CN104130328B - 抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株ES，保藏号为：CCTCC NO:C201414，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2014年01月07日的杂交瘤细胞分泌的。该单克隆抗体能与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白发生特异性结合。本发明通过流式细胞仪分选血细胞得到的中华绒螯蟹颗粒血细胞，经细胞裂解得颗粒血细胞细胞膜蛋白，通过电泳切胶回收提纯颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白作为抗原免疫小鼠，采用细胞融合方法制备杂交瘤细胞，经免疫学检测方法筛选出抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体，然后采用免疫学鉴定方法鉴定其特性。

Description

抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体 及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种由杂交瘤细胞分泌的抗中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体及其制备方法，属于蟹类细胞免疫学技术领域。

背景技术

蟹类不具有高等动物完善的特异性免疫系统，缺乏免疫球蛋白，其免疫防御反应主要依赖血细胞及血淋巴中的酶和免疫因子完成。研究表明血细胞可利用吞噬、包埋、伤口修复、渗透调节、胞吐、自溶等方式识别清除外来异物，通过合成释放凝集素、溶菌素、水解酶、氧化酶等协助完成体液免疫过程，在蟹类抵御外界环境刺激和外来病原物入侵过程中发挥关键作用。目前根据细胞化学、形态学及功能方面将蟹类血细胞分为两大类：颗粒血细胞和透明血细胞。颗粒血细胞胞质颗粒较多，核质比小，而透明血细胞胞质颗粒较少或没有，核质比大；此外，两类细胞在功能上有所区别，通常情况下，颗粒血细胞能够释放溶菌酶、吞噬素、酚氧化酶、葡糖苷酸酶等，透明血细胞能够产生活性氧，可以直接参与对外来异物的吞噬。因为尚无合适的分子标记物跟踪水产蟹类体内两类血细胞的发生和参加免疫反应的过程，故目前在蟹类两类血细胞的功能和发生过程等研究方面并无确切定论。单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强、性质均一等特点在免疫细胞的研究中早已应用，但在水产蟹类血细胞的研究中应用较少，因此中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白单克隆抗体的制备为研究颗粒血细胞在中华绒螯蟹非特异性免疫系统中的作用提供了有力工具；利用该单抗可验证其它虾蟹类动物血细胞是否具有共同抗原决定簇，此外，研究表明，蟹类受外来病原和环境刺激时, 其血细胞总数会发生显著变，以中华绒螯蟹颗粒血细胞单克隆抗体为基础建立的酶联免疫检测技术，可以通过监测水产养殖生产中蟹类血细胞数量的变化，进而评估生产实践中中华绒螯蟹体质及抗逆状况。

发明内容

本发明目的之一是提供一种由杂交瘤细胞分泌的抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体。

本发明另一个目的是提供上述抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体的制备方法。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株ES，保藏号为：CCTCC NO: C201414，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2014年01月07日的杂交瘤细胞分泌的。倒置显微镜下观察该杂交瘤细胞生长状态良好，表现为：细胞透亮、个体浑圆、外观饱满、大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞具有无限分裂增殖能力；常规条件下培养该杂交瘤细胞，当培养液颜色由桃红色转为黄色，培养液中即含有该杂交瘤细胞分泌的抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体。

该单克隆抗体能与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白发生特异性结合，与所述的单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于中华绒螯蟹颗粒血细胞分子量为30.9kDa的蛋白上。

一种所述抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体的制备方法，其步骤如下：抽取中华绒螯蟹血淋巴，离心得到全血细胞；全血细胞经流式细胞仪分选得到中华绒螯蟹颗粒血细胞；颗粒血细胞经细胞裂解液、超声波破碎、离心得颗粒血细胞细胞膜蛋白；以中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白为样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对30.9kDa蛋白条带进行蛋白提纯；以提纯的中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白作为抗原，免疫Balb/C小鼠；取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；间接酶联免疫吸附法筛选阳性杂交瘤细胞株；对阳性杂交瘤细胞株进行克隆，最后筛选得到一株能稳定分泌抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株ES；其分泌的抗体为抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体（简称：单抗ES），经激光共聚焦法、流式免疫荧光法和转印免疫印迹法验证其特性。

