CN114410805B - 一种用于检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的特异性探针及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的特异性探针及应用。本发明在基因的保守区域设计探针序列，利用荧光标记的探针特异性结合目的基因mRNA的原理，引入流式细胞术进行高通量和高精度的自动化测量，可以准确辨识单细胞样点，并定量分析胞内荧光强度，以获得目的基因在mRNA表达水平的量化信息。基于上万样点的结果的准确性、可靠性和重复性远超人工观察计数等常规方法。本发明不需抗体，成本低，基于流式的高通量自动化分析效率高，可靠性好，有很大的应用潜力。

Description

一种用于检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的特异性探针 及应用

本专利申请由天津师范大学生命科学学院/天津市动植物抗性重点实验室完成，得到天津市应用基础与前沿技术研究计划（19JCYBJC29700），天津市水产生态及养殖重点实验室开放基金(TJAE2015005)。

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及一种基于探针序列与目标序列特异性且按比例结合原理，将荧光原位杂交与流式细胞术相结合，进行单细胞水平基因表达测量和细胞分类的自动化检测方法。本方法不依赖抗体，直接根据功能基因的mRNA保守区合成探针序列，先进的流式测量模块进一步避免了“因人而异”的误差，高通量检测能力是本方法大规模应用的效率保障。因此，本发明在理论和实践的分析和检测中都具有很高的应用价值。

背景技术

甲壳动物免疫防御体系由许多重要的免疫应答系统构成。酚氧化酶原(Prophenoloxidase，proPO)激活系统是其体内一种极为重要的免疫反应机制，其酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）的活力与机体的免疫水平密切相关，可用作评价甲壳动物免疫功能强弱的关键指征。贻贝血细胞中的proPO含量是其血淋巴中含量的20倍，而在甲壳动物血淋巴中的proPO几乎全部来自血细胞，特别是其中的颗粒细胞。细菌和酵母等的表面多糖以及钙离子或者胰蛋白酶等物质可以通过丝氨酸蛋白酶间接激活proPO成为具有功能活性的酚氧化酶(phenoloxidase , PO)。

酚氧化酶是一种含有铜的酪氨酸酶( tyrosinase)，能够催化单酚羟化成二酚，进而氧化成化成醌，醌再转化形成黑色素。在黑化包被反应中，这些黑色素与具有细胞毒性的醌类等中间产物聚集到病原附近，从而隔离并杀死病原。proPO激活系统相关蛋白也在宿主非自身识别过程中承担防御反应功能，如识别异物、促使颗粒细胞释放胞内颗粒；产生多种介导凝集的因子及抗菌肽等免疫功能分子进一步发挥免疫作用，如释放调理素、促进血细胞的吞噬和包囊反应等。研究表明中国明对虾被白斑综合征病毒（White spot syndromevirus,WSSV）感染后其酚氧化酶原基因表达水平明显上调。在较高等的无脊椎动物如节肢动物中，除了黑色素形成之外，PO还具有促进角质的硬化和伤口愈合等功能。

流式细胞仪是一种集成了多个学科和领域先进科学原理的高科技测量设备，整合了包括现代免疫荧光技术、流体力学、激光学、应用电子学以及计算机等技术。它可以对细胞大小、长宽、细胞内容物折射情况等进行快速、定量、多参数的检测。借助抗体或探针还可同时用于定量检测胞外抗原或细胞内的核酸量，DNA倍性或开展细胞周期、细胞因子以及黏附分子等分析。细胞亚群分析经常用到各种特异性抗体，借助流式细胞术可以准确辨识荧光标记抗体信号，从而区分不同类型或不同发育分化阶段的细胞。医学血液学分析中的各类血细胞研究主要采用了抗体标记和流式检测相结合的方法。由此可见，一系列特异性抗体或探针在细胞分类和功能研究中具有极其重要的作用。

