发明内容
本发明对阿胶和牛皮胶中的多肽进行了研究,建立了从多肽水平对阿胶及其制品中牛源性成分进行鉴别的技术,填补了国内外阿胶及其制品鉴别的空白。
本发明首先涉及一组用于单独或组合检测阿胶及其制品中牛源性成分的多肽,所述的阿胶制品包括但不限于阿胶糕、阿胶膏、阿胶浆、阿胶口服液、阿胶糖、阿胶补血颗粒,所述的多肽的序列为:
SEQ ID NO.1:GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR;
SEQ ID NO.2:GPPGPQGPR;
SEQ ID NO.3:PGEVGPPGPPGPAGEK;
SEQ ID NO.4:NGLPGGPGLR;
SEQ ID NO.5:DGASGHPGPIGPPGPR;
SEQ ID NO.6:GDGGPPGATGFPGAAGR;
SEQ ID NO.7:IGQPGAVGPAGIR;
SEQ ID NO.8:GVAGEPGRNGLPGGPGLR;
SEQ ID NO.9:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR;
SEQ ID NO.10:GSTGEIGPAGPPGPPGLR;
SEQ ID NO.11:GDIGSPGR;
SEQ ID NO.12:GEAGSPGIAGPK;
SEQ ID NO.13:GEPGPAGAVGPAGAVGPR;
SEQ ID NO.14:GETGTAGDAGPIGPVGAR;
SEQ ID NO.15:GETGMAGAVGPAGAVGPR;
SEQ ID NO.16:GGPGPAGPR;
SEQ ID NO.17:IGQPGAVGPAGIR;
SEQ ID NO.18:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR;
SEQ ID NO.19:TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK;
SEQ ID NO.20:SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR;
SEQ ID NO.21:GDGGPPGATGFPGAAGR;
SEQ ID NO.22:VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK;
SEQ ID NO.23:NGLPGGPGLR;
SEQ ID NO.24:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR;
SEQ ID NO.25:GIPGPVGAAGATGAR;
SEQ ID NO.26:GEAGPAGPAGPAGPR;
SEQ ID NO.27:IGYAVGPAAVLDAAR;
SEQ ID NO.28:GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR;
SEQ ID NO.29:AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK;
SEQ ID NO.30:AGPPGPPGPAGK;
SEQ ID NO.31:GEPGPAGLPGPPGER;
SEQ ID NO.32:GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR;
SEQ ID NO.33:GETGHAGPAGPIGPVGAR;
SEQ ID NO.34:GPPGSAGAPGK;
SEQ ID NO.35:GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR;
SEQ ID NO.36:GETGPAGPAGPIGPVGAR;
SEQ ID NO.37:SGETGASGPPGFVGEK;
SEQ ID NO.38:GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR;
SEQ ID NO.39:GPPGAGGPPGPR;
SEQ ID NO.40:GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK;
SEQ ID NO.41:DGASGHPGPIGPPGPR;
SEQ ID NO.42:GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER;
SEQ ID NO.43:GPPGESGAAGPTGPIGSR;
SEQ ID NO.44:GPPGAGGPPGPR;
SEQ ID NO.45:GVAGEPGRNGLPGGPGLR;
SEQ ID NO.46:GESGAPGVPGIAGPR;
SEQ ID NO.47:GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR;
SEQ ID NO.48:GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK;
SEQ ID NO.49:PGEVGPPGPPGPAGEK;
SEQ ID NO.50:GSTGEIGPAGPPGPPGLR。
其m/z分别为:
肽段1:694.7;
肽段2:440.2;
肽段3:737.9;
肽段4:477.8;
肽段5:495.6;
肽段6:729.3;
肽段7:596.8;
肽段8:565.3;
肽段9:611.6;
肽段10:816.9;
肽段11:387.7;
肽段12:528.8;
肽段13:511.6;
肽段14:791.9;
肽段15:777.9;
肽段16:391.2;
肽段17:604.8;
肽段18:908.9;
肽段19:923.5;
肽段20:659.3;
肽段21:737.3;
肽段22:605.3;
肽段23:485.7;
肽段24:601.0;
肽段25:634.3;
肽段26:631.3;
肽段27:722.4;
肽段28:1066.1;
肽段29:879.0;
肽段30:517.8;
肽段31:718.3;
肽段32:705.4;
肽段33:791.9;
肽段34:464.3;
肽段35:711.0;
肽段36:780.9;
肽段37:746.9;
肽段38:700.0;
肽段39:516.8;
肽段40:1169.1;
肽段41:500.9;
肽段42:727.3;
肽段43:790.9;
肽段44:516.8;
肽段45:570.6;
肽段46:677.3;
肽段47:691.7;