所述的流式细胞仪分选血细胞是将中华绒螯蟹全血细胞经流式细胞仪分选，得到的两团细胞中居散点图中间的一团即为颗粒血细胞。

所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫吸附法，将融合杂交瘤细胞上清液分别与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白反应，而后加入碱性磷酸酶（AP）标记羊抗小鼠IgG抗体，酶标仪OD_492nm条件下记录、筛选抗颗粒血细胞细胞膜的单克隆抗体，即杂交瘤细胞株ES。其中结合中华绒螯蟹颗粒血细胞悬液的流式免疫荧光，颗粒血细胞血滴片激光共聚焦反应结果和转印免疫印迹法综合确定：该单抗与中华绒螯蟹蟹颗粒血细胞细胞膜发生特异性结合反应。

所述的免疫学鉴定方法是流式免疫荧光法、激光共聚焦法和转印免疫印迹法，流式免疫荧光法是将制备的单克隆抗体与中华绒螯蟹颗粒血细胞悬液反应，而后避光条件下加入异硫氰荧光素（FITC）标记羊抗小鼠IgG抗体，流式细胞仪检测验证制备的单克隆抗体为抗中华绒螯蟹颗粒血细胞的单克隆抗体；激光共聚焦法是将单抗ES与中华绒螯蟹颗粒血细胞血滴片反应，而后避光条件下加入异硫氰荧光素（FITC）标记羊抗小鼠IgG抗体，激光共聚焦显微镜检测验证制备的单克隆抗体为抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜的单克隆抗体；转印免疫印记法是将凝胶蛋白进行电转移至硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜浸入制备的单克隆抗体中，而后将其浸入碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗小鼠IgG抗体中，发色液显色观察条带，确定抗原决定簇的分子量。其中中华绒螯蟹颗粒血细胞悬液流式免疫荧光，中华绒螯蟹颗粒血细胞血滴片结果结合转印免疫印迹法结果能够确定单抗ES与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白发生特异性结合反应，且该单抗的抗原决定簇位于分子量为30.9kDa的中华绒螯蟹颗粒血细胞蛋白上。

本发明的优点在于：本发明制备技术路线是通过流式细胞仪分选血细胞得到的中华绒螯蟹颗粒血细胞，经细胞裂解得颗粒血细胞细胞膜蛋白，通过电泳切胶回收提纯颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白作为抗原免疫小鼠，采用细胞融合方法制备杂交瘤细胞，经免疫学检测方法筛选出抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体，然后采用免疫学鉴定方法鉴定其特性，此技术路线设计缜密，充分利用多种免疫学检测方法发挥其筛选鉴定的作用。本发明采用了间接酶联免疫吸附法筛选杂交瘤细胞株，该法利用酶标抗体作为第二抗体，反应快速灵敏，可检测大量样品，有效节约时间。同时，本发明采用流式免疫荧光法验证单抗特性，流式细胞术利用荧光做探针标记抗体，能够快速、准确、定量获得有关抗原抗体反应的成分比例，并且可避免实验过程中由于人为或主观因素等造成的不确定性和实验假象，该方法显示中华绒螯蟹颗粒血细胞荧光比例为73.4%，结果确认单抗ES与中华绒螯蟹颗粒血细胞发生特异性结合反应真实存在。本发明采用激光共聚焦检测单抗特性，结果判断直观，利用了颗粒血细胞血滴片，进一步确认单抗ES与颗粒血细胞细胞膜发生特异性结合的反应。此外，本发明采用转印免疫印迹法确认单抗ES结合的抗原决定簇位于中华绒螯蟹颗粒血细胞分子量为30.9kDa的蛋白上。综合本发明的间接酶联免疫吸附检测结果、流式免疫荧光结果、激光共聚焦结果和转印免疫印迹结果可知与单抗ES发生特异性结合的抗原决定簇位于中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白上，且该蛋白的分子量为30.9kDa，此外，可应用该单抗验证其它虾蟹类动物（例如：日本板蟹、珍宝蟹、南美白对虾、中国对虾等）血细胞是否具有共同抗原决定簇；通过监测养殖生产过程中中华绒螯蟹颗粒血细胞数量变化，进而评估生产实践中中华绒螯蟹体质及抗逆状况，对于水产养殖生产具有重要的的应用价值和实际意义。