原位杂交技术于1969年由Pardue和Gall、John率先建立，最初采用了放射性标记的方法，用DNA探针与目标DNA序列接合，经放射自显影显示靶序列在胞内的位置。随着荧光技术体系的发展，Boumam 和 Langer等在1981年首次采用荧光素标记的探针，建立了更为安全的非放射性原位杂交技术。由于原位杂交在胞内定位方面的独特优势，研究者一直在尝试优化、拓展该方法。1989年Delong使用荧光标记寡核苷酸探针检测了单个微生物细胞。为了获得更大的检测通量和更快的检测速度，Marina等2006年使用寡核苷酸作为探针，结合流式细胞术建立了一种分选和富集特定种类细菌的方法（Fluorescence In SituHybridization-Flow Cytometry-Cell Sorting）。2010年黄馨等比较了流式荧光原位杂交法和常规荧光定量PCR对小鼠端粒长度的测量结果，证实两种方法结果基本一致，说明流式-荧光原位杂交（Flow-FISH）方法在基因表达定量分析方面的可行性。

水产动物免疫学研究尚处于初步发展的阶段，免疫分子和防御机制主要通过与脊椎动物的相关研究资料对比开展。无脊椎动物缺乏特异性免疫系统，主要依靠天然免疫机制防御病原入侵，各类血细胞是其免疫系统的基础。甲壳动物免疫学受限于缺乏细胞分类专用抗体以及没有统一的量化标准的短板，因此在血细胞分类及功能研究方面长期存在多种看法，尚未形成统一的观点，也为系统解析其免疫防御机制带来困难。目前最为迫切的是找到一种适应性广、重复性好，而且能够标记细胞类型或细胞功能特异性分子的方法，与这项需求直接相关的标靶是功能基因的mRNA或其翻译的蛋白质产物。检测特定蛋白质主要采用抗体-抗原识别的方式，但是胞内哪些分子具有用作特异识别应用潜力，以及如何筛选到针对其的商业化抗体等关键问题的解决在技术和时间方面都有巨大的不确定性。反观mRNA水平的检测方案，则更具可行性。该方案以序列互补结合为基础，探针与靶序列结合的确定性和牢固性都远高于抗体与抗原的识别与结合，因此只要克隆到部分序列即可合成探针，而且探针序列和检测性能可以根据测试快速调整优化，短时间内即可广泛应用，与抗体方案相比优势十分明显。另一个需要解决的问题是，如何将显示探针信号的分子与特定细胞类群关联，通常来说同一种类的细胞在细外部形态、沉降系数、内部基因表达谱和蛋白质谱等诸多方面都彼此相像，利用对这些特征的定量测量结果可以大致区分一些在某方面具有显著特征的细胞类群。近年来出现的新型图像流式细胞仪，在常规流式细胞仪的基础上增加了测量模块，改进了液流管路，还补充了多通道的图像采集等功能，可以在高通量精确采集信息的基础上，获取每个细胞在各个检测通道的图像，便于针对任何一群甚至单个细胞进行更为全面的比较分析。2018年，张树花等和胡锦丽等率先将图像流式细胞仪分别用于鱼类及甲壳动物等多种水生动物的血细胞研究，利用该仪器更丰富的测量参数和对应的单细胞影像鉴别，依据细胞物理特征对上述水生动物开展了自动化分类分析。将功能分子表达的特异性与细胞形态等特征的专一性相结合便可以更加准确地区分和了解该类细胞的特征和功能，并可进一步将其筛选出来，通过对每种功能类群细胞的逐一解析才能系统了解甲壳动物免疫系统的构成及运行机制。

为了简化定量分析流程，并实现单细胞水平的高通量测量，本发明参考中华绒螯蟹和凡纳滨对虾酚氧化酶原基因序列的保守区设计了探针，并将流式细胞术与荧光原位杂交方法相结合，建立了基于流式荧光原位杂交操作的单细胞水平酚氧化酶原基因表达检测方法。本发明不但避免了市售检测抗体匮乏的问题，而且只需获取基因的部分序列信息即可合成探针，理论上讲探针与目的基因特异性按1:1比例结合，因此可以定量检测特定基因在单细胞内的表达。与筛选单克隆抗体相比，合成探针成本很低。更重要的是，由于本发明出发点是面向具有代表性的功能基因，进行单细胞水平表达量的直接检测，相较于针对细胞表面的关联抗原进行间接检测而言，本发明通过数万细胞样点直接获取功能性靶基因在胞内表达量及精准分布范围，因此测量结果不但能够以用于细胞类群划分，更可直接用于细胞功能分析。总之本发明的方法针对性强，对于目标基因，只需获取部分序列信息即可合成探针直接测量。相较于筛选和使用抗体，大大节约了时间，而且合成探针的价格也远远低于购买抗体；另一方面，各种IgG为基础的抗体的分子量一般在150 kD左右，而寡核苷酸探针分子量不到其1/10，因而更容易扩散进入细胞和靶位点，检测时间也更短。

