CN112094919A

CN112094919A - 一种快速鉴别牛猪鸡鸭动物源成分的多重pcr引物组及其方法和试剂盒

Info

Publication number: CN112094919A
Application number: CN202010997172.6A
Authority: CN
Inventors: 雷红涛; 赵岗; 沈兴; 韦晓群; 钟鹏; 徐振林; 孙远明
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2020-12-18

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别牛猪鸡鸭动物源成分的多重PCR引物组及其方法和试剂盒。所述多重PCR引物组包括4对引物：牛源性成分检测引物对B‑F/R、猪源性成分检测引物对P‑F/R、鸡源性成分检测引物对C‑F/R和鸭源性成分检测引物对D‑F/R，其引物序列依次如SEQ ID NO:1～8所示。所述引物对仅对各自物种的目标片段进行特异性扩增，不会对其他物种进行非特异性扩增，检测时间短，其对牛肉制品中掺杂的猪、鸡、鸭源性成分检测限可达0.1％(w/w)，适用于多种肉类加工产品中动物源成分鉴别检验，适用范围广、可靠性高。

Description

一种快速鉴别牛猪鸡鸭动物源成分的多重PCR引物组及其方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及肉及肉类产制品中动物源性成分鉴定的食品检验技术，更具体地，涉及一种快速鉴别牛猪鸡鸭动物源成分的多重PCR引物组及其方法和试剂盒。

背景技术

受经济利益驱使，肉制品掺假一直是食品安全中屡禁不止的重要问题。2013年欧洲各国爆发了震惊全球的“马肉风波”事件，此事件引起了全球对于肉制品掺假的关注。因为不同肉类存在价格差异，一些不法商家为了达到追求高利润的目的，利用廉价肉类相似的形态、颜色等相仿特征，并加以人工处理，对高值肉类进行掺杂使假，严重干扰了全球范围内的肉业生产。这也成为制约肉品质量提升的主要因素，而且严重损害了消费者的经济利益和知情权，甚至涉及宗教信仰等问题(例如在清真食品中掺杂进猪肉等)。

在利益驱动下，有些不法商贩和企业用价格低的其它禽畜肉为原料，通过人为加工处理后，冒充和掺假牛肉进行售卖，从中牟取暴利，这使得牛肉制品掺假问题严重。同时由于猪肉、鸭肉等其肉质肌纤维纹路与牛肉较为接近，将其混合掺杂进牛肉制品中，再通过添加剂等成分加工成成品后更是难以分辨，常能以假乱真。同时，随着掺假手段越来越复杂，传统的感官分辨方法已经不能满足肉质品种鉴别的检测要求。近年来，国内外学者基于各类技术手段开展了肉制品中动物种类的定性检测方法的研究，主要分为形态学方法、基于代谢物的检测方法以及基于核酸和蛋白的检测方法。基于DNA的分子生物学检测方法因其具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、成本低等优点，已成为肉类成分鉴别技术的研究热点。在所有动物源性成分的检测技术中，目前主要存在PCR-RFLP分析、PCR-RAPD分析、核酸探针杂交、PCR等检测技术。PCR技术是发展较为完善、灵敏度及准确度都相对较好的一种技术手段，在国内外已得到广泛应用。其他方法由于操作难度大或检测成本高等缺点，在实际检测中应用较少。