附图说明

图1为本发明的经流式细胞仪分选后的两团细胞群和各团细胞悬液对应吉姆萨染色的结果图。

图2为本发明的单克隆抗体流式免疫荧光法检测的结果图。

图3为本发明的单克隆抗体激光共聚焦检测的结果图。

图4为本发明的单克隆抗体转印免疫印迹检测的结果图。

图5为验证本发明的单克隆抗体与中华绒螯蟹透明血细胞和日本板蟹颗粒血细胞是否具有共同抗原决定簇的结果图。

图1所示：A图中R1、R2所示分别为经流式细胞仪分选后的两团细胞；B图和C图分别为R1和R2各类细胞对应的吉姆萨染色结果。其中H代表透明血细胞；G代表颗粒血细胞。

图2所示：A图为经流式细胞仪分选后的中华绒螯蟹颗粒血细胞；B图为经骨髓瘤细胞上清液反应的中华绒螯蟹颗粒血细胞悬液和经单抗ES反应的中华绒螯蟹颗粒血细胞悬液流式检测的直方图（已叠加）。其中G代表颗粒血细胞；N为阴性；P为阳性；G=73.4%代表颗粒血细胞的荧光比例。

图3所示：A图为中华绒螯蟹颗粒血细胞血滴片与骨髓瘤细胞上清液反应（阴性对照）后激光共聚焦显微镜检测的结果图（A1：DAPI通道；A2：FITC通道；A3：Merge通道）；B图为中华绒螯蟹颗粒血细胞血滴片与单抗ES反应后激光共聚焦显微镜检测的结果图（B1：DAPI通道；B2：FITC通道；B3：Merge通道）。

图4所示：M为标准分子量蛋白电泳、转印后的丽春红染液染色结果；A为中华绒螯蟹颗粒血细胞电泳后的考马斯亮蓝染液染色结果；B为提纯的中华绒螯蟹颗粒血细胞30.9kDa蛋白电泳后的考马斯亮蓝染液染色结果；C为本发明的单抗ES与转印后的颗粒血细胞反应结果；D为骨髓瘤细胞上清液与转印后的颗粒血细胞反应结果（阴性对照）。

图5所示：A图为经流式细胞仪分选后的中华绒螯蟹透明血细胞；B图为经骨髓瘤细胞上清液反应的中华绒螯蟹透明血细胞悬液和经单抗ES反应的中华绒螯蟹透明血细胞悬液流式检测的直方图（已叠加）；C图为经流式细胞仪分选后的日本板蟹颗粒血细胞；D图为经骨髓瘤细胞上清液反应的日本板蟹颗粒血细胞悬液和经单抗ES反应的日本板蟹颗粒血细胞悬液流式检测的直方图（已叠加）。其中G代表颗粒血细胞，H代表透明血细胞；N为阴性；P为阳性；H=59.8%代表中华绒螯蟹透明血细胞的荧光比例，G=81.2%代表日本板蟹颗粒血细胞的荧光比例。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

