CN111122756B - 检测可食用肉的特征多肽及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了检测可食用肉的特征多肽及方法。所述特征多肽包括：针对牛、羊、猪和驴的特征多肽，包括SEQ ID NO.11和/或12所示多肽；针对牛和羊的特征多肽，包括SEQ ID NO.13所示多肽；针对羊和驴的特征多肽，包括SEQ ID NO.17所示多肽；针对羊和猪的特征多肽，包括SEQ ID NO.19所示多肽；针对牛的特征多肽，包括SEQ ID NO.14和/或15和/或21和/或22所示多肽；针对羊的特征多肽，包括SEQ ID NO.16和/或18和/或20所示多肽。本发明建立了从多肽水平对不同可食用肉进行鉴别的技术，为提高食品安全提供了一种更准确可靠的手段。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测可食用肉的特征多肽及方法。
背景技术
随着毛皮大衣的流行，毛皮动物(狐、貉、貂)的数量急剧增加。为了增加利润，制造商将这些来自毛皮动物的处理肉类纳入日常食用肉类销售中。更严重的是，一些制造商在饲养毛皮动物时使用激素来改善毛皮的光泽。一旦这些含有激素的肉类被引入市场并被消费者食用，就会威胁到人类的健康。以上食品掺假严重威胁着人们的健康，我们需要采取必要的措施来预防和控制这种食品安全风险，以对该风险进行预警，确保人们的健康和安全。
目前有效准确地检测肉类种类的方法特别有限，国际上常用检测的方法有PCR技术和ELISA方法，且我国也出台了牛、羊、猪、鹿、狗、马、驴、兔、骆驼肉的PCR技术国家检测标准。但是经长期的实际实验发现：PCR技术易受到DNA降解、复杂基质的干扰和样品提取与扩增方法的影响，从而干扰定性和定量的准确性，且肉类处理加工过程会轻易破坏和除掉DNA，导致无法采用PCR技术检测。ELISA往往受制于抗体的制备，加工过程中蛋白变性，复杂基质和近亲缘种属之间同源干扰，易导致假阳性结果且定量不准确。
随着生物质谱技术的成熟，大规模的定性和定量研究蛋白表达谱的技术已经很成熟。因此，利用质谱技术寻找不同肉类样品特征性蛋白或者多肽，并进行定量，能够避免现在最常用的PCR技术和ELISA所面临的上面的种种问题，其优点包括：不受食品加工的过程影响，因为氨基酸序列比核酸序列在加工过程中更容易保存；同时实现定性与定量，避免假阳性且定量结果更加准确可靠；能够同时监测多种掺假物种。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供检测可食用肉的特征多肽及方法。
本发明对不同可食用肉和不同非可食用肉中的肽段进行了研究，建立了从多肽水平对不同可食用肉和非可食用肉进行鉴别的技术，为提高食品安全提供了一种新的有效手段。
首先，本发明提供了一种多肽标志物，所述多肽标志物包括如下组(1)—组(6)特征多肽的六组、任意五组、任意四组、任意三组、任意二组或任意一组的特征多肽：
组(1)：针对牛、羊、猪和驴的特征多肽，包括SEQ ID NO.11和/或SEQ ID NO.12所示多肽；
组(2)：针对牛和羊的特征多肽，包括SEQ ID NO.13所示多肽；
组(3)：针对羊和驴的特征多肽，包括SEQ ID NO.17所示多肽；
组(4)：针对羊和猪的特征多肽，包括SEQ ID NO.19所示多肽；
组(5)：针对牛的特征多肽，包括SEQ ID NO.14和/或SEQ ID NO.15和/或SEQ IDNO.21和/或SEQ ID NO.22所示多肽；
组(6)：针对羊的特征多肽，包括SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.18和/或SEQ IDNO.20所示多肽。
所述多肽标志物中的所述组(1)特征多肽为牛、羊、猪和驴所共有的，所述组(2)特征多肽为牛和羊所共有的，所述组(3)特征多肽为羊和驴所共有的，所述组(4)特征多肽为羊和猪所共有的，所述组(5)特征多肽为牛所独有的，所述组(6)特征多肽为羊所独有的。
在一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述组(1)—(6)特征多肽的全部六组。
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述组(1)—(6)特征多肽中的任意五组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)—(5)，或(1)—(4)和(6)，或(1)—(3)和(5)—(6)，或(1)—(2)和(4)—(6)，或(1)和(3)—(6)，或(2)—(6)的特征多肽；
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述组(1)—(6)特征多肽中的任意四组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)—(4)、或(1)—(3)和(5)、或(1)—(3)和(6)、或(1)—(2)和(4)—(5)、或(1)—(2)和(4)和(6)、或(1)—(2)和(5)和(6)、或(1)和(3)—(5)、或(1)和(3)—(4)和(6)、或(1)和(3)和(5)—(6)、或(1)和(4)—(6)、或(2)—(5)、或(2)—(4)和(6)、或(2)—(3)和(5)—(6)、或(2)和(4)—(6)、或(3)—(6)的特征多肽；
