CN105506167A - 同步检测肉及肉制品中动物源性成分的方法 - Google Patents

同步检测肉及肉制品中动物源性成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同步检测肉及肉制品中动物源性成分的方法，属于肉及肉制品分子生物学鉴别/检测技术领域。该检测方法包括：提取待检测样品基因组DNA，用单一通用引物扩增样品线粒体DNA？CO？Ⅰ区段中的目的片段(710bp)，扩增后采用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果显示与目的片段条带一致，再用特定限制性内切酶将其酶切为不同大小的物种特异性DNA片段，采用3％琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，根据特征性酶切条带判定样品中物种组成。具有操作简便、准确可靠、检测时间短、性价比高、多物种同时鉴别等优点，可在动物食品安全检测领域广泛推广应用。

Description

同步检测肉及肉制品中动物源性成分的方法
技术领域
本发明涉及一种同步检测肉及肉制品中动物源性成分的方法，属于肉及肉制品分子生物学鉴别/检测技术领域。
背景技术
民以食为天，食以安为先，吃放心健康绿色的肉类制品是食品质量安全的一个重要方面。但是在动物源性原料和加工产品中，经常出现动物成分掺假、造假、掺杂和无意污染的现象。国内市场近期曝光的多起肉类掺假事件已引起公众对食品安全的担忧，即使在拥有世界上最严格食品安全制度的欧洲，亦难免出现挂羊头卖狗肉的造假现象。
牛肉是全世界人民钟爱的肉类食品，富含氨基酸、维生素B12、铁元素等营养成分，并且牛肉中蛋白质含量高，脂肪含量低，味道极为鲜美，享有“肉中娇子”的美称。目前，市场上牛肉的价格普遍高于其他肉类，这也使得一些不法商贩在利润的驱使下以次充好，用便宜、劣质的牛肉替换优质牛肉进行销售，甚至一些商贩直接挂羊头卖狗肉，用其他肉类冒充牛肉进行销售。
肉的掺假涉及食品安全、公共卫生、宗教等诸多方面，对人们生活有极大的负面影响，不仅严重违反肉类市场公平竞争的准则，也会严重影响消费者的身心健康，损害消费者权益。在肉类掺假形式层出不穷的当下，开发并应用能快速、准确鉴别动物源性成分的新技术已成为食品安全领域的研究热点。
传统的动物源性成分检测方法涉及解剖学、组织学、化学、生物化学、光谱、色谱、免疫学等诸多领域技术，包括基于核酸的分子生物学技术(如PCR、实时定量PCR、分子指纹技术等)、基于蛋白质分子结构的免疫分析技术、红外光谱技术以及质谱技术等，但均表现出一定的局限性。如公布号CN105177150A的发明专利公开的一种猪羊牛动物源性成分快速检测方法，包括：以待检样品总DNA为模板，利用引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行多重PCR扩增，扩增完毕凝胶电泳判定结果，扩增出290bp条带即包含猪源性成分，370bp条带包含羊源性成分，190bp条带包含牛源性成分，该方法灵敏度高、特异性强，可同时对样品中猪羊牛3种动物源性成分作出检测分析，但是对引物配比有一定的要求，并且鉴定物种的数量有限，操作繁琐且检测结果准确性欠佳。
近些年，基于DNA分子技术的发展，以DNA尤其是线粒体DNA为基础的物种鉴定方法优越性凸显。线粒体DNA在高温下稳定，且普遍存在于大多数细胞和组织中，不受个体形态特征限制(取样量小，样本受损不影响识别结果)，也不受个体发育阶段影响，便于提取获得(与常规基因组DNA提取方法无异)，在生物学研究中应用广泛。基于线粒体细胞色素C氧化酶亚单位基因Ⅰ(COⅠ)的DNA条形码技术在动物研究中应用广泛，所采用的标准片段是线粒体COⅠ基因中的一段DNA，通过该标准片段对物种进行快速、准确的识别和鉴定。然而，该技术尚未在肉及肉制品动物源性成分检测中应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种同步检测肉及肉制品中动物源性成分的方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
同步检测肉及肉制品中动物源性成分的方法，包括以下步骤：以包含COⅠ基因的待测样品DNA为模板，利用引物对H/L进行PCR扩增，扩增产物经HpaⅡ酶酶切消化后凝胶电泳分析，根据特征性酶切条带判定结果；
所述引物对H/L为：
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
所述PCR扩增的反应体系为：2×TaqMasterMix(含染料)5μL，10ng/μL模板DNA1μL，10pmol/L引物LCO1490、HCO2198各0.2μL，去离子水3.6μL，总体积10μL。
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，40℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃延伸10min。
所述酶切消化的反应体系为：上述PCR扩增产物3μL、10units/μLHpaⅡ酶0.5μL、10×NEBuffer1.5μL，去离子水5μL，总体积10μL。
所述酶切消化的反应条件为：37℃下，酶切15min。
所述特征性酶切条带与动物源性成分的对应关系为：牛，500bp、70bp；羊，500bp、400bp、230bp、120bp、80bp；猪，350bp、240bp、120bp；鸡，350bp、240bp；乌鸡，450bp、350bp、240bp；鱼，280bp、200bp、120bp；鼠，380bp、350bp；鸭，350bp、280bp、230bp。