1. 流式细胞仪分选中华绒螯蟹全血细胞

（1）取5~6只体表干净、活力旺盛、健康无病的中华绒螯蟹，用5mL无菌注射器吸取4℃预冷抗凝剂（0.14M NaCl；3mM KCl；1.5mM KH₂PO₄；8mM Na₂HPO₄；20mM EDTA；pH 7.3），按1:2（v/v）从游泳足基部软膜处抽取血淋巴，混匀；混合液于4℃，1500rpm，离心5min，磷酸盐缓冲液重悬血细胞沉淀，并调整悬液浓度至10⁸cells/mL。

（2）将此全血细胞悬液利用流式细胞仪分选，回收各类细胞。

（3）将全血细胞及分选后的细胞分别于4℃，1200rpm，离心5min，磷酸盐缓冲液重悬各类血细胞沉淀，并调整悬液浓度至10⁷cells/mL。

（4）取各类细胞悬液30μL滴加到载玻片上，使其自然形成单层血细胞血滴片，湿盒中沉降3~4h，晾干，丙酮固定15min。

（5）将制作好的各类血细胞血滴片进行吉姆萨染色，观察比较各类细胞形态。

流式细胞仪分选细胞如图1-A所示：R1、R2分别代表两类不同的细胞团，对两团细胞分别进行回收，经吉姆萨染色可知：R1代表颗粒血细胞（图1-B），核质比较小，胞质内颗粒较多；R2代表透明血细胞（图1-C），核质比较大，胞质内颗粒较少或没有。

实施例2：抗原的制备

中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白的提取：

（1）将流式细胞仪分选细胞后得到的颗粒血细胞用磷酸盐缓冲液重悬（调整浓度为10⁸cells/mL），于4℃，1000rpm，离心10min；

（2）弃上清，颗粒血细胞沉淀中加入NP-40细胞裂解液（1% NP-40，10%甘油，0.25M蔗糖，137mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0）和各种蛋白酶抑制剂（2mM EDTA，10mM NaF，5μg/mL Leupetin，2μg/mL Aprotinin，1mM PMSF），血细胞于冰浴条件下进行超声波破碎，39%振幅，设定时间4min，开3s、关7s。

（3）超声波破碎后，4℃梯度离心（1000g，10min；取上清，10000g，10min；取上清，100000g，20min）去除细胞碎片、细胞核、细胞器，最后一次离心后，取沉淀，磷酸盐缓冲液重悬，即为中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白溶液。

2. 中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的提取：

（1）将上述蛋白溶液与电泳样品缓冲液（0.5M Tris-HCl pH6.8；1%十二烷基磺酸钠；1%疏基乙醇；10%甘油；0.01%溴酚蓝）等体积混合均匀，煮沸5min，冷却。

（2）准备好电泳仪（Mini-PROTEAN II，Bio-Rad），配制电泳缓冲液（0.025M Tris-Base；0.25M 甘氨酸；0.1 %十二烷基磺酸钠；pH 8.3），利用12%分离胶和5%浓缩胶进行电泳。

（3）将冷却后的样品（每孔15mL）加入上样孔，加电泳缓冲液于上下电泳槽内，起始电流30mA，4℃条件下稳流电泳，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，调节电流60mA恒流。

（4）溴酚蓝指示剂距离底部边缘1cm时停止电泳，取出凝胶。

（5）将凝胶放入ZnSO₄可逆染色液（75mM ZnSO₄，75mM 咪唑，250mM NaCl，pH 2.0）中，注意将凝胶完全浸没，振荡染色5min，直至条带清晰。

（6）取出凝胶，于黑背景光照条件下观察蛋白带，找到30.9kDa蛋白带，小心切下放入饱和EDTA水溶液中，振荡脱色20min，待条带颜色消失，用超纯水反复冲洗条带5~6次。

（7）将条带切成1mm³小块，装入透析袋，加入洗脱缓冲液（50mM NH₄HCO₃；0.1%十二烷基磺酸钠），放入盛满洗脱缓冲液的电洗脱仪（Model 422，Bio-Rad）中，设置10mA恒流洗脱过夜。