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述(1)—(6)特征多肽中的任意三组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)—(3)、或(1)—(2)和(4)、或(1)—(2)和(5)、或(1)—(2)和(6)、或(1)和(3)—(4)、或(1)和(3)和(5)、或(1)和(3)和(6)、或(1)和(4)—(5)、或(1)和(4)和(6)、或(1)和(5)和(6)、或(2)—(4)、或(2)—(3)和(5)、或(2)—(3)和(6)、或(2)和(4)—(5)、或(2)和(4)和(6)、或(2)和(5)—(6)、或(3)—(5)、或(3)—(4)和(6)、或(3)和(5)—(6)、或(4)—(6)的特征多肽；
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述(1)—(6)特征多肽中的任意两组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)—(2)、或(1)和(3)、或(1)和(4)、或(1)和(5)、或(1)和(6)、或(2)和(3)、或(2)和(4)、或(2)和(5)、或(2)和(6)、或(3)和(4)、或(3)和(5)、或(3)和(6)、或(4)和(5)、或(4)和(6)、或(5)和(6)的特征多肽；
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述(1)—(7)特征多肽中的任意一组，即，所述多肽标志物包括所述组(1)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)或(7)的特征多肽。
优选的，所述SEQ ID NO.11～22所示多肽的质荷比(m/z)分别为：
SEQ ID NO.11所示特征多肽的质荷比为466.3；
SEQ ID NO.12所示特征多肽的质荷比为620.3；
SEQ ID NO.13所示特征多肽的质荷比为587.96；
SEQ ID NO.14所示特征多肽的质荷比为725.5；
SEQ ID NO.15所示特征多肽的质荷比为686.97；
SEQ ID NO.16所示特征多肽的质荷比为573.8；
SEQ ID NO.17所示特征多肽的质荷比为759.8；
SEQ ID NO.18所示特征多肽的质荷比为981.4；
SEQ ID NO.19所示特征多肽的质荷比为994.5；
SEQ ID NO.20所示特征多肽的质荷比为578.5；
SEQ ID NO.21所示特征多肽的质荷比为611.3；
SEQ ID NO.22所示特征多肽的质荷比为600.3。
另一方面，本发明还提供了一种用于鉴别可食用肉种类的试剂或试剂盒，所述的试剂或试剂盒中包含以上任一所述的多肽标志物。
另一方面，本发明还提供了所述的多肽标志物或所述试剂或试剂盒在鉴别可食用肉种类中的应用。
在上述应用中，所述可食用肉为来源于包括牛、羊、驴、和/或猪的肉或蛋白。
另一方面，本发明还提供了一种检测可食用肉种类的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽；
S2、通过质谱法检验所述待测多肽中的多肽成分，分析待测样本的质谱结果对比所述多肽标志物的质谱图，当质谱结果中出现所述组(1)—(6)中任一所述特征多肽的质谱图时，即可判断该待测样本中含有来源于相应物种的可食用肉或蛋白。
具体地，所述特征多肽为SEQ ID NO.11—22所示特征多肽中的至少一个，当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.11和/或SEQ ID NO.12所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于牛、羊、猪和/或驴的肉或蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.13所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于牛和/或羊的肉或蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.17所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于羊和/或驴的肉或蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.19所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于羊和/或猪的肉或蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.14和/或SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.21和/或SEQ ID NO.22所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于牛的肉或蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.18和/或SEQ ID NO.20所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于羊的肉或蛋白。
优选的，所述的质谱前处理包括如下步骤：
(1)称取待测样本均质成粉末状态，加入蛋白提取液提取蛋白，高速低温离心，收集上清液；
(2)取DTT加入到所述上清液中，37℃反应1小时；
(3)取IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；
(4)采用10K滤膜超滤离心，使用碳酸氢铵反复冲洗滤膜并超滤离心，收集蛋白溶液；
(5)使用胰蛋白酶加入到所述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时，获得待测多肽。