发明内容

本发明的目的在于，针对目前甲壳动物免疫研究和养殖监测对自动化高通量的血细胞分类测量等技术的迫切需求与缺乏适用的市售抗体之间的矛盾，提出利用甲壳动物特定种类血细胞表达酚氧化酶原基因的特点，设计探针，从mRNA表达水平鉴别该类细胞，并依据定量测量结果了解甲壳动物健康状况的检测方案，建立一种将荧光探针与流式细胞术相结合的自动化分析方法。本发明提供如下的技术方案：

一种用于检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的特异性探针序列5’-TAGACGAGGTGCCAGTGCCAGT -3’， SEQ ID NO: 1，该序列分别与中华绒螯蟹酚氧化酶原基因mRNA序列（GenBank: EF493829.1）的643-664位以及凡纳滨对虾酚氧化酶原基因mRNA序列（GenBank: EU373096.1）的710-731位序列完全互补，该探针经5端FAM荧光标记后，可利用图像流式细胞仪等常规仪器对靶基因表达进行量化分析。

本发明进一步公开了探针序列在具有与探针互补的同源序列的其它甲壳动物酚氧化酶原基因表达分析和检测方面的应用。实验结果显示探针可与凡纳滨对虾的酚氧化酶原基因的目标区完全互补，因而可以用于其检测。

本发明同时也公开了所述述探针序列的制备和使用方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）根据目标基因序列设计并合成探针，采用末端偶联荧光基团标记探针；

（2）采集血细胞，经固定和透化后制备用于探针杂交的细胞样本；

（3）参考常规分子杂交方法，短时间高温打开复杂结构，用去离子甲酰胺降低杂交温度，以保护细胞形态；

（4）细胞筛过滤后上机测量侧向散射和荧光强度等参数以及图像信息用于分析。

本发明优选的方法如下：

（1）探针制备

参考中华绒螯蟹酚氧化酶原基因（GenBankEF493829.1）保守区，优选探针序列为5'- TAGACGAGGTGCCAGTGCCAGT -3'，探针末端采用FAM基团标记。

（2）制备样品

使用抗凝剂从中华绒螯蟹血窦采集血淋巴，离心收集血细胞，使用卡诺氏固定液和NP-40试剂先后对细胞进行固定和透化，并加入RNAse抑制剂保护RNA。

（3）探针杂交

用2xSSC杂交缓冲液悬浮细胞，于杂交炉内升温至70度消除复杂二级结构，与等体积预热至70度的含有探针和去离子甲酰胺的杂交缓冲液混合，杂交炉控温40℃杂交10-15分钟。

（4）检测分析

上机测量样品，采集侧向散射强度、侧向散射面积、探针荧光强度以及各通道图像等信息，参考“一种快速分析甲壳动物血淋巴细胞类群和数量的方法及应用”的专利（ZL2017 1 0583739.3）分析探讨相关数据。

本发明更加详细的描述如下

（1）探针制备

根据GenBank公布的中华绒螯蟹完整酚氧化酶原基因编码序列GenBank:EF493829.1，选择其中的共有的保守区段设计特异性探针序列为5'-TAGACGAGGTGCCAGTGCCAGT -3'，长度22个碱基，GC含量59.1%，Primer Premier 5.0软件计算Tm值为64.4℃；该探针可分别与中华绒螯蟹完整酚氧化酶原基因（GenBank:EF493829.1）的643-664位以及凡纳滨对虾酚氧化酶原基因mRNA序列（GenBank:EU373096.1）的710-731位序列完全互补。在以探针序列为正向引物或者单一引物，以探针序列下游互补序列为反向引物，或无下游引物的单引物扩增的聚合酶链式反应检测中，均无非特异性产物检出，表明探针具有特异性；探针采用5端FAM荧光标记，HPLC方式纯化。