（8）洗脱结束后，取出透析袋，吸出透析袋中的缓冲液加入新透析袋中，用合适体积的洗脱缓冲液将旧透析袋清洗一遍，吸出缓冲液一并加入新透析袋，浸入超纯水中透析，每4h更换透析液，共透析48h。

（9）透析结束后，利用冷冻干燥机（PowerDry LL3000，Heto-holten）将蛋白样品（即中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白）冻干浓缩至干粉状，-80℃超低温冰箱保存。

实施例3：抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白单克隆抗体的制备

1. 免疫小鼠

（1）将提纯的颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白用无菌磷酸盐缓冲液调整浓度为1mg/mL，与弗氏完全佐剂等体积混合，腹腔注射4周龄雌性Balb/C小鼠（0.1mL）。

（2）2周后，将该蛋白悬液与弗氏不完全佐剂等体积混合，腹腔注射0.1mL。

（3）1周后，尾静脉直接注射蛋白悬液0.1mL。

（4）1周后，尾静脉注射蛋白悬液0.1mL。

2. 细胞融合

（1）最后一次免疫后3天，脱颈椎处死小鼠，心脏抽血（4℃保存备用），无菌取脾脏，RPMI-1640溶液洗涤研磨，研磨液于1000rpm，离心4min，弃上清，RPMI-1640溶液重悬脾细胞沉淀备用。

（2）脱颈椎处死小鼠，无菌取胸腺，RPMI-1640溶液洗涤研磨，研磨液于800rpm，离心4min，弃上清，RPMI-1640溶液重悬胸腺细胞沉淀备用。

（3）取已培养好的SP2/0骨髓瘤细胞，弃培养基，RPMI-1640溶液重悬瘤细胞，于1200rpm，离心3min。

（4）弃上清，RPMI-1640溶液重悬骨髓瘤细胞沉淀并与（1）脾细胞悬液混合，1200rpm离心4min，弃上清，吸净剩余液体。

（5）轻击离心管底部，使两种细胞沉淀充分混合成糊状，吸取37℃预热的聚乙二醇1mL，1min内均匀滴入离心管底部，继而在90s内以先慢后快的方式连续滴入37℃预热的RPMI-1640溶液15mL，37℃水浴静置5min，之后于800rpm离心5min。

（6）弃上清，细胞沉淀用3mL GIT细胞培养液重悬，冻存2mL。

（7）取出（2）备用的胸腺细胞悬液，加入到（6）剩余的细胞悬液中，补加含2%HAT的GIT细胞培养液，混匀后滴加到96孔细胞培养板中。

（8）将培养板放入37℃、CO₂浓度为5%的培养箱中培养8~10天，倒置显微镜观察杂交瘤细胞的生长状况。

3. 间接酶联免疫吸附法筛选阳性杂交瘤细胞株

（1）将中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白用无菌磷酸盐缓冲液调整浓度为1mg/mL，加入到酶标板中（每孔100μL）并加入0.5M EDTA（每孔50μL），4℃过夜。

（2）弃上清，加入2%牛血清白蛋白（每孔100μL），于37℃恒温1h。

（3）弃上清，磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min，加入杂交瘤细胞上清液（每孔100μL），阳性对照为免疫小鼠血清，阴性对照为骨髓瘤细胞上清液，于37℃恒温1h。

（4）弃上清，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤三次，每次5min，加入碱性磷酸酶（AP）标记羊抗小鼠IgG抗体（每孔100μL），于37℃恒温1h。

（5）弃上清，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤三次，每次5min，加入1mg/mLpNPP（每孔100μL），暗处反应15min。

（6）直接加入2M NaON（每孔50μL），稳定3~5min，于OD_492nm酶标仪检测。

结果：中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白和阳性杂交瘤细胞上清结合，再结合碱性磷酸酶（AP）标记羊抗小鼠IgG抗体，将OD_492nm接近1，P/N大于2.1的杂交瘤细胞株视为阳性，将阳性杂交瘤细胞群落记录，并做进一步克隆。