优选的，所述蛋白提取液配方为：8M尿素，50mM NH4HCO3。
优选的，所述质谱的参数设置如下：流速为0.3mL/min；柱温设定为30℃；洗脱液A为0.1％甲酸的水溶液，洗脱液B为0.1％甲酸的乙腈溶液，洗脱方式设定为：0-2min，5％B和95％A；2-6min，5-35％B和95-65％A；6-8.5min，35-70％B和65-30％A；8.5-10min，70-90％B和30-10％A；10-11min，95％B和5％A；11-12min，95-5％B和5-95％A；12-15min，5％B和95％A；喷雾电压为5500V，气帘气为0.25MPa，离子源温度为575℃；检测方式为MRM。
以上方法中，所述待测样本具体可为生肉或熟肉，所述熟肉为将所述生肉经微波(如2000W)加热(如90s)，或在沸水中煮熟(如30min)。
本发明的有益效果如下：
本发明通过对不同可食用肉和不同非可食用肉中的肽段进行了研究，建立了从多肽水平对不同可食用肉和非可食用肉进行鉴别的技术，获得了可以区别于非可食用肉的不同可食用肉的特征多肽，且特征多肽还有特异性好、灵敏度高、准确性高、适用范围广的优点，可用于生肉和熟肉的检测，在预防和控制食品安全风险领域具有重要应用价值。
附图说明
图1-22分别为SEQ ID NO.1-22所示特征多肽色谱图。
图23为实施例2中的实测样品在生鲜肉中添加的非可食用肉的最低响应肽段的色谱图。
图24为实施例2中的实测样品在熟肉中添加微波处理过的非可食用肉的最低响应肽段的色谱图。
图25为SMICA处理的数据分组建立的OPLS-DA模型。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、可食用肉的特征肽段的获得
一、非可食用肉和可食用肉样品的获得
如表1所示，取7种不同的非可食用肉样品，和4中不同的可食用肉样品，所述样品为鲜肉。
表1、11种肉类样品信息
| NO. | 肉类样品的来源物种 | 分类 |
| 1 | 狐(Vuples) | 非可食用肉 |
| 2 | 银黑狐(Vulpes vulpeslinnaeuus) | 非可食用肉 |
| 3 | 蓝狐(Alopex lagopus) | 非可食用肉 |
| 4 | 貉(Nyctereutes procyonoides) | 非可食用肉 |
| 5 | 乌苏里貉(Nyctereutes ussarienusis) | 非可食用肉 |
| 6 | 貂(American mink) | 非可食用肉 |
| 7 | 美洲水貂(Neovison vison) | 非可食用肉 |
| 8 | 牛(Bovine) | 可食用肉 |
| 9 | 羊(Caprinae) | 可食用肉 |
| 10 | 非洲野驴(Equus asinus) | 可食用肉 |
| 11 | 猪(Sus) | 可食用肉 |
二、肉类样品前处理及肽段组的获取
1、样品前处理步骤：
(1)称取1g肉样品均质成粉末状态，加入10mL蛋白提取液(8M尿素，50mM NH4HCO3)震荡提取蛋白，高速低温离心(20000rpm)，取上清液400μL转移到1mL EP管中，获得蛋白溶液；
(2)取8mL 1mol/L二硫苏糖醇(DTT)加入到400μL上述蛋白溶液中37℃反应1小时；
(3)取40μL现配的1mol/L碘乙酰胺(IAA)加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；
(4)采用10K滤膜15000rpm超滤30分钟，使用200μL 50mmol/L碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上层蛋白，转移至新的EP管中；
(5)再加入200μL 50mM碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取。
2、肽段组的获取
蛋白质浓度直接用UV/VIS生物光谱仪(Eppendorf，汉堡，德国)测定，用测序级修饰胰蛋白酶(Promega，USA)按照蛋白质/胰蛋白酶比(1:50，w/w)在37℃下酶解16-18h，获得胰蛋白酶多肽液，进行质谱和液相检测。
三、质谱和液相检测条件：
利用AB Triple TOF 5600和QTRAP 5500质谱仪(SCIEX，Framingham，MA，U.S.A.)结合LC-30AD系统(日本)，采用Advance Bio Peptide Map柱(150mm×2.1mm，
2.7μm；安捷伦科技公司(美国纽波特))进行分析，采集方式MRM，通过Analyst TF软件(SCIEX，Framingham，MA，U.S.A.)进行如下参数设置：
流速为0.3mL/min；柱温设定为30℃；洗脱液A为0.1％甲酸的水溶液，洗脱液B为0.1％甲酸的乙腈溶液，洗脱方式设定为：0-2min，5％B和95％A；2-6min，5-35％B和95-65％A；6-8.5min，35-70％B和65-30％A；8.5-10min，70-90％B和30-10％A；10-11min，95％B和5％A；11-12min，95-5％B和5-95％A；12-15min，5％B和95％A；喷雾电压为5500V，气帘气为0.25MPa，离子源温度为575℃。
四、特征多肽的选择
1、样品SWATH采集：在AB Triple TOF 5600上建立SWATH采集方法。高灵敏度模式下采集MS2(二级质谱)谱图，用SWATH-MSALL方法对样品肽段在400-1250m/z范围进行SWATH数据采集，采用随机数进样。
