查询及参数设定：

如图 7 显示，最大允许的肽质量数误差为： 400ppm; 每条肽考虑一次不完全切割；等电点的范围为： 3-10; 采用 Mascot和 NCBI BLAST进行序列的同源性分析。 3.2过氧化物还原酶 IV单抗凝胶电泳法验证质谱鉴定

一维验证：从液氮中取出冻存的组织，精确称重后按 l:10(w/v)加入 RIPA裂解液。冰浴下充分研磨匀浆，将匀浆液吸入一 1.5mL离心管中，置冰上裂解 60min。 4°C离心， 12000g X 60min。取上清并分装， -70°C冻存备用。样品溶液的蛋白定量（同前述方法）。配制 10% 分离胶和 5 %积层胶；上样前样品处理：根据蛋白定量调整蛋白浓度，蛋白样品上样量为 50mg (总体积 20mL)。电泳：积层胶电压 80V，分离胶电压改 120V。用 Abeam公司鼠抗人过氧化物还原酶 IV单克隆抗体作为一抗，北京中杉生物技术公司辣根酶标记山羊抗人 IgG (H+L) 为二抗，电转膜，杂交，显影等步骤同前述方法。结果详见图 8。

结果：图 8-A 显示了过氧化物还原酶 IV单抗一维验证质谱鉴定结果， 1、 2 分别为两个不同 RA患者滑膜组织； 3、 4为 Hela细胞阳性对照；从而证实质谱鉴定的 5号蛋白点在不同 RA滑膜组织中均有表达。

二维验证：用上述二维凝胶电泳相同的方法分离 RA 组织蛋白点，转膜后孵育 Abeam 公司鼠抗人过氧化物还原酶 IV单克隆抗体，显影后与 RA 血清杂交后出现的蛋白点位置比对。

结果：图 8-B 为过氧化物还原酶 IV单抗二维验证质谱鉴定结果，过氧化物还原酶 IV单抗与 RA滑膜组织反应点与图 2 RA血清反应的 5号点位置相同；说明在 RA血清中确实存在能与滑膜组织反应的过氧化物还原酶 IV抗体。

3.3过氧化物还原酶 IV在 RA和 OA滑膜组织中的差异表达

SDS-PAGE 电泳：采用 3.2 中同样方法制备 RA和 OA 蛋白样品。电泳：积层胶电压 80V, 分离胶电压改 120V。电转膜，杂交，显影等步骤同前述方法。结果详见图 9。

结果：图 9显示过氧化物还原酶 IV在 RA滑膜组织中表达明显高于 ΟΑ,1、 2分别为 RA 和 OA滑膜组织，上方条带为 β -actin内参（42Kd)，下方为目的条带（31Kd);

3.4过氧化物还原酶 IV在病变组织中分布

免疫组化染色采用 Power Vision TM二步法，按说明书使用方法进行操作，具体方法如下：

3.4.1 石蜡包埋组织切片（4 μ ηι〜5 μ ηι)， 60°C烤箱加热 24h。

3.4.2 二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化。纯二甲苯脱蜡两次（分别为 5min、 7min)， 100%、 100 %、 95 %、 80 %、 70 %梯度酒精水化至水。

3.4.3 PBS浸泡 5min X 2，滴加 3 %甲醇 -H₂0₂封闭，室温 10min，消除内源性过氧化物酶。 3.4.4 PBS 浸泡 5minX 3，微波抗原修复， 0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH=6) 浸泡，微波炉内加热，中档 6min，间歇 2min，低档 5min，室温冷却 20min。

3.4.5 5 %正常山羊血清室温封闭 10min。

3.4.6 倾去血清，加入 1:50 稀释的过氧化物还原酶 IV单抗，湿盒内 4°C冰箱过夜。用 PBS代替一抗作为阴性对照。

3.4.7 PBS浸泡， 5min X 3，滴加 Power VisionTM复合物 50 μ L， 37°C孵育， 30min。

3.4.8 PBS浸泡， 5min X 3， DAB显色，使用 DAB显色试剂盒， A、 B、 C液各一滴加入 0.85ml蒸馏水中，充分混匀后加至玻片，室温显色 10min。

3.4.9 自来水冲洗，苏木素复染 15s〜30s， 1 %盐酸酒精分化，饱和碳酸锂蓝化。

3.4.10 常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、 DPX封片保存。

3.4.11 显微镜下观察，照相。结果详见图 10。

图 10-A、 B (分别 100 X和 200 X ) 显示 RA滑膜组织 HE染色，表现为滑膜细胞增生，滑膜组织中大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主；图 10-C、 D (分别 100 X和 200 X ) 显示，过氧化物还原酶 IV在滑膜组织中的分布，免疫组织化学染色证实过氧化物还原酶 IV主要表达于滑膜细胞胞浆；