4. 有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞株

（1）脱颈椎处死小鼠，无菌取胸腺，RPMI-1640溶液洗涤研磨，研磨液于800rpm，离心4min，弃上清，沉淀用含2%HAT的GIT细胞培养液重悬，备用。

（2）打散杂交瘤细胞株群落，血球计数板计数，将100个阳性杂交瘤细胞置于10mL含2%HAT的GIT细胞培养液中，混匀后滴加到96孔细胞培养板中（每孔100µL），将细胞培养板放入37℃，CO₂浓度为5%的培养箱中培养。

（3）培养8~10天后，采用酶联免疫吸附法再次检测并进一步筛选阳性杂交瘤细胞。

结果：经筛选克隆后最终确定一株能分泌抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白的杂交瘤细胞株（杂交瘤细胞株ES），其分泌的单抗与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜发生特异性结合（见表1）。杂交瘤细胞株ES：保藏号为：CCTCC NO: C201414，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2014年01月07日。

表1 本发明的单克隆抗体间接酶联免疫吸附法检测的结果

阳性杂交瘤细胞株	OD492nm	P/N
			ES	1.029	3.611
阴性对照	0.285

*P/N代表阳性杂交瘤细胞上清液OD_492nm与阴性对照OD_492nm的比值。

5. 冻存

将杂交瘤细胞株ES从96孔细胞培养板中转移至24孔细胞培养板中，待其处于对数生长期时与含2%HAT的GIT细胞培养液混合均匀，细胞悬液与二甲基亚砜细胞冻存液按体积比9:1混匀后迅速置于冻存管内，-80℃超低温冰箱或液氮冻存。

实施例4：流式免疫荧光法验证单克隆抗体的与颗粒血细胞发生特异性结合

（1）将流式细胞仪分选后的颗粒血细胞进行回收，于4℃，1200rpm，离心5min，磷酸盐缓冲液重悬颗粒血细胞沉淀，并调整悬液浓度至10⁸cells/mL。

（2）取1mL颗粒血细胞悬液加入24孔细胞培养板中，加入单抗ES（每孔1mL），阴性对照为骨髓瘤细胞上清液，37℃孵育50min。

（3）重悬颗粒血细胞悬液，于1200rpm，离心5min，弃上清，细胞沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，调整浓度为10⁸cells/mL，分别于避光条件下加入异硫氰荧光素（FITC）标记羊抗小鼠IgG抗体1mL，37℃孵育50min。

（4）避光条件下，于1200rpm，离心5min，弃上清，细胞沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，调整各细胞浓度为10⁷cells/mL，经流式细胞仪检测。

结果：中华绒螯蟹颗粒血细胞经骨髓瘤细胞上清液反应后荧光比例较低，视为自发荧光（阴性对照）；颗粒血细胞经单抗ES反应后，荧光比例显著升高，为73.4%（图2-B），表明本发明的单抗ES与中华绒螯蟹颗粒血细胞发生特异性结合。其中如图所示：A图为经流式细胞仪分选后的中华绒螯蟹颗粒血细胞；G代表颗粒血细胞；N代表阴性；P为代表阳性

实施例5：激光共聚焦技术验证单克隆抗体的特异性结合

（1）将流式细胞仪分选后的颗粒血细胞于4℃，1200rpm，离心5min；4%多聚甲醛重悬颗粒血细胞（调整浓度为10⁶cells/mL）。

（2）将颗粒血细胞悬液30μL滴加到APES处理过的干净载玻片上，使其形成单层颗粒血细胞血滴片，于37℃恒温20min。

（3）磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min，用含0.5%TritonX-100的磷酸盐缓冲液（PBS-T）透化10min。

（4）磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min，用含10%山羊血清的PBS-T（每张血滴片30μL）室温封闭45min。