2、数据处理：利用ProteinPilotTM软件进行数据的处理和分析，选用NCBI的物种数据库进行数据检索。用PeakView和SWATH Micro App(Sciex公司)对采集的SWATH数据进行处理，提取蛋白及其对应的肽段和碎片离子信息。用SMICA软件对数据进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonalpartial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)。SMICA处理的数据分组建立的OPLS-DA模型如图25所示。图25显示，可食用肉动物组和非可食肉动物(皮毛动物)组能够很好的被区分开来，横坐标代表组间差异，纵坐标代表组内差异。
3、特征肽段的选取：为了进一步明确样品间具有统计学差异的蛋白，找到区分样品的生物标志物，利用以上建立的OPLS-DA模型进行识别。选用VIP值大于1或者p[corr]的绝对值大于0.8的多肽作为潜在生物标志物用以进一步研究和确证。
4、特征肽段的进一步筛选：通过SIMCA分析一共获得了104个肽段(包括41个可食肉类肽段，63个非可食肉类肽段)，通过生物特异性验证过滤掉了35个，通过检测特异性(基质包括了鲜肉、经微波2000W加热90s的肉、在沸水中30min煮熟的肉)验证过滤掉了47个后，经过多次验证，选取其中的10条多肽为非可食用肉类的特征多肽，选取其中的12条多肽为可食用肉类的特征多肽。特征多肽具体信息见表2。
表2、特征多肽的详细信息
实施例2、市场购买可食用肉样品的检测
一、对待测可食用肉进行分析的步骤包括：
1、样品前处理步骤：
同实施例1步骤二中的步骤1和2。
2、质谱和液相检测条件：
同实施例1步骤三。
3、结果分析
将步骤2的检测结果对比实施例1中表2所示的各条特征多肽的色谱图，出现实施例1中任一所述色谱图时，即可判断该待测可食用肉中含有相应物种的非可食用肉和可食用肉。
二、市场购买可食用肉样品的检测：
从市场上随机购买牛肉样品3份(1份鲜肉，2份熟肉)、羊肉样品3份(1份鲜肉，2份熟肉)、驴肉样品3份(1份鲜肉，2份熟肉)、猪肉样品3份(1份鲜肉，2份熟肉)，每份相应添加1％的生鲜非可食用的狐肉(表1中的NO.1)、经微波2000W加热90s的非可食用的狐肉(表1中的NO.1)、在沸水中30min煮熟的非可食用的狐肉(表1中的NO.1)，以未添加非可食用肉的生肉样品为阴性对照(ck)，对上述样品按照步骤一中的步骤1-3进行检测，结果如表3所示，其中，非可食用的狐肉(表1中的NO.1)特征肽段中响应最低的肽段(SEQ ID NO.1)的部分结果如图23、图24所示。
表3、市场购买可食用肉样品的检测
注：表中“+”结果代表阳性，即含有非可食用肉；表中“-”结果代表阴性，即不含有非可食用肉。
表3结果表明，未添加非可食用肉的生肉样品即阴性对照检测结果为阴性，添加非可食用肉的生肉和添加非可食用肉的熟肉的检测结果完全一致，且经核实，上述检测结果中的质谱图与检测的可食用肉及其掺假的非可食用肉的来源物种相符；以上结果证明SEQID NO.1所示的多肽可以作为标志物检测非可食用狐肉。
另外，上述检测结果还显示，牛肉中含有SEQ ID NO.11、12、13、14、15、21和22所示多肽，羊肉中含有SEQ ID NO.11、12、13、16、17、18、19和20所示多肽，驴肉中含有SEQ IDNO.17所示多肽且不含有SEQ ID NO.11-22中除SEQ ID NO.17外的其他多肽，猪肉中含有SEQ ID NO.19所示多肽且不含有SEQ ID NO.11-22中除SEQ ID NO.19外的其他多肽。说明：SEQ ID NO.11或12可以作为标志物检测出可食用的牛肉、羊肉、猪肉或驴肉，SEQ ID NO.13可以作为标志物检测出可食用的牛肉或羊肉，SEQ ID NO.17可以作为标志物检测出可食用的羊肉或驴肉，SEQ ID NO.19可以作为标志物检测出可食用的羊肉或猪肉，SEQ ID NO.14、15、21或22可以作为标志物检测出可食用的牛肉，SEQ ID NO.16、18或20可以作为标志物检测出可食用的羊肉。
利用其它的非可食用肉(狐肉、貂肉、貉肉)掺杂到可食用肉中，并利用上述方法进行检测，结果显示，SEQ ID NO.1所示的多肽可以作为标志物检测出非可食用的狐肉、貂肉或貉肉，SEQ ID NO.2、3、4或5所示的多肽可以作为标志物检测出非可食用的狐肉或貉肉，SEQ ID NO.6、7、8、9或10所示的多肽可以作为标志物检测出非可食用的貂肉。
上述结果说明，本申请表2所示的特征多肽和步骤1-3的检测方法可以用于检测可食用肉(来源于牛、羊、猪、驴)中非可食用肉(来源于狐、貉、貂)或检测肉类中含有的肉或蛋白种类，且检测结果准确可靠。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
序列表
<110> 青岛海关技术中心
<120> 检测可食用肉的特征多肽及方法
<130> JH-CNP190979
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Gln Thr Leu Gln Glu Glu Leu Ala Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ile Val Ala Ser Thr Leu Ser Asn Pro Glu Leu Phe Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala His Ser Glu Leu Ser Gly Ala Ala Asp Glu Ala Ser Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Lys Glu Gly Gly Leu Gly Pro Leu Asn Ile Pro Leu Val Ala Asp Val
