CN106680398B - 一种用于检测阿胶糕中阿胶含量的组合物及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测阿胶糕中阿胶含量的组合物及其检测方法。所述组合物由多肽I、多肽II、多肽III以及对照品检测基质组成，所述多肽I的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，多肽II的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，多肽III的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，对照品检测基质为鱼皮胶。该组合物可用于检测阿胶糕中驴皮源成分含量，从而判断阿胶真伪。通过多肽I的检测值减去多肽II的检测值，并利用多肽III的检测值来修正检测偏差，从而实现对阿胶糕中驴皮源成分的含量检测。该方法具有含量检测准确、操作简单的优点，具有广泛的应用前景。

Description

一种用于检测阿胶糕中阿胶含量的组合物及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种阿胶糕中阿胶含量的组合物及其检测方法，属于医药与食品检测技术领域。
背景技术
常言道：“秋冬进补，来年打虎”。阿胶是一种药食两用食材，具有滋阴补血等功效，为秋冬进补之佳品。阿胶的主要食用方法是将阿胶用黄酒熬制后加入黑芝麻、核桃仁等，加工成阿胶糕来食用。然而随着阿胶价格逐年上涨，市场上出现了很多不法分子，在生产阿胶时，部分甚至全部用各种其他动物皮包括马皮、骡皮、牛皮、猪皮等来取代驴皮进行熬制，有的甚至直接掺入工业明胶。这些伪品的存在不但损害了消费者利益，而且严重干扰了市场正常秩序，影响正规产品的信誉。
中国药典规定，阿胶为马科动物驴Equus asinus L.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。纯正的阿胶必需来自百分百的驴皮，方能保证产品的功效。阿胶经长时间高温蒸煮浓缩而成，不同动物皮熬制而成的胶主要成分非常相近，且不同厂家的生产工艺存有差异，采用红外、近红外、X-衍射、HPLC等方法对阿胶进行真伪鉴别常存在判断不准确、缺乏足够说服力等。
目前已报道的鉴别阿胶真伪比较权威的方法主要是DNA分子鉴定方法和检测特征性肽段的液质联用方法。已报道的这两种方法都无法对阿胶中驴皮源成分进行比较准确的定量检测，而是通过检测阿胶中是否含有驴的成分，并排除其他动物源成分来判断阿胶真伪；但阿胶的掺假可能会五花八门，因此需要排除的动物源成分会是多种多样，利用排除法来鉴别阿胶真伪存在重要缺陷，其准确性和可靠性会大打折扣，这种情况非常不利于对市场阿胶类产品的监管。利用驴皮源成分含量来判断阿胶真伪，可从根本上限制阿胶的造假行为。已报道的文献中，对驴皮源性成分检测，基本都没有排除马皮源性成分，因此虽宣称为驴皮源成分，实则为驴与马共有。
因此，目前迫切需要提出一种能够快速、准确检测阿胶糕中阿胶含量的方法，进而实现对阿胶产品的真伪鉴别。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供快速、准确检测阿胶糕中阿胶含量的组合物。
本发明的另一个目的在于，提供快速、准确检测阿胶糕中阿胶含量的检测方法。
本发明的再一个目的在于，提供用于快速、准确检测阿胶糕中阿胶含量的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的一种用于检测阿胶糕中阿胶含量的组合物，其由多肽I、多肽II、多肽III以及对照品检测基质组成，其中，所述多肽I的氨基酸序列为Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg(SEQ ID NO.1所示)，多肽II的氨基酸序列为Gly-Ile-Hyp-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Arg(SEQ ID NO.2所示)，多肽III的氨基酸序列为Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg(SEQ ID NO.3所示)，对照品检测基质为鱼皮胶。
含有所述的组合物的试剂盒也在本发明的保护范围之内。
进一步的，本发明还提出了一种使用所述的组合物或试剂盒检测阿胶中阿胶含量的方法，其包括如下步骤：
1)对照品溶液的制备：
对照品检测基质粉碎后，称取一定量的对照品检测基质于量瓶中，加入NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，得到基质溶液，用配制得到的基质溶液溶解称量好的多肽I、多肽II和多肽III，摇匀，得到对照品母液，采用分步稀释的方法，以基质溶液为溶剂，将对照品母液稀释500-10000倍，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；
2)待检测样品溶液的制备：
将待检样品粉碎均质后，称取一定量(重量记为N1)，加入水充分混合，离心，取上清液加入三氯乙酸和水，超声5-20min，4℃静置，离心后去除上清液，沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重(重量记为N2)，称取一定量的沉淀干燥物，用胰蛋白酶酶解；