目前国内出台的动物源性相关检测标准主要集中在常规PCR和实时荧光PCR技术，大多数标准检测方法只能进行单一动物物种的鉴别。在肉类食品样本实际检测过程中，对于深度加工、成分不明确的肉类制品，需要通过多次检测才能确定，这就增加了样品检测周期、加大了检测工作量，同时因为需要昂贵的仪器及配套试剂耗材，导致检测成本过高，因此很难在低资源的肉制品检测一线进行推广应用。现有技术中也有一些关于多种动物源性相关检测的PCR检测方法，例如专利CN104673900A和CN104894263A均采用了多重RT-PCR的熔解曲线分析技术来达到肉与肉制品中多种源性成分的快速鉴别，但该方法仅通过熔解曲线温度tm值范围不能区分如狐狸、貉子等同科动物同源性很近的物种，另外该方法对设计的引物要求很强的特异性，多对引物容易引起交叉反应和非特异性扩增；专利CN106148559A公开了一种同步检测五种动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法，虽然可以实现一次性检测牛、猪、羊、鸡、鸭5个动物物种，但是其扩增片段较长，仅能以样品DNA为模板进行扩增，因此检测时间较长，检测的肉类食品种类有限，且检测限依然有待提高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种快速检测牛、猪、鸡、鸭四种动物源成分的多重PCR引物组。

本发明的第二个目的在于提供所述多重PCR引物组的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种快速鉴别肉类制品中牛猪鸡鸭动物源成分的多重PCR检测方法。

本发明的第四个目的在于提供一种快速鉴别肉类制品中牛猪鸡鸭动物源成分的试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种快速检测牛、猪、鸡、鸭四种动物源成分的多重PCR引物组，其特征在于，包括4对引物：牛源性成分检测引物对B-F/R、猪源性成分检测引物对P-F/R、鸡源性成分检测引物对C-F/R和鸭源性成分检测引物对D-F/R，其引物序列依次如SEQ ID NO:1～8所示：具体地：

(1)牛源性成分特异性引物对，扩增片段大小255bp；

正向引物B-F：5’-TCGCTATCCAATGAATTTTACCAGGC-3’(SEQ ID NO:1)；

反向引物B-R：5’-CCATGCTTATCATTATGCTGGTGCTC-3’(SEQ ID NO:2)

(2)猪源性成分特异性引物对，扩增片段大小208bp；

正向引物P-F：5’-CGTACACGCGCATATAAGCAGG-3’(SEQ ID NO:3)

反向引物P-R：5’-GGTAGGTGCCTGCTTTCGTAGC-3’(SEQ ID NO:4)

(3)鸡源性成分特异性引物对，扩增片段大小45bp；

正向引物C-F：5’-GGGTGCGGAGTGCTATTCAAG-3’(SEQ ID NO:5)

反向引物C-R：5’-ACACGAGAGGACTAGGATAGGACGC-3’(SEQ ID NO:6)

(4)鸭源性成分特异性引物对，扩增片段大小107bp；

正向引物D-F：5’-TTGCACATAATGTCCGACGTGAC-3’(SEQ ID NO:7)

反向引物D-R：5’-CAAGGAGAGGTGAGTGAACCCAAT-3’(SEQ ID NO:8)

本发明以牛、猪、鸡、鸭四种动物线粒体DNA中D-loop区为靶点，经过创造性劳动后，设计筛选得到了上述4对高特异性引物组合用于这四种动物源成分多重PCR引物体系的构建。所设计的4对引物不仅具有高度种内保守、种间特异的特点，且扩增片段长度较小，适用于高度加工的肉制品，且扩增片段大小有梯度差便于电泳辨别区分，而且所述引物对可直接使用样品裂解液上清作为模板进行扩增，无需提取样品DNA。

本发明还提供所述多重PCR引物组在检测肉类制品中牛源性成分、猪源性成分、鸡源性成分或鸭源性成分中的一种或多种中或在制备快速检测牛、猪、鸡、鸭四种动物源成分的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种快速鉴别肉类制品中牛猪鸡鸭动物源成分的多重PCR检测方法，包括如下步骤：

S1.提取待测肉制品DNA或样品裂解液上清；

S2.以步骤S1的DNA或样品裂解液上清为模板，使用上述的多重PCR引物组对进行多重PCR扩增；

S3.取步骤S2的PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行结果判定：若待检样品扩增出255bp条带的，判定待检样品为牛源性成分阳性；待检样品扩增出208bp条带的，判定待检样品为猪源性成分阳性；待检样品扩增出45bp条带的，判定待检样品为鸡源性成分阳性；待检样品扩增出107bp条带的，判定待检样品为鸭源性成分阳性。