本发明的有益效果：
本发明中同步检测肉及肉制品中动物源性成分的方法包括：提取待检测样品基因组DNA，用单一通用引物扩增样品线粒体DNACOⅠ区段中的目的片段(710bp)，扩增后采用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果显示与目的片段条带一致，再用特定限制性内切酶将其酶切为不同大小的物种特异性DNA片段，采用3％琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，根据特征性酶切条带判定样品中物种组成。若牛肉样品中出现其他物种的特征性酶切条带，即表示牛肉中掺杂有其他肉类，可达到检测牛肉掺假的目的。
本发明利用DNA条形码技术(DNABarcoding)，针对线粒体基因高度保守的特性，使用单一通用引物扩增和单一限制性内切酶酶切，通过对扩增和酶切结果的电泳检测及分析，能够准确、快速地对肉及肉制品中动物源性成分进行检测，具有操作简便、准确可靠、检测时间短(8h左右得到检测结果)、性价比高、多物种同时鉴别等优点，可在动物食品(包括熟肉制品)安全检测领域广泛推广应用。
附图说明
图1为试验例中PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为单一肉样PCR产物酶切结果检测的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为混合肉样PCR产物酶切结果检测的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为用于灵敏度检测的混合肉样PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图5为用于灵敏度检测的混合肉样PCR产物酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；
图6为市售冷鲜肉PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳图；
图7为市售冷鲜肉PCR产物酶切结果检测的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
同步检测肉及肉制品中动物源性成分的试剂盒，包含HpaⅡ酶及引物对H/L；
引物对H/L为：
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
实施例2
同步检测肉及肉制品中动物源性成分的试剂盒，包含HpaⅡ酶2000units、10pmol/L引物LCO1490、HCO2198各5mL、2×TaqMasterMix(含染料)50mL、10×NEBuffer30mL、DNAMarker及去离子水100mL；
引物对H/L为：
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
试验例
一、检测范围分析
1、材料准备及基因组DNA的提取、检测
1)基因组DNA的提取
以牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、乌鸡肉、鱼肉、鼠肉、鸭肉的单一肉样以及牛/羊、牛/猪、牛/鸡、牛/鱼、牛/羊/猪、羊/猪等的混合肉样为材料，置20℃下保存至DNA提取，采用通用型柱式基因组提取试剂盒(购自康为世纪生物科技有限公司)提取基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行，提取的基因组DNA于4℃下保存备用；
2)微量分光光度计检测基因组DNA浓度
采用微量分光光度计(ThermoScientificNanoDrop2000)测定DNA样品浓度并保存测定记录，如果OD260/OD280大于1.8，说明样品中DNA纯度较高，提取质量良好；
3)电泳检测DNA质量
采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，检测完毕取出10μLDNA样品，置于4℃下备用，其余存放于-20℃下保存；
2、样品检测
1)单一通用扩增引物合成
以文献记载的无脊椎动物线粒体通用引物为参考(FolmerO,BlackM,HoehW,etal.DNAprimersforamplificationofmitochondrialcytochromecoxidasesubunitIfromdiversemetazoaninvertebrates.[J].MolecularMarineBiology&Biotechnology,1994,3(5):294--299.)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物对H/L，引物序列如SEQIDNO:1、2所示；
2)PCR扩增
以上述提取的基因组DNA为模板，利用引物对H/L进行PCR扩增，扩增反应体系见下表1；
表1PCR扩增反应体系
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，40℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃延伸10min；
3)PCR产物检测
扩增反应完毕，取扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带大小与预期的710bp相符(见图1，图中M为2000bpMarker，N为牛肉样品，Y为羊肉样品，Z为猪肉样品，J为鸡肉样品，WJ为乌鸡肉样品，F为鱼肉样品，R为鼠肉样品，D为鸭肉样品，NY为牛/羊肉各50％混合样品，NZ为牛/猪肉各50％混合样品，NYZ为牛/羊/猪肉各1/3混合样品，NJ为牛/鸡肉各50％混合样品)，可进行后续酶切检测；