肽段48:779.7;
肽段49:745.9;
肽段50:824.9。
50条多肽对应的母离子、子离子见下表1,
表1牛源性多肽序列及其对应的母离子、子离子
本发明所涉及前处理方法包括如下步骤:
(1)对待测样本进行质谱前处理,获得待测多肽滤液:
(2)通过质谱法检测待测样本的多肽成分,分析样本中的动物皮来源成分。
所述的质谱前处理步骤如下:
(1)将待测样品均质成粉末状态,称取0.1g~0.5g阿胶样品或1.0-2.0g阿胶制品,加入1%NH4HCO3溶液,超声处理10~30min使样品完全溶解,定容至50mL;
(2)溶液过0.22μm滤膜;
(3)取10~20μLTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到100μL~200μL上述滤液中,37℃酶解16-18小时,待上机检测。
本发明还涉及两种检测阿胶及其制品的质谱方法,所述的质谱法检测为,
采用AB SCIEX5600质谱检测,
流动相A:0.05~0.2%甲酸-乙腈溶液,流动相B:0.05~0.2%甲酸-水,
流速:0.1~0.5mL/min,
TOF扫描范围:100-3000Da,
正离子反应模式,GS1:35,GS2:45,Curtain Gas:35,ISVF:5500,TEM:500,DP:100,CE:10。
采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测,
流动相A:0.05~0.2%甲酸-乙腈,流动相B:0.05~0.2%甲酸-水,
流速:0.1~0.5mL/min,
电喷雾离子源,正离子反应模式,检测方式:MRM,喷雾电压:5500V,离子传输管温度:475℃;鞘气压力:40;辅助气压力:6。
所述的分析样本中的牛源性成分为,将待测样品的质谱结果对比SEQ ID NO.1~50的各条特异性多肽的质谱谱图,出现SEQ ID NO.1~50的各条特异性多肽的质谱检测谱图时,即可判断该组织样本存在牛源性成分。
附图说明
图1,GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR色谱图
图2,GPPGPQGPR色谱图
图3,PGEVGPPGPPGPAGEK色谱图
图4,NGLPGGPGLR色谱图
图5,DGASGHPGPIGPPGPR色谱图
图6,GDGGPPGATGFPGAAGR色谱图
图7,IGQPGAVGPAGIR色谱图
图8,GVAGEPGRNGLPGGPGLR色谱图
图9,GPPGPMGPPGLAGPPGESGR色谱图
图10,GSTGEIGPAGPPGPPGLR色谱图
图11,GDIGSPGR色谱图
图12,GEAGSPGIAGPK色谱图
图13,GEPGPAGAVGPAGAVGPR色谱图
图14,GETGTAGDAGPIGPVGAR色谱图
图15,GETGMAGAVGPAGAVGPR色谱图
图16,GGPGPAGPR色谱图
图17,IGQPGAVGPAGIR色谱图
图18,GPPGPMGPPGLAGPPGESGR色谱图
图19,TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK色谱图
图20,SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR色谱图
图21,GDGGPPGATGFPGAAGR色谱图
图22,VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK色谱图
图23,NGLPGGPGLR色谱图
图24,GPPGPMGPPGLAGPPGESGR色谱图
图25,GIPGPVGAAGATGAR色谱图
图26,GEAGPAGPAGPAGPR色谱图
图27,IGYAVGPAAVLDAAR色谱图
图28,GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR色谱图
图29,AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK色谱图
图30,AGPPGPPGPAGK色谱图
图31,GEPGPAGLPGPPGER色谱图
图32,GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR色谱图
图33,GETGHAGPAGPIGPVGAR色谱图
图34,GPPGSAGAPGK色谱图
图35,GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR色谱图
图36,GETGPAGPAGPIGPVGAR色谱图
图37,SGETGASGPPGFVGEK色谱图
图38,GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR色谱图
图39,GPPGAGGPPGPR色谱图
图40,GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK色谱图
图41,DGASGHPGPIGPPGPR色谱图
图42,GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER色谱图
图43,GPPGESGAAGPTGPIGSR色谱图
图44,GPPGAGGPPGPR色谱图
图45,GVAGEPGRNGLPGGPGLR色谱图
图46,GESGAPGVPGIAGPR色谱图
图47,GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR色谱图
图48,GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK色谱图
图49,PGEVGPPGPPGPAGEK色谱图
图50,GSTGEIGPAGPPGPPGLR色谱图
图51,在纯品驴阿胶胶原中检测SEQ ID NO.1~50所示多肽的色谱特征图
图52,样品1的检测结果图
图53,样品2的检测结果图
图54,驴阿胶对照品检测结果图
实施例1,筛选牛阿胶胶原特异性多肽
通过质谱分析纯品牛胶原样本和驴胶原样本,利用ProteinPilot软件对质谱结果进行检索比对分析,从而确定最优选的牛胶原专属多肽序列。
首先,对选取的纯品胶原样本进行质谱分析,步骤包括:
(一)样本前处理步骤:
(1)称取0.1g~0.5g均质成粉末状态的纯品样品,加入1%NH4HCO3溶液,超声处理10~30min使样品完全溶解,定容至50mL;
(2)溶液过0.22μm滤膜;