具体地，所述方法还包括对阳性对照和阴性对照同时进行多重PCR扩增反应，若待检样品扩增出255bp条带，与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定待检样品为牛源性成分阳性；待检样品扩增出208bp条带，与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定待检样品为猪源性成分阳性；待检样品扩增出45bp条带，与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定待检样品为鸡源性成分阳性；待检样品扩增出107bp条带，与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定待检样品为鸭源性成分阳性；当PCR反应无扩增产物或产物与阳性对照扩增产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出相应动物源成分；如果阳性样品未检测预期片段，说明操作失误或试剂失效；若空白对照与阳性样品均检出，说明操作失误或试剂污染。

优选地，步骤S2所述多重PCR反应体系如下：1.1×T6 Super PCR Mix 21.3μL，B-F和B-R终浓度为0.34μM，P-F和P-R终浓度为0.34μM，C-F和C-R终浓度为0.3μM，D-F和D-R终浓度为0.3μM，样品DNA模板2.1μL，反应总体系25μL。通过优化4对扩增引物得到最佳引物配比，构建了辨别四种动物源成分的多重PCR检测方法。

优选地，步骤S2所述多重PCR反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共30个循环；72℃最终延伸1min。

本发明还提供一种快速检测牛、猪、鸡、鸭四种动物源成分的试剂盒，包含上述任一所述的多重PCR引物组。

优选地，还包含PCR反应所需试剂。

优选地，还包含PCR阳性对照和阴性对照。

本发明还提供所述试剂盒在检测肉类制品中牛源性成分、猪源性成分、鸡源性成分或鸭源性成分中的一种或多种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的多重PCR引物对具有很高的特异性，仅对各自物种的目标片段进行特异性扩增，不会对其他物种进行非特异性扩增。同时，使用本发明的多重PCR检测方法可以一次性检测牛、猪、鸡、鸭4个动物物种，极大的提高了检测效率，降低了检测成本。

(2)本发明所涉及方法能快速对肉制品中牛、猪、鸡、鸭四种动物源性成分进行鉴定，优化了特定PCR反应体系及反应程序，PCR过程仅需40min，结合样品直接裂解法快速提取样品DNA，整个检测时间能缩短至90min，特别适用于肉制品掺假鉴别检测一线的实际应用。

(3)通过构建的牛肉制品掺假模型，本发明的多重PCR检测体系对于不同加工条件处理下牛肉制品中猪、鸡、鸭源性成分检测限可以达到0.1％(w/w)。

(4)应用本发明的多重PCR检测方法对79份市售不同类型肉类食品的检测结果表明，本发明所建立的多重PCR方法检测体系，适用于冷冻牛排、牛肉卷、冷冻肉丸、卤肉制品、熟制肉丸等多种肉类加工产品中动物源成分鉴别检验，适用范围广，且与农业行业标准《肉类源性成分鉴定实时荧光定性PCR法》(NY/T3309-2018)检测结果完全一致，可靠性高。

附图说明

图1是本发明针对牛、猪、鸡、鸭四个物种的多重PCR检测方法的特异性试验；其中，M：100bp DNA Ladder；1：牛；2：猪；3：鸡；4：鸭；5：小鼠；6：大鼠；7：兔子；8：对虾；9：水稻；N：阴性对照(ddH₂O)。

图2是本发明的多重PCR体系检测限实验结果；图A：-20℃冷冻条件；图B：80℃处理1h；电泳图由左到右依次为牛肉与猪肉混合模型、牛肉与鸡肉混合模型、牛肉与鸭肉混合模型；电泳图泳道由左到右依次为混入0％、0.1％、1％、5％、10％、30％、50％、70％、90％、100％不同质量比例的廉价肉。

图3是本发明所建立的多重PCR检测方法应用于市售牛肉制品(样品1～17)的检测结果；其中，M：100bp DNA Ladder；1-17：样品1至样品17，共17个市售牛肉制品；B：牛；P：猪；C：鸡；D：鸭；N：阴性对照(ddH₂O)。