（2）血细胞样品制备

a）选择待测中华绒螯蟹个体，用无菌注射器，按抗凝剂（338 mmol/L氯化钠、115mmol/L葡萄糖、30 mmol/L柠檬酸三钠、10 mmol/L乙二胺四乙酸二钠，pH=7.0）与血淋巴体积比为1:1，从动物游泳足或步足基部的血窦处微创采血；4度，500g离心5min，收集血细胞。

b）用预冷的PBS洗涤并重悬血细胞，将细胞密度调整到每毫升1x10^6左右；低速涡旋状态下加入0.4倍体积预冷的卡诺氏固定液（甲醇与冰乙酸比例为3:1，临用前配制），冰浴固定5 min，500g离心5min，收集血细胞。

c）用0.1%NP-40透化细胞5min，RNAse抑制剂按使用手册浓度添加；500 g离心5min，弃上清。

（3）探针杂交

用200 μL杂交缓冲液（2x SSC）重悬细胞，于杂交炉内升温至70℃，5min，消除复杂结构，与等体积含有0.5-5 μg/mL探针和终浓度25-35%的去离子甲酰胺的杂交缓冲液混合，加入有效剂量RNAse抑制剂；杂交炉降温至40 ℃，孵育15分钟。

（4）测量分析

杂交后用PBS洗涤并重悬细胞，经70 μm细胞筛过滤后上机，采集侧向散射和荧光强度等信号，参考ZL 2017 1 0583739.3专利方法，以侧向散射强度-侧向散射面积做散点图，根据折光性划分细胞类群为无颗粒细胞、小颗粒细胞、中颗粒细胞以及大颗粒细胞，分别对应R1-R4类群；进一步根据荧光信号在细胞中的强度确定主要表达酚氧化酶原基因的血细胞与前述类群的关联，以此了解特定细胞类群与功能的关系；另一方面，根据特定类群细胞的荧光强度变化趋势还能够了解实验条件的影响以及动物健康状况。

图1（A）中的P1区间代表探针信号阳性的细胞，占全部血淋巴细胞的近1/5，即仅有部分血淋巴细胞表达酚氧化酶原基因，提示这些血细胞参与了体液免疫功能。进一步对该部分细胞样点做侧向散射强度-侧向散射面积的散点图，如图1（B），发现前述探针阳性样点主要分布于R2和R4类群区域，占比分别为67.4%和22.7%为，表明小颗粒细胞和大颗粒细胞两个类群与血蓝蛋白探针信号关联度最好，是表达血蓝蛋白的主要类群，也提示这两类细胞存在功能上的关联，但有可能分属同一类细胞分化的不同阶段，因此在侧向散射特征方面存在差异。R3类群在阳性信号细胞中占比较低；胡锦丽等2018年采用同样的侧向散射特征分析方法发现中华绒螯蟹的中颗粒细胞（R3类群）在全血中占比较低，这可能是本方法检测所发现中颗粒细胞在正常个体中表达酚氧化酶原基因的比例较低的原因，即该类细胞本身含量少。而全血中占比较大的无颗粒细胞（R1类群）在酚氧化酶原基因探针检测中未发现明显信号，则提示该类细胞可能不是主要的体液免疫功能类群；胡锦丽等2018年发现无颗粒细胞可以吞入多达数十个直径1μm的实验微球，几乎充满整个细胞，认为其属于细胞免疫的主要类群，这个观点可以解释本发明对无颗粒细胞的检测结果。图1 中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的探针检测；（A）P1为酚氧化酶原探针阳性区间，表达酚氧化酶原的血细胞占比18.7%。（B）酚氧化酶原基因探针信号阳性细胞的类群分析；R1 无颗粒细胞；R2 小颗粒细胞；R3 中颗粒细胞；R4 大颗粒细胞；其中R2和R4类群占比分别为67.4%和22.7%，与血蓝蛋白探针信号关联度最好，系主要表达酚氧化酶原基因的细胞类群，R3类群占阳性细胞比例8.5%，R1类群未检出探针信号。（椭圆区域为R2和R3类群血细胞于所在区间内的集中分布位置）