3)将对照品溶液、待检测样品溶液分别放入液质联用仪，选择m/z393.4→499.3、643.3，m/z634.7→927.5、830.4，m/z444.0→331.2、613.3作为检测离子对进行MRM扫描，其中选择m/z393.4→499.3、m/z634.7→927.5、m/z444.0→331.2分别作为多肽I、多肽II、多肽III的检测离子进行定量检测，待检测阿胶样品中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3；
4)按下式计算出阿胶糕样品中阿胶的含量：
阿胶糕中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％。
在本发明所述的方法中，优选的，所述的对照品溶液的制备包括以下步骤：
1)基质溶液的制备：对照品检测基质粉碎后加入15％(w/v)的三氯乙酸的水溶液，超声5-20min，4℃静置，离心后去除上清液，沉淀用丙酮洗涤、干燥，称取干燥后的对照品检测基质0.50g于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀；
2)对照品母液的制备：称取15.3mg的多肽I、24.7mg的多肽II和17.3mg的多肽III于25ml量瓶中，用步骤1)配制的基质溶液稀释至刻度，摇匀，得到对照品母液；
3)对照品溶液的制备：采用分步稀释的方法，以基质溶液为溶剂，将对照品母液稀释500-10000倍，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤2)中所述的待检测样品溶液的制备包括以下步骤：将待检样品粉碎均质后称取5.0g(重量记为N1)，加入10ml水充分混合，8000rpm离心10min，取上清液5ml，加入30％(w/v)的三氯乙酸溶液5ml，超声15min，4℃静置30min，离心后去除清液，沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重，重量记为N2，称取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液溶解后，用1％(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤3)中液质联用仪检测的液相条件为：C18反相色谱柱，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％甲酸(v/v)的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0→40min，流动相A 100％→50％，流动相B 0％→50％，质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测。
更进一步的，本发明还提出了所述的组合物及其试剂盒在检测阿胶糕中阿胶含量中的应用。
直接对阿胶中驴皮源成分进行准确的含量检测，首先要找出能标志驴皮源成分且在不同生产工艺的纯品阿胶中含量相对稳定的物质，尤其要去除与驴亲缘关系较近的马、骡等的伪品成分；其次阿胶中的成分非常复杂，检测时信号不稳定，因此该物质要满足在检测时具有较高的信号响应、较低的噪音及其他物质干扰，还应考虑检测信号的稳定性；第三需要设立合适的对照品等。对此，本发明通过选取驴皮源性特征性多肽，并采用多肽I的检测值减去多肽II的检测值，并利用多肽III的检测值来修正检测偏差，从而实现对阿胶糕中驴皮源成分的含量检测。实验证明，采用本发明的方法，能够准确地检测阿胶糕中驴皮源成分的含量，且操作简单，在阿胶产品质量监控领域将具有广泛的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1是对照品溶液MRM扫描模式下选择离子对m/z393.4→499.3、m/z634.7→927.5、m/z444.0→331.2监测的质谱图；
图2是各种纯品胶MRM扫描模式下选择离子对m/z393.4→499.3、m/z634.7→927.5、m/z444.0→331.2监测的质谱图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
1材料和试剂
材料：各种纯品胶，包括阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、羊皮胶、鱼皮胶(对照品检测基质)，分别用驴皮、马皮、牛皮、猪皮、羊皮、鱼皮煎煮获得。
阿胶糕：分别由上述纯品胶加入黄酒、冰糖、黑芝麻、核桃仁熬制而成，包括用阿胶熬制成的阿胶糕样品(阿胶约占阿胶糕总重量的23％)、用马皮胶熬制成的阿胶糕伪品(阿胶含量为0％)、用黄明胶熬制成的阿胶糕伪品(阿胶含量为0％)、用猪皮胶熬制成的阿胶糕伪品(阿胶含量为0％)、用羊皮胶熬制成的阿胶糕伪品(阿胶含量为0％)。
多肽I(SEQ ID NO.1所示)、多肽II(SEQ ID NO.2所示)、多肽III(SEQ ID NO.3所示)交由生物公司合成。
试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯)。
2检测方法
1)基质溶液的制备：
称取0.50g对照品检测基质于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)的NH4HCO3溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)的NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀。