4)限制性内切酶HpaⅡ酶切
利用单一限制性内切酶HpaⅡ酶切PCR扩增产物，酶切反应体系见下表2；
表2酶切反应体系
酶切反应条件为：37℃下，酶切15min；
5)酶切结果检测
酶切反应完毕，取酶切产物进行3％琼脂糖凝胶电泳检测；
6)酶切结果及分析
单一肉样酶切结果见图2(图中M为500bpMarker，NG为阴性对照，N为牛肉样品，Y为羊肉样品，Z为猪肉样品，J为鸡肉样品，WJ为乌鸡肉样品，F为鱼肉样品，R为鼠肉样品，D为鸭肉样品)，混合肉样酶切结果见图3(图中M为500bpMarker，N为牛肉样品，Y为羊肉样品，Z为猪肉样品，J为鸡肉样品，F为鱼肉样品，NY为牛/羊肉各50％混合样品，NZ为牛/猪肉各50％混合样品，NJ为牛/鸡肉各50％混合样品，NF为牛/鱼肉各50％混合样品，NYZ为牛/羊/猪肉各1/3混合样品，YZ为羊/猪肉各50％混合样品，D为鸭肉样品)，特征性酶切条带与动物源性成分对应关系见下表3。
表3特征性酶切条带与动物源性成分的对应关系
二、检测方法灵敏度分析
用已知的牛肉和猪肉按照不同比例混合(每个混合样品总量为30mg，W/W)，参照上述检测方法提取基因组DNA，进行PCR扩增，扩增完成后用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果(见图4，图中M为2000bpMarker，各比值分别为猪/牛肉的混合比例，NG为阴性对照)，再用单一限制性内切酶HpaⅡ酶切牛肉和猪肉混合肉样PCR扩增产物，利用3％琼脂糖凝胶电泳技术检测酶切结果(见图5，图中M为2000bpMarker，各比值分别为猪/牛肉的混合比例)。
实施例3
同步检测肉及肉制品中动物源性成分的方法，包括以下步骤：
1)采用通用型柱式基因组提取试剂盒(购自康为世纪生物科技有限公司)提取市售冷鲜肉样品(从某大型综合超市随机抽检得到)的基因组DNA，4℃保存备用；
2)以上述基因组DNA为模板，利用引物对H/L进行PCR扩增(引物序列如SEQIDNO:1、2所示)，扩增反应体系及程序如下：
反应体系为：2×TaqMasterMix(含染料)5μL，10ng/μL模板DNA1μL，10pmol/L引物LCO1490、HCO2198各0.2μL，去离子水3.6μL，总体积10μL；
反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，40℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃延伸10min；
3)扩增反应完毕，取扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带大小与预期的710bp相符(见图6，图中M为2000bpMarker，1～16为市售冷鲜肉样品，NG为阴性对照)，再进行HpaⅡ酶酶切消化处理，酶切反应体系及条件如下：
酶切体系为：上述PCR扩增产物3μL、10units/μLHpaⅡ酶0.5μL、10×NEBuffer1.5μL，去离子水5μL，总体积10μL；
酶切条件为：37℃下，酶切15min；
4)酶切反应完毕，取酶切产物进行3％琼脂糖凝胶电泳检测(见图7，图中M为500bpMarker，1～12为市售冷鲜肉样品，NG为阴性对照)，从图中可以看出，酶切结果包含500bp、350bp、240bp、120bp、70bp特征性酶切条带，判定市售冷鲜肉样品中包含牛肉和猪肉成分。

Claims (6)

1.同步检测肉及肉制品中动物源性成分的方法，其特征在于：包括以下步骤：以包含COⅠ基因的待测样品DNA为模板，利用引物对H/L进行PCR扩增，扩增产物经HpaⅡ酶酶切消化后凝胶电泳分析，根据特征性酶切条带判定结果；
所述引物对H/L为：
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：2×TaqMasterMix5μL，10ng/μL模板DNA1μL，10pmol/L引物LCO1490、HCO2198各0.2μL，去离子水3.6μL，总体积10μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，40℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃延伸10min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述酶切消化的反应体系为：扩增产物3μL、10units/μLHpaⅡ酶0.5μL、10×NEBuffer1.5μL，去离子水5μL，总体积10μL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述酶切消化的反应条件为：37℃下，酶切15min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述特征性酶切条带与动物源性成分的对应关系为：牛，500bp、70bp；羊，500bp、400bp、230bp、120bp、80bp；猪，350bp、240bp、120bp；鸡，350bp、240bp；乌鸡，450bp、350bp、240bp；鱼，280bp、200bp、120bp；鼠，380bp、350bp；鸭，350bp、280bp、230bp。
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