（5）滴加单抗ES（每张血滴片30μL），4℃过夜。

（6）血滴片室温平衡30min，用含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min，滴加异硫氰荧光素（FITC）标记羊抗小鼠IgG抗体（每张血滴片30μL），37℃湿盒中避光孵育1h。

（7）磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min，滴加DAPI（每张血滴片20μL）室温孵育5min。

（8）磷酸盐缓冲液连续洗涤3次，滴加抗淬灭剂（每张血滴片10μL），封片，激光共聚焦显微镜观察。

结果：中华绒螯蟹颗粒血细胞在DAPI的作用下，细胞核呈蓝色（图3-A1、B1）；颗粒血细胞和单抗ES反应后，再结合异硫氰荧光素（FITC）标记羊抗小鼠IgG抗体，细胞膜呈现明亮绿色荧光（图3-B2），阴性对照无荧光出现（图3-A2）。说明单抗ES和中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜发生特异性结合。其中如图所示：A3、B3图为DAPI通道和FITC通道复合成的Merge通道图。

实施例6：转印免疫印迹法测定抗原决定簇的分子量

1. 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）采用（实施例2）的方法对中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白和颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白进行电泳，得到的两块颗粒血细胞细胞膜蛋白凝胶其中一块用考马斯亮蓝R250染液染色；另一块用来做免疫印迹。

（2）取出用于染色的凝胶，将其放入2%甲醇和7.5%醋酸混合液组成的前固定液中固定45min，取出凝胶放入考马斯亮蓝R250染液中染色3~4h。

（3）将凝胶放入5%甲醇和7%醋酸混合液组成的脱色液中脱色至蛋白带清晰可见。

（4）将凝胶用全自动凝胶成像分析系统进行扫描，照相。（图4-A为颗粒血细胞电泳图谱，图4-B为颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的电泳图谱）。

2. 电转移

（1）以电转移缓冲液（0.025M Tris-Base；0.20M 甘氨酸；20%甲醇；pH 8.35）将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜润湿，与另一块凝胶一同放置在两块相同大小的滤纸之间，注意排除各部分之间的气泡。

（2）用电转移缓冲液润湿的泡沫垫将上述体系夹在中间，最外层用两块有机玻璃板支持，将此体系置于装有电转移缓冲液的电泳槽内。

（3）硝酸纤维素膜面向阳极，恒流200mA，电转移5h。

3. 转印免疫印迹

（1）取出硝酸纤维素膜，用磷酸盐缓冲液洗涤15min，用5%牛血清白蛋白溶液封闭，4℃过夜。

（2）取出硝酸纤维素膜，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min，将硝酸纤维素膜完全浸没于单抗ES中，阴性对照为骨髓瘤细胞上清液（完全浸没于纵向剪取的一部分硝酸纤维素膜），37℃孵育50min。

（4）取出硝酸纤维素膜，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min，将硝酸纤维素膜完全浸没于碱性磷酸酶（AP）标记羊抗小鼠IgG抗体中，37℃孵育50min。

（5）取出硝酸纤维素膜，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min，将硝酸纤维素膜置于碱性磷酸酶发色液（NBT-BCIP溶液）中发色至条带清晰可见，蒸馏水洗涤硝酸纤维素膜以终止反应，干燥，暗处保存。

结果：本发明的单抗ES识别中华绒螯蟹颗粒血细胞电泳后分子量为30.9kDa的多肽（图4-C），经骨髓瘤细胞反应（阴性对照）的转印后的颗粒血细胞硝酸纤维素膜无条带出现（图4-D）。其中如图所示：M图为标准分子量蛋白电泳、转印后的丽春红染液染色结果；A图为中华绒螯蟹颗粒血细胞电泳后的考马斯亮蓝染液染色结果；B图为提纯的中华绒螯蟹颗粒血细胞30.9kDa蛋白电泳后的考马斯亮蓝染液染色结果。