(3)取10~20μLTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到100μL~200μL上述滤液中,37℃酶解16-18小时,待上机检测。
(二)上机检测,
(1)采用AB SCIEX5600质谱检测方法如下,
流动相A:0.05~0.2%甲酸-乙腈溶液,流动相B:0.05~0.2%甲酸-水,
流速:0.1~0.5mL/min,
TOF扫描范围:100-3000Da,
正离子反应模式,GS1:35,GS2:45,Curtain Gas:35,ISVF:5500,TEM:500,DP:100,CE:10。
(2)采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测方法如下,
流动相A:0.05~0.2%甲酸-乙腈,流动相B:0.05~0.2%甲酸-水,
流速:0.1~0.5mL/min,
电喷雾离子源,正离子反应模式,检测方式:MRM,喷雾电压:5500V,离子传输管温度:475℃;鞘气压力:40;辅助气压力:6。
其次,依据纯品胶原样本的质谱结果,利用ProteinPilot软件对质谱结果进行检索比对分析,筛选得到在牛胶原中确实存在的专属多肽组,组中的各条多肽序列信息如下:
SEQ ID NO.1:GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR;
SEQ ID NO.2:GPPGPQGPR;
SEQ ID NO.3:PGEVGPPGPPGPAGEK;
SEQ ID NO.4:NGLPGGPGLR;
SEQ ID NO.5:DGASGHPGPIGPPGPR;
SEQ ID NO.6:GDGGPPGATGFPGAAGR;
SEQ ID NO.7:IGQPGAVGPAGIR;
SEQ ID NO.8:GVAGEPGRNGLPGGPGLR;
SEQ ID NO.9:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR;
SEQ ID NO.10:GSTGEIGPAGPPGPPGLR;
SEQ ID NO.11:GDIGSPGR;
SEQ ID NO.12:GEAGSPGIAGPK;
SEQ ID NO.13:GEPGPAGAVGPAGAVGPR;
SEQ ID NO.14:GETGTAGDAGPIGPVGAR;
SEQ ID NO.15:GETGMAGAVGPAGAVGPR;
SEQ ID NO.16:GGPGPAGPR;
SEQ ID NO.17:IGQPGAVGPAGIR;
SEQ ID NO.18:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR;
SEQ ID NO.19:TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK;
SEQ ID NO.20:SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR;
SEQ ID NO.21:GDGGPPGATGFPGAAGR;
SEQ ID NO.22:VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK;
SEQ ID NO.23:NGLPGGPGLR;
SEQ ID NO.24:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR;
SEQ ID NO.25:GIPGPVGAAGATGAR;
SEQ ID NO.26:GEAGPAGPAGPAGPR;
SEQ ID NO.27:IGYAVGPAAVLDAAR;
SEQ ID NO.28:GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR;
SEQ ID NO.29:AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK;
SEQ ID NO.30:AGPPGPPGPAGK;
SEQ ID NO.31:GEPGPAGLPGPPGER;
SEQ ID NO.32:GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR;
SEQ ID NO.33:GETGHAGPAGPIGPVGAR;
SEQ ID NO.34:GPPGSAGAPGK;
SEQ ID NO.35:GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR;
SEQ ID NO.36:GETGPAGPAGPIGPVGAR;
SEQ ID NO.37:SGETGASGPPGFVGEK;
SEQ ID NO.38:GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR;
SEQ ID NO.39:GPPGAGGPPGPR;
SEQ ID NO.40:GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK;
SEQ ID NO.41:DGASGHPGPIGPPGPR;
SEQ ID NO.42:GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER;
SEQ ID NO.43:GPPGESGAAGPTGPIGSR;
SEQ ID NO.44:GPPGAGGPPGPR;
SEQ ID NO.45:GVAGEPGRNGLPGGPGLR;
SEQ ID NO.46:GESGAPGVPGIAGPR;
SEQ ID NO.47:GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR;
SEQ ID NO.48:GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK;
SEQ ID NO.49:PGEVGPPGPPGPAGEK;
SEQ ID NO.50:GSTGEIGPAGPPGPPGLR。
上述50条多肽的质谱谱图和m/z的数值如下:
图1是多肽GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为694.7。
图2是多肽GPPGPQGPR在牛胶原中的色谱图,其m/z为440.2。
图3是多肽PGEVGPPGPPGPAGEK在牛胶原中的色谱图,其m/z为737.9。