1 5 10 15
Thr Arg
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
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1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Asn Arg Pro Thr Ser Ile Ala Trp Asp Gly Leu Asp Ser Gly Lys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
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1 5 10 15
Leu Lys
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<213> 人工序列
<400> 9
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1 5 10
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Ala Leu Gln Leu Gly Leu Leu Phe Pro Pro Ala Glu Ala Leu Arg
1 5 10 15
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Pro Ser Arg Pro Val Val Pro Pro Leu Ile Pro Pro Lys
1 5 10
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Asn Phe Gly Pro Thr Gly Ile Gly Phe Gly Gly Leu Thr His Gln Val
1 5 10 15
Glu Lys
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Ala Gly Glu Leu Pro Thr Cys Glu Ser Leu Lys Asp Thr Ile Ala Arg
1 5 10 15
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Val Glu Leu Pro Ser Leu Ile Pro Val Ile Leu Glu Lys
1 5 10
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Phe Ile Tyr Glu Asn His Pro Asp Val Phe Ser Asp Ser Ser Met Asp
1 5 10 15
Arg
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn Gln Asn Val Lys
1 5 10
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
His Pro Ser Asp Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly Ala Met Ser Lys
1 5 10 15
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ala Gly Val Gly Glu Thr Gly Thr Asp Asn
1 5 10 15
Gln Ala Gly Gly Glu Gly Lys
20
<210> 19
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Gly Gly Ala Ala Gly Thr Pro Gly Val Gly Glu Thr Gly Thr Asp Asn
1 5 10 15
Gln Ala Gly Gly Glu Gly Lys
20
<210> 20
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Ala Val Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Thr Leu Ser Asp Leu Ser
1 5 10 15
Asp Leu His Ala His Lys
20
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Ser Ala Ser Gly Leu Ser Ile Ser Gly Gly Glu Glu Lys
1 5 10
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Thr Val Phe Leu Gln Met Phe Gly Glu Lys
1 5 10
Claims (9)
1.一种针对液相色谱/串联质谱联用技术的、用于鉴别可食用肉种类的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂或试剂盒中包含下述的多肽标志物：
所述多肽标志物包括如下组（1）—组（5）特征多肽的五组、任意四组、任意三组、任意二组或任意一组的特征多肽：
组（1）：针对牛、羊、猪和驴的特征多肽，包括SEQ ID NO.11所示多肽；
组（2）：针对牛和羊的特征多肽，包括SEQ ID NO.13所示多肽；
组（3）：针对驴的特征多肽，包括SEQ ID NO.17所示多肽；