应用实施例7：检测本发明的单抗ES是否与中华绒螯蟹透明血细胞和日本板蟹颗粒血细胞具有相同的抗原决定簇

（1）按照实施例1的方法抽取中华绒螯蟹和日本板蟹血淋巴，离心、洗涤，经流式细胞仪分选血细胞、回收；分别对分选后的血细胞进行吉姆萨染色，确定颗粒血细胞和透明血细胞。

（2）按照实施例5的方法将中华绒螯蟹透明血细胞和日本板蟹颗粒血细胞与单抗ES反应（阴性对照为骨髓瘤细胞上清液），经流式细胞仪检测。

结果：中华绒螯蟹透明血细胞和日本板蟹颗粒血细胞经骨髓瘤细胞上清液反应后荧光比例较低，视为自发荧光（阴性对照）；中华绒螯蟹透明血细胞经单抗ES反应后，荧光比例显著升高，为59.8%（图5-B）；日本板蟹颗粒血细胞经单抗ES反应后，荧光比例显著升高，为81.2%（图5-D）。表明本发明的单抗ES与中华绒螯蟹透明血细胞和日本板蟹颗粒血细胞均发生特异性结合。其中如图所示：A图为经流式细胞仪分选后的中华绒螯蟹透明血细胞散点图；C图为经流式细胞仪分选后的日本板蟹颗粒血细胞散点图；G代表颗粒血细胞，H代表透明血细胞；N代表阴性；P代表阳性。

实施例8：检测中华绒螯蟹颗粒血细胞数量变化进而确定养殖蟹类的健康

1. 取健康对照组、高温处理组（25℃）、病原菌感染组等各组中华绒螯蟹，每组各50只，用5mL无菌注射器吸取4℃预冷抗凝剂，按1:2（v/v）从游泳足基部软膜处抽取血淋巴，混匀；混合液于4℃，1500rpm，离心5min，得到的血细胞沉淀用与血淋巴等体积量的磷酸盐缓冲液重悬。超声波破碎，破碎液即为待检样品；

2. 将健康对照样品以及高温处理组，患病组的待检样品稀释液包被于酶标板孔内，每孔 100 μl，4℃过夜；

3.弃去孔内液体，PBS-T 洗涤 3 次；加 2%牛血清白蛋白到相应抗原孔内，每孔200 μl，37℃封闭 1 h；

4.弃去孔内液体，PBS-T 洗涤 3 次；将单抗ES加入到相应的抗原孔内，每孔 100μl，37℃孵育 1.5 h；

5. 弃去孔内液体，PBS-T 洗涤 3 次；加碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠抗体（第二抗体），每孔 100 μl，37℃孵育 1 h；

6. 弃去孔内液体，PBS-T 洗 3 次；加 pNPP 底物显色液，每孔 100μl，37℃孵育30 min；

7. 酶标仪 OD_492nm处读数，记录数据。

结果：中华绒螯蟹健康组 7 天内的 OD_492nm值位于 0.581～0.613，各值之间无显著差异；高温组（25℃） 7 天内的 OD_492nm值位于 0.463～0.569，各组值均显著低于健康组的最低值 0.581。健康对照组15 天内的 OD_492nm值位于 0.556～0.591；病原菌感染组在第2～11天内蟹子部分死亡，最终存活率为 44%，15 天内的 OD_492nm值位于 0.234～0.548，显著低于对照组的平均值。 利用本实验多结果，我们认为环境胁迫与健康状态的临界范围为0.57±0.025，高于本范围时蟹子为健康状态；病原菌感染的临界范围为 0.55±0.019，低于本范围时扇贝为病原感染状态。

Claims (1)

1.一种抗中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜30.9kDa蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株ES，保藏号为：CCTCC NO: C201414，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2014年01月07日的杂交瘤细胞分泌的；该单克隆抗体能与中华绒螯蟹颗粒血细胞细胞膜蛋白发生特异性结合，与所述的单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于中华绒螯蟹颗粒血细胞分子量为30.9kDa的蛋白上。