图4是多肽NGLPGGPGLR在牛胶原中的色谱图,其m/z为477.8。
图5是多肽DGASGHPGPIGPPGPR在牛胶原中的色谱图,其m/z为495.6。
图6是多肽GDGGPPGATGFPGAAGR在牛胶原中的色谱图,其m/z为729.3。
图7是多肽IGQPGAVGPAGIR在牛胶原中的色谱图,其m/z为596.8。
图8是多肽GVAGEPGRNGLPGGPGLR在牛胶原中的色谱图,其m/z为565.3。
图9是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛胶原中的色谱图,其m/z为611.6。
图10是多肽GSTGEIGPAGPPGPPGLR在牛胶原中的色谱图,其m/z为816.9。
图11是多肽GDIGSPGR在牛胶原中的色谱图,其m/z为387.7。
图12是多肽GEAGSPGIAGPK在牛胶原中的色谱图,其m/z为528.8。
图13是多肽GEPGPAGAVGPAGAVGPR在牛胶原中的色谱图,其m/z为511.6。
图14是多肽GETGTAGDAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为791.9。
图15是多肽GETGMAGAVGPAGAVGPR在牛胶原中的色谱图,其m/z为777.9。
图16是多肽GGPGPAGPR在牛胶原中的色谱图,其m/z为391.2。
图17是多肽IGQPGAVGPAGIR在牛胶原中的色谱图,其m/z为604.8。
图18是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛胶原中的色谱图,其m/z为908.9。
图19是多肽TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK在牛胶原中的色谱图,其m/z为923.5。
图20是多肽SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为659.3。
图21是多肽GDGGPPGATGFPGAAGR在牛胶原中的色谱图,其m/z为737.3。
图22是多肽VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK在牛胶原中的色谱图,其m/z为605.3。
图23是多肽NGLPGGPGLR在牛胶原中的色谱图,其m/z为485.7。
图24是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛胶原中的色谱图,其m/z为601.0。
图25是多肽GIPGPVGAAGATGAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为634.3。
图26是多肽GEAGPAGPAGPAGPR在牛胶原中的色谱图,其m/z为631.3。
图27是多肽IGYAVGPAAVLDAAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为722.4。
图28是多肽GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为1066.1。
图29是多肽AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK在牛胶原中的色谱图,其m/z为879.0。
图30是多肽AGPPGPPGPAGK在牛胶原中的色谱图,其m/z为517.8。
图31是多肽GEPGPAGLPGPPGER在牛胶原中的色谱图,其m/z为718.3。
图32是多肽GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为705.4。
图33是多肽GETGHAGPAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为791.9。
图34是多肽GPPGSAGAPGK在牛胶原中的色谱图,其m/z为464.3。
图35是多肽GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为711.0。
图36是多肽GETGPAGPAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为780.9。
图37是多肽SGETGASGPPGFVGEK在牛胶原中的色谱图,其m/z为746.9。
图38是多肽GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR在牛胶原中的色谱图,其m/z为700.0。
图39是多肽GPPGAGGPPGPR在牛胶原中的色谱图,其m/z为516.8。
图40是多肽GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK在牛胶原中的色谱图,其m/z为1169.1。
图41是多肽DGASGHPGPIGPPGPR在牛胶原中的色谱图,其m/z为500.9。
图42是多肽GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER在牛胶原中的色谱图,其m/z为727.3。
图43是多肽GPPGESGAAGPTGPIGSR在牛胶原中的色谱图,其m/z为790.9。
图44是多肽GPPGAGGPPGPR在牛胶原中的色谱图,其m/z为516.8。
图45是多肽GVAGEPGRNGLPGGPGLR在牛胶原中的色谱图,其m/z为570.6。
图46是多肽GESGAPGVPGIAGPR在牛胶原中的色谱图,其m/z为677.3。
图47是多肽GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR在牛胶原中的色谱图,其m/z为691.7。
图48是多肽GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK在牛胶原中的色谱图,其m/z为779.7。
图49是多肽PGEVGPPGPPGPAGEK在牛胶原中的色谱图,其m/z为745.9。
图50是多肽GSTGEIGPAGPPGPPGLR在牛胶原中的色谱图,其m/z为824.9。
最后,用相同的方法处理并检测驴胶原样本,质谱检测结果进行匹配,结果显示,SEQ ID NO.1~50所示的各条多肽样本,在驴胶原中不存在。
图51是在驴胶原中检测上述多肽SEQ ID NO.1~50的色谱特征图,可见谱图中未检出SEQ ID NO.1~50所述的色谱峰。