附图说明

图1 中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的探针检测；其中（A）P1为正常对照组酚氧化酶原探针阳性区间，表达酚氧化酶原的血细胞占比18.7%；（B）酚氧化酶原基因探针信号阳性细胞的类群分析；其中R1 无颗粒细胞；R2 小颗粒细胞； R3 中颗粒细胞； R4 大颗粒细胞；R2和R4类群占阳性细胞比分别为67.4%和22.7%，R3类群占阳性细胞比例8.5%，R1类群未检出探针信号。（椭圆区域为R2和R3类群血细胞于所在区间内的集中分布位置）；

图2嗜水气单胞菌感染后，中华绒螯蟹血细胞酚氧化酶原基因表达的探针检测；其中（A）P1为感染组酚氧化酶原基因探针阳性区间，表达酚氧化酶原基因的细胞占比17.1%。（B）酚氧化酶原基因探针信号阳性信号的细胞类群分析；R1 无颗粒细胞；R2 小颗粒细胞；R3 中颗粒细胞； R4 大颗粒细胞；其中R4类群占比78.8%，R2类群占比14.8，R3类群占比为6.5%。

图3 副溶血弧菌刺激对中华绒螯蟹血细胞酚氧化酶原基因表达的影响；其中（A）对照组注射PBS的个体血细胞酚氧化酶原基因表达的探针检测，P1为阳性区间，表达酚氧化酶原基因的细胞占比为19.7%；（B）实验组病原刺激个体酚氧化酶原基因表达的探针检测，P1为阳性信号区间，所代表的细胞占比为23.8%。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。特别加以说明的是，本发明使用的试剂和材料：PBS、20 x SSC母液，去离子甲酰胺，以及离心管等均购自生工生物工程（上海）有限公司；RNAse抑制剂和PCR反应预混液购自Promega公司，荧光标记探针由生工生物工程（上海）有限公司合成；实验用中华绒螯蟹购自天津市王顶堤水产批发市场。

实施例1

嗜水气单胞菌感染对中华绒螯蟹血细胞的影响

材料与方法

实验材料

中华绒螯蟹，体重50±20g。嗜水气单胞菌菌株系本实验室分离保存。试剂耗材以及探针均参考本发明的说明书，分别购自相关公司。探针序列为：5'-TAGACGAGGTGCCAGTGCCAGT -3',采用5端FAM荧光标记，HPLC方式纯化。抗凝剂组分338mmol/L氯化钠、115 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L柠檬酸三钠、10 mmol/L乙二胺四乙酸二钠，pH=7.0，卡诺氏固定液成分甲醇与冰乙酸比例为3:1，临用前配制。

实验方法

选择体表无伤，活力正常的中华绒螯蟹个体，分为对照组和实验组，分别注射50μLPBS或嗜水气单胞菌（约1x10^7 cfu），24小时后分别按照本发明说明书中的方法采集并分析血细胞。

血细胞采集

a）分别选择对照组和实验组中华绒螯蟹，用无菌注射器，以抗凝剂与血淋巴体积1:1，从中华绒螯蟹步足基部的血窦处微创采血500μL；4度，500g离心5min，收集血细胞。

b）以预冷的PBS洗涤并重悬血细胞，密度约1x10^6 cell / mL；低速涡旋状态下加入0.4倍体积预冷的，冰浴固定5 min，500g离心5min。

c）用0.1%NP-40透化细胞5min，RNAse抑制剂按使用手册浓度添加；500 g离心5min，弃上清。

（3）探针杂交

用200 μL杂交缓冲液（2x SSC）重悬细胞，于杂交炉内升温至70 ℃，5min，消除复杂结构，与等体积含有1 μg/mL探针和终浓度30%的去离子甲酰胺的杂交缓冲液混合，加入有效剂量RNAse抑制剂；杂交炉降温至40 ℃，孵育15分钟。