组（4）：针对牛的特征多肽，包括SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.21和/或SEQ ID NO.22所示多肽；
组（5）：针对羊的特征多肽，包括SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.18所示多肽。
2.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于：
SEQ ID NO.11所示特征多肽的质荷比为466.3；
SEQ ID NO.13所示特征多肽的质荷比为587.96；
SEQ ID NO.15所示特征多肽的质荷比为686.97；
SEQ ID NO.16所示特征多肽的质荷比为573.8；
SEQ ID NO.17所示特征多肽的质荷比为759.8；
SEQ ID NO.18所示特征多肽的质荷比为981.4；
SEQ ID NO.21所示特征多肽的质荷比为611.3；
SEQ ID NO.22所示特征多肽的质荷比为600.3。
3.权利要求1或权利要求2所述的试剂或试剂盒在鉴别可食用肉种类中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述可食用肉为来源于包括牛、羊、驴、和/或猪的肉或蛋白。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述可食用肉中掺杂了包括来源于狐、貉、和/或貂的肉或蛋白。
6.一种检测可食用肉种类的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽；
S2、通过质谱法检验所述待测多肽中的多肽成分，分析待测样本的质谱结果对比多肽标志物的质谱图，当质谱结果中出现所述多肽标志物的质谱图时，即可判断该待测样本中含有来源于相应物种的可食用肉或蛋白，
所述多肽标志物包括如下组（1）—组（5）特征多肽的五组、任意四组、任意三组、任意二组或任意一组的特征多肽：
组（1）：针对牛、羊、猪和驴的特征多肽，包括SEQ ID NO.11所示多肽；
组（2）：针对牛和羊的特征多肽，包括SEQ ID NO.13所示多肽；
组（3）：针对驴的特征多肽，包括SEQ ID NO.17所示多肽；
组（4）：针对牛的特征多肽，包括SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.21和/或SEQ ID NO.22所示多肽；
组（5）：针对羊的特征多肽，包括SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.18所示多肽。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.11所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于牛、羊、猪和/或驴的肉或蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.13所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于牛和/或羊的肉或蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.17所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于驴的肉或蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.21和/或SEQ ID NO.22所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于牛的肉或蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.18所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本中含有来源于羊的肉或蛋白。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的质谱前处理包括如下步骤：
（1）称取待测样本均质成粉末状态，加入蛋白提取液提取蛋白，高速低温离心，收集上清液；
（2）取DTT加入到所述上清液中，37 ℃反应1小时；
（3）取IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；
（4）采用10 K滤膜超滤离心，使用碳酸氢铵反复冲洗滤膜并超滤离心，收集蛋白溶液；
（5）使用胰蛋白酶加入到所述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时，获得待测多肽。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述蛋白提取液配方为：8M尿素，50mM NH4HCO3；
所述质谱的参数设置如下：流速为0.3mL/min；柱温设定为30°C；洗脱液A为0.1% 甲酸的水溶液，洗脱液B为0.1% 甲酸的乙腈溶液，洗脱方式设定为：0−2min，5%B和95%A；2−6min，5−35%B和95-65%A；6−8.5min，35−70%B和65-30%A；8.5−10min，70-90%B和30-10%A；10−11min，95%B和5%A；11−12min，95−5%B和5-95%A；12−15min，5%B和95%A；喷雾电压为5500V，气帘气为0.25 MPa，离子源温度为575°C；检测方式为MRM。
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