图4是本发明所建立的多重PCR检测方法应用于市售牛肉制品(样品18～34)的检测结果；其中，M：100bp DNA Ladder；18-34：样品18至样品34，共17个市售牛肉制品；B：牛；P：猪；C：鸡；D：鸭；N：阴性对照(ddH₂O)。

图5是本发明所建立的多重PCR检测方法应用于市售牛肉制品(样品35～52)的检测结果；其中，M：100bp DNA Ladder；35-52：样品35至样品52，共18个市售牛肉制品；B：牛；P：猪；C：鸡；D：鸭；N：阴性对照(ddH₂O)。

图6是本发明所建立的多重PCR检测方法应用于市售牛肉制品(样品53～66)的检测结果；其中，M：100bp DNA Ladder；53-66：样品53至样品66，共14个市售牛肉制品；B：牛；P：猪；C：鸡；D：鸭；N：阴性对照(ddH₂O)。

图7是本发明所建立的多重PCR检测方法应用于市售牛肉制品(样品67～79)的检测结果；其中，M：100bp DNA Ladder；67-79：样品67至样品79，共13个市售牛肉制品；B：牛；P：猪；C：鸡；D：鸭；N：阴性对照(ddH₂O)。

图8是应用农业行业标准实时荧光PCR方法对市售牛肉制品1～17牛猪鸡鸭四种动物源成分检测结果；其中，a图：样品1～17牛源性成分实时荧光PCR检测结果；b图：样品1～17猪源性成分实时荧光PCR检测结果；c图：样品1～17鸡源性成分实时荧光PCR检测结果；d图：样品1～17鸭源性成分实时荧光PCR检测结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1特异性引物设计及多重PCR体系构建

1、牛猪鸡鸭特异性引物设计及筛选

从GenBank数据库中下载牛(HM045018.1)、猪(MG009446.1)、鸡(KM096864.1)、鸭(NC_009684.1)线粒体DNA序列，使用MegAlign软件中Cluster W方法比对分析四种物种线粒体序列，选择差异较大的D-loop区作为靶点设计物种特异性引物，使用NCBI网页Primer-BLAST工具搜索确认所设引物在所有物种中的特异性。同时保证所设计的4对特异性引物具有相近Tm值以及扩增片段大小呈梯度。设计得到了一系列满足引物设计原则的引物对，进过一系列前期检测、筛选后，引物筛选结果如下所示：

(1)牛源性成分特异性引物对，扩增片段大小255bp。

正向引物B-F：5’-TCGCTATCCAATGAATTTTACCAGGC-3’

反向引物B-R：5’-CCATGCTTATCATTATGCTGGTGCTC-3’

(2)猪源性成分特异性引物对，扩增片段大小208bp。

正向引物P-F：5’-CGTACACGCGCATATAAGCAGG-3’

反向引物P-R：5’-GGTAGGTGCCTGCTTTCGTAGC-3’

(3)鸡源性成分特异性引物对，扩增片段大小45bp。

正向引物C-F：5’-GGGTGCGGAGTGCTATTCAAG-3’

反向引物C-R：5’-ACACGAGAGGACTAGGATAGGACGC-3’

(4)鸭源性成分特异性引物对，扩增片段大小107bp。

正向引物D-F：5’-TTGCACATAATGTCCGACGTGAC-3’

反向引物D-R：5’-CAAGGAGAGGTGAGTGAACCCAAT-3’

2、牛猪鸡鸭多重PCR体系构建及优化

(1)提取样品DNA(动物基因组DNA提取试剂盒或者公认的、具有相同效力的其他提取方法)，-20℃保存备用。其中，直接裂解法获取样品DNA为取约30mg牛肉样品，加入50μL样品裂解液A(TSE012，北京擎科新业生物技术有限公司)，95℃裂解10～15min，简短离心后取上清作为PCR反应模板。