（4）测量与分析

杂交后用PBS洗涤并重悬细胞，经70 μm细胞筛过滤后上机，采集侧向散射和荧光强度等信号，参考ZL 2017 1 0583739.3专利方法，以侧向散射强度-侧向散射面积做散点图，根据折光性划分细胞类群；进一步根据荧光信号在细胞中的强度确定主要表达酚氧化酶原基因的血细胞与前述类群的关联，并与对照组比较嗜水气单胞菌感染前后表达酚氧化酶原基因的血细胞类群是否发生变化。对照组结果参考说明书中对的图1的分析，实验组结果参考本实施例中的图2。综合分析如下：

由图1可知R2和R4是主要表达酚氧化酶原基因的细胞类群，R3类群由于本身含量低，因此在阳性信号的细胞中占比也较低，R1类群的无颗粒细胞是以吞噬功能为主的细胞免疫功能类群。由图2（A）中的探针信号阳性的细胞P1占比17.1%，略低于对照组的18.7%；分析该部分细胞的侧向散射特征如图2（B），与对照组相比，感染组中华绒螯蟹的血细胞中大颗粒细胞成为主要表达酚氧化酶原基因的类群。对照组的信号分布分析提示，小颗粒细胞和大颗粒细胞具有功能上的关联，可能是一种类型细胞的不同分化阶段；实验组的结果进一步提示，嗜水气单胞菌刺激会导致大量小颗粒细胞转变为大颗粒细胞。由于实验组阳性细胞占比与对照组差异不显著，而且R3类群比例较对照组变化也不大，因此没有足够的证据表明R3类群是主要的响应类群。

通过与发表的结果相互印证的对比，可以证实本发明对酚氧化酶原基因表达的检测结果是可靠的，并且具有操作简便，通量高等优势。

图2 嗜水气单胞菌感染后中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的探针检测；其中（A）P1为感染组酚氧化酶原基因探针阳性区间，表达酚氧化酶原基因的细胞占比17.1%。（B）酚氧化酶原基因探针信号阳性信号的细胞类群分析；R1 无颗粒细胞；R2 小颗粒细胞；R3 中颗粒细胞；R4 大颗粒细胞。R2和R4类群仍然是表达酚氧化酶原基因的主要血细胞类群，但是R4类群占比78.8%，上升为主类群；R2类群占比降至14.8，R3类群占比为6.5%，（椭圆区域为R2和R3类群血细胞于所在区间内的集中分布位置）。

实施例2

副溶血弧菌感染对中华绒螯蟹血细胞的影响的快速分析

材料与方法

实验材料

中华绒螯蟹，体重50±30g。副溶血弧菌菌株系本实验室分离保存。试剂耗材以及荧光探针均参考说明书购自相关公司。探针序列为：5'- TAGACGAGGTGCCAGTGCCAGT -3',采用5端FAM荧光标记，HPLC方式纯化。抗凝剂组分338 mmol/L氯化钠、115 mmol/L葡萄糖、30mmol/L柠檬酸三钠、10 mmol/L乙二胺四乙酸二钠，pH=7.0，卡诺氏固定液成分甲醇与冰乙酸比例为3:1，临用前配制。

实验方法

选择体表无伤，活力正常的中华绒螯蟹个体，分为对照组和实验组，分别注射50μLPBS或副溶血弧菌（约1x10^7 cfu），24小时后分别按照本发明说明书中的方法采集并分析血细胞。