3.5过氧化物还原酶 IV抗原体外特异性剌激 RA外周血单核细胞增殖

3.5.1 ³H-TdR掺入法

应用淋巴细胞分离液分离 RA、 SLE、皮肌炎、硬皮病、 OA及正常人外周血单核细胞，按照 2 X 10⁵/孔在 96 孔锥形板中培养。分别设置未刺激、过氧化物还原酶 IV抗原刺激 (50ug/mL) 和 PHA刺激阳性对照组，共培养 3天。各组细胞于终止培养前 18〜24h掺入 ³H-TdR 3.7 X 10⁶ Bq/孔，到达相应的观察时间点后终止培养，弃上清，用多头细胞收集仪收集样品于玻璃纤维滤纸上，烘干。将收集了不同样品的滤纸分别夹入液闪瓶，加入闪烁液，在 β液闪仪中测每分钟脉冲计数值（cpm)。 PBMC增殖刺激指数 stimulation index (SI=待测样本 cpm/阴性对照 cpm) (详见图 11 ) 表示。

3.5.2 CFSE标记流式细胞术检测 PBMC增殖

新鲜分离的 RA患者及各对照组外周血单个核细胞细胞数调至 8 X 10⁶/L,700g X 5分钟离心后，用 1ml含 5%FBS的 0.01M PBS重悬。 CFSE (贮存浓度 10 mmol/L) 用 DMSO稀释至 5mmol/L, 取 l.lul CFSE工作液加入 llOul 0.01M PBS中，再逐滴的加入到细胞中，混匀，置 37°C孵育 10 min后，加入 10ml含 5%FBS的 0.01M PBS终止反应。 700g X 5分钟离心去上清，充分上述操作 3次。 RPMI1640完全培养液悬浮细胞,调整细胞数为 2X 10⁵/L。接种 96孔板，每孔 200 Lo 每个样品各设 3个过氧化物还原酶 IV刺激孔（50ug/孔），3个阴性对照孔 ( 50ul 0.01M PBS ) 和 3个 PHA刺激孔 (25 mg/L) ,37°C、 5%C0₂继续培养 3d。应用流式细胞仪（Beckman FC500 ) 将每个样品分析 10 000个细胞。获取的数据经 Cell Quest 软件分析。首先通过前散射（FS ) 和侧散射（SS ) 二维散点图,划出淋巴细胞区。所得结果用柱状图显示，如图 12。

结论： ³H-TdR 掺入法和 CFSE标记流式细胞术两种方法同时证实过氧化物还原酶 IV抗原体外特异性刺激 RA外周血单核细胞增殖，说明过氧化物还原酶 IV为 RA特异性抗原。 3.6过氧化物还原酶 IV抗原体外特异性剌激 RA外周血单核细胞分泌 IL-17A、 TNF- α和 INF- γ

新鲜分离的 RA患者及各对照组外周血单个核细胞， 48孔板培养，每孔 1 X 10⁶/L，每个样品各设 3个过氧化物还原酶 IV刺激孔（50ug/孔），3个阴性对照孔（50ul 0.01M PBS ) 和 3个 PHA刺激孔（25 mg/L) , 37 °C、 5% C0₂培养 3d。 12000rpmX 5分钟 4°C离心，收集上清。按照如下预包被人 IL-17A、 TNF- α和 INF- Y ELSIA 试剂盒说明书进行操作：加入稀释好后的标准品 50ul于反应孔、加入待测样品 50ul于反应孔内。立即加入 50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀， 37 °C温育 1小时。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入 80ul的亲和链酶素 -HRP, 轻轻振荡混匀， 37°C温育 30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入底物 A、 B各 50 L，轻轻振荡混匀， 37 V温育 10分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入 50 L终止液，加入终止液后应立即测定结果。在 450nm波长处测定各孔的 OD 值。根据标准曲线，计算线性回归方程，最终得出检测样本各细胞因子浓度。如图 14所示， A、 B、 C分别表示 INF- y、 IL-17A和 TNF- a，结果显示，过氧化物还原酶 IV抗原体外刺激 RA PBMC 分泌与 RA 发病相关细胞因子， IL- 17A、 TNF- a和 INF- γ。而不刺激 ΟΑ、正常人及 SLE等其他自身免疫性疾病患者 PBMC 分泌上述细胞因子。

结论：过氧化物还原酶 IV抗原体外特异性刺激 RA患者 PBMC分泌 IL-17A、 TNF- a和 INF- Y。 IL-17A、 TNF- a和 INF- Y均为参与 RA疾病发生的重要细胞因子，说明过氧化物还原酶 IV为 RA特异性的疾病相关性抗原。

在上述实施例的基础上针对过氧化物还原酶 IV抗原进行改造等方式制备疫苗可能为 RA 的特异性免疫治疗提供新的手段。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

权利要求书

1. 过氧化物还原酶 IV在制备类风湿关节炎特异性抗原中的应用。

2. 根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于：所述过氧化物还原酶 IV抗原、表位肽、免疫复合物及其抗体在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用。

3. 根据权利要求 2所述的应用，其特征在于：所述过氧化物还原酶 IV抗原、表位肽、免疫复合物及其抗体在制备类风湿关节炎早期诊断试剂中的应用。

4. 根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于：过氧化物还原酶 IV在制备类风湿关节炎疫苗中的应用。