采用直接裂解法、CTAB法和试剂盒法三种不同方法对肉样核酸进行提取，使用

spectrophotometer，通过测量核酸浓度及OD_260/280值对三种方法所获DNA进行质量检测。实验结果显示三种提取方法所获DNA浓度均可满足下一步实验分析需求，不同的是直接裂解法所提取的DNA浓度可达到100-300ng/μL，OD_260/280值约为1.5，有蛋白污染，但此方法实验时间最短不超过15min即可完成，实验过程最简单方便，且不依赖离心机，前处理简单高效，适合大量样品处理；CTAB法可获得较高DNA浓度100-600ng/μL，OD_260/280值介于1.7-2.0，核酸纯度相对较高，但核酸提取时间较长>3h，实验过程较繁琐；试剂盒法提取核酸浓度较低，多数低于100ng/μL，但所获DNA的OD_260/280值介于1.7-1.9，纯度较高，核酸提取时间适中>2h，核酸提取操作相对简单但花费较高。综合对比分析三种核酸提取方法(表1)可发现，直接裂解法最简单快速经济，可适用于大批量样品初步快速检测需求；CTAB法所获DNA质量浓度均为最好，但提取过程繁琐花费时间较长，适用于复杂样品检测结果重复确认；试剂盒法所获DNA质量浓度虽然较好，但提取时间长花费较高，不适用于大量样品核酸快速提取分析。因此本发明可以用直接裂解法进行快速核酸提取分析，CTAB法进行辅助验证确认。

表1

(2)经过对多重PCR实验体系中4对引物配比多次优化，最终的多重PCR反应体系如下：1.1×T6 Super PCR Mix(green)21.3μL，B-F和B-R终浓度为0.34μM，P-F和P-R终浓度为0.34μM，C-F和C-R终浓度为0.3μM，D-F和D-R终浓度为0.3μM，样品DNA模板2.1μL，反应总体系25μL。

多重PCR反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共30个循环；72℃最终延伸1min。

PCR反应产物经3％琼脂糖凝胶电泳检测，电压150v，电泳30min，置紫外凝胶成像系统中观察并拍照保存结果进行结果判定：待检样品扩增出255bp条带，与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定待检样品为牛源性成分阳性；待检样品扩增出208bp条带，与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定待检样品为猪源性成分阳性；待检样品扩增出45bp条带，与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定待检样品为鸡源性成分阳性；待检样品扩增出107bp条带，与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定待检样品为鸭源性成分阳性；当PCR反应无扩增产物或产物与阳性对照扩增产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出相应动物源成分；如果阳性样品未检测预期片段，说明操作失误或试剂失效；若空白对照与阳性样品均检出，说明操作失误或试剂污染。

实施例2多重PCR检测体系特异性验证

为了验证本发明所构建的多重PCR检测体系特异性，提取牛、猪、鸡、鸭、大鼠、小鼠、兔子、对虾、水稻的DNA，作为PCR反应模板对构建的多重PCR检测体系进行特异性验证。DNA提取、多重PCR检测体系及反应条件、电泳方法均与实施例1相同。多重PCR检测体系特异性验证结果如图1所示，可以看到多重PCR检测体系分别只对牛、猪、鸡、鸭这四个物种有对应大小的扩增条带，对大鼠、小鼠、兔子、对虾和水稻均没有扩增条带。这表明本发明的多重PCR检测体系特异性高。

实施例3多重PCR检测方法检测限

为了验证本发明所构建的多重PCR检测方法检测限，本发明分别将牛肉粉与猪肉粉、鸡肉粉、鸭肉粉按不同比例混合(表2)制成模拟掺假牛肉模型，再将模型进行冷冻和加热条件处理模拟不同加工条件的真实牛肉制品，对其使用本发明的多重PCR检测验证，结果如图2所示，多重PCR方法对于两种处理条件下的牛肉掺假猪肉、鸡肉、鸭肉的检测限均能达到0.1％。