血细胞采集

a）分别选择对照组和实验组中华绒螯蟹，用无菌注射器，以抗凝剂与血淋巴体积1:1，从中华绒螯蟹步足基部的血窦处微创采血500μL；4度，500g离心5min，收集血细胞。

b）以预冷的PBS洗涤并重悬血细胞，密度约1x10^6 cell / mL；低速涡旋状态下加入0.4倍体积预冷的，冰浴固定5 min，500g离心5min。

c）用0.1%NP-40透化细胞5min，RNAse抑制剂按使用手册浓度添加；500 g离心5min，弃上清。

（3）探针杂交

用200 μL杂交缓冲液（2x SSC）重悬细胞，于杂交炉内升温至70 ℃，5min，消除复杂结构，与等体积含有1 μg/mL探针和终浓度30%的去离子甲酰胺的杂交缓冲液混合，加入有效剂量RNAse抑制剂；杂交炉降温至40 ℃，孵育15分钟。

（4）测量与分析

杂交后用PBS洗涤并重悬细胞，经70 μm细胞筛过滤后上机，仅采集荧光强度信号，比较实验组与对照组的血细胞中阳性信号细胞占比，从而快速了解动物健康状况。

图3的A和B分别显示对照组和实验组实验动物血细胞的探针检测结果，本实施例采用的是快速分析策略，即仅通过表达酚氧化酶原基因的细胞占全血的比例是否有显著变化来了解实验动物的健康状况。结果显示对照组阳性细胞占比为19.7%与说明书检测的正常个体的结果没有显著性差异；实验组经过24小时的应答过程后，表达酚氧化酶原基因的血细胞占比相较对照组显著提升了20.8%，一方面说明表达酚氧化酶原的血细胞系关键的应答类群；另一方面，胡锦丽等发现注射微球模拟细菌感染后，中华绒螯蟹血细胞密度呈现先降低后升高的模式，大约16小时后恢复初始水平，因此本实施例选取了24小时时间点采集血细胞，减少各类血细胞数量变化对比例的影响。上述结果表明，酚氧化酶原基因在中华绒螯蟹应答副溶血弧菌刺激的过程中是关键的免疫应答分子，可以进一步检测酚氧化酶原激活途径的其它节点分子表达状况来综合分析该激活系统在应答副溶血弧菌感染过程中的作用和相应机制。

利用本发明探针分析副溶血弧菌感染前后，中华绒螯蟹血细胞表达酚氧化酶原基因状况，表明病原刺激显著影响血细胞正常功能，该方法仅需一步分析就能快速掌握养殖动物在关键基因表达方面的变化，从而了解动物的健康状况。

本实施例表明本发明的探针检测操作简便，结果具有参考价值，即使不经过复杂的多步分析也可直观反应机体的健康状况以及关键免疫分子的应答水平，从而为随时监测和尽早掌握养殖动物的健康状况具有重要的意义。图3 副溶血弧菌刺激对中华绒螯蟹血细胞酚氧化酶原基因表达的影响；其中（A）对照组注射PBS的个体血细胞酚氧化酶原基因表达的探针检测，P1为阳性区间，表达酚氧化酶原基因的细胞占比为19.7%。（B）实验组病原刺激个体酚氧化酶原基因表达的探针检测，P1为阳性信号区间，所代表的细胞占比为23.8%。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 一种用于检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的特异性探针及应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagacgaggt gccagtgcca gt 22

Claims (2)

1.一种用于检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的特异性探针，其序列为5’-TAGACGAGGTGCCAGTGCCAGT -3’， SEQ ID NO: 1，该序列分别与中华绒螯蟹酚氧化酶原基因mRNA序列（GenBank: EF493829.1）的643-664位以及凡纳滨对虾酚氧化酶原基因mRNA序列（GenBank: EU373096.1）的710-731位序列完全互补，该探针经5端FAM荧光标记后，可利用图像流式细胞仪等常规仪器对靶基因表达进行量化分析。

2.权利要求1所述探针用于检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因的方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）根据目标基因序列设计并合成探针，采用末端偶联荧光基团标记探针；其中的探针指的是权利要求1所述的探针；

（2）采集血细胞，经固定和透化后制备用于探针杂交的细胞样本；

（3）参考常规分子杂交方法，短时间高温打开复杂结构，用去离子甲酰胺降低杂交温度，以保护细胞形态；

（4）细胞筛过滤后上机测量侧向散射和荧光强度等参数以及图像信息用于检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因的方法。