表2牛肉混合猪肉、鸡肉、鸭肉模型

实施例4多重PCR检测方法的实际应用和准确性

为了检测本发明的多重PCR检测方法在实际样品检测中的应用，从市场上购买79份不同牛肉制品，包括冷冻牛排、牛肉卷、冷冻肉丸、卤肉制品、熟制肉丸等多种肉类加工产品。样品DNA提取、多重PCR检测体系及反应条件、电泳方法均与实施例1相同。检测检测结果如图3～图7所示，检测结果表明，79份不同市售牛肉制品中有22份样品存在掺入猪肉或鸡肉情况，总的掺假率为27.8％。由此证明本发明构建的多重PCR检测方法可应用于市售肉制品中牛、猪、鸡、鸭四种动物源性成分的快速鉴定。检测时间短、成本低，特别适用于肉制品掺假鉴别检测一线的实际应用。

为了证明本发明的多重PCR检测方法的准确性，采用农业行业标准《肉类源性成分鉴定实时荧光定性PCR法》(NY/T 3309-2018)对所构建的多重PCR检测体系进行准确性检测。选取了图3的17份市售牛肉制品，按照该标准中的实时荧光PCR方法对样品中牛、猪、鸡、鸭四种动物源成分进行检测，结果如图8所示。结果表明使用实时荧光PCR标准检测方法与本发明检测结果完全一致(表3所示)，由此证明本发明的多重PCR检测方法具有较高准确性，完全可以应用于市场肉类制品的动物源成分检测。

表3本发明多重PCR检测结果与标准方法检测结果比较

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种快速鉴别牛猪鸡鸭动物源成分的多重PCR引物组及其方法和试剂盒

<141> 2020-09-21

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 1

tcgctatcca atgaatttta ccaggc 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

ccatgcttat cattatgctg gtgctc 26

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 3

cgtacacgcg catataagca gg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 4

ggtaggtgcc tgctttcgta gc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 5

gggtgcggag tgctattcaa g 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 6

acacgagagg actaggatag gacgc 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 7

ttgcacataa tgtccgacgt gac 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 8

caaggagagg tgagtgaacc caat 24

Claims

1.一种快速检测牛、猪、鸡、鸭四种动物源成分的多重PCR引物组，其特征在于，包括4对引物：牛源性成分检测引物对B-F/R、猪源性成分检测引物对P-F/R、鸡源性成分检测引物对C-F/R和鸭源性成分检测引物对D-F/R，其引物序列依次如SEQ ID NO:1～8所示。

2.权利要求1所述多重PCR引物组在检测肉类制品中牛源性成分、猪源性成分、鸡源性成分或鸭源性成分中的一种或多种中的应用

3.权利要求1所述多重PCR引物组在制备快速检测牛、猪、鸡、鸭四种动物源成分的试剂盒中的应用。

4.一种快速鉴别肉类制品中牛猪鸡鸭动物源成分的多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测肉制品DNA或样品裂解液上清；

S2.以步骤S1的DNA或样品裂解液上清为模板，使用权利要求1所述的多重PCR引物组对进行多重PCR扩增；

5.根据权利要求4所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤S2所述多重PCR反应体系如下：1.1×T6 Super PCR Mix 21.3μL，B-F和B-R终浓度为0.34μM，P-F和P-R终浓度为0.34μM，C-F和C-R终浓度为0.3μM，D-F和D-R终浓度为0.3μM，样品DNA模板2.1μL，反应总体系25μL。

6.根据权利要求4所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤S2所述多重PCR反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共30个循环；72℃最终延伸1min。

7.一种快速检测牛、猪、鸡、鸭四种动物源成分的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的多重PCR引物组。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含PCR反应所需试剂。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含PCR阳性对照和阴性对照。

10.权利要求7～9任一项所述的试剂盒在检测肉类制品中牛源性成分、猪源性成分、鸡源性成分或鸭源性成分中的一种或多种中的应用。