2)对照品母液的制备：
称取15.3mg的多肽I、24.7mg的多肽II和17.3mg的多肽III于25ml量瓶中，用上述配制的基质溶液稀释至刻度，摇匀。
3)对照品溶液的制备：
采用分步稀释的方法，以基质溶液为溶剂，将对照品母液稀释1000倍，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。
4)待检测样品溶液的制备：
将待检样品粉碎均质后称取5.0g(重量记为N1)，加入10ml水震荡充分混合，8000rpm离心10min，取上清液5ml，加入30％(w/v)的三氯乙酸溶液5ml，超声15min，4℃静置30min，离心后去除清液，沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重(重量记为N2)，称取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)的NH4HCO3溶液(pH8.0)溶解后，用1％(w/w)的NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。
5)分别取对照品溶液、待检测样品溶液各5μl放入液质联用仪进行检测。液相条件：C18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0→40min，流动相A 100％→50％，流动相B 0％→50％。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测，选择m/z393.4→499.3、643.3，m/z634.7→927.5、830.4，m/z444.0→331.2、613.3作为检测离子对进行MRM扫描，其中选择m/z393.4→499.3、m/z634.7→927.5、m/z444.0→331.2分别作为多肽I、多肽II和多肽III的定量离子对。待检测阿胶样品中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3；
6)计算出阿胶糕样品中阿胶的含量：
图1是对照品溶液MRM扫描模式下选择离子对m/z393.4→499.3、m/z634.7→927.5、m/z444.0→331.2监测的质谱图；图2是各种纯品胶MRM扫描模式下选择离子对m/z393.4→499.3、m/z634.7→927.5、m/z444.0→331.2监测的质谱图。
通过将对照品与待检样品的质谱图峰面积比对，计算出待检样品中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待检测阿胶样品中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3，然后，按下式计算出各样品中阿胶的含量：
样品中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％。
阿胶糕中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％＝(0.2679/784.8–0/1267.4)×1771.8/0.6042×3×0.3518/5.0520×100％＝21.4％
马皮胶熬制成的阿胶糕伪品中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％＝(0/784.8–0/1267.4×1771.8/0.5882×3×0.3625/5.0126×100％＝0％
黄明胶熬制成的阿胶糕伪品中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％＝(0.2558/784.8–0.4482/1267.4)×1771.8/0.5912×3×0.3588/5.0015×100％＝-1.8％≈0％
猪皮胶熬制成的阿胶糕伪品中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％＝(0/784.8–0/1267.4)×1771.8/0.6102×3×0.3565/5.0237×100％＝0％
羊皮胶熬制成的阿胶糕伪品中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％＝(0.2662/784.8–0.4326/1267.4)×1771.8/0.5884×3×0.3579/5.0122×100％＝-0.14％≈0％
上述计算结果表明：阿胶糕中阿胶的含量为21.4％，马皮胶、黄明胶、猪皮胶和羊皮胶中驴皮源成分的含量为0％。这与实际情况相符，表明该方法能从阿胶含量的角度准确区分阿胶糕与伪品糕。
实施例2
1材料和试剂
材料：
混合胶样品由实施例1中的纯品胶样品分别加入不同质量的阿胶制成，包括含15％阿胶的黄明胶、含30％阿胶的黄明胶、含60％阿胶的黄明胶。
阿胶糕：分别由上述混合胶样品加入黄酒、冰糖、黑芝麻、核桃仁熬制而成，包括用15％阿胶的黄明胶熬制成的阿胶糕样品(阿胶约占阿胶糕总重量的3.5％)、用30％阿胶的黄明胶熬制成的阿胶糕样品(阿胶约占阿胶糕总重量的6.9％)、用60％阿胶的黄明胶熬制成的阿胶糕样品(阿胶约占阿胶糕总重量的13.0％)，分别命名为样品1、样品2、样品3。
多肽I、多肽II、多肽III，鱼皮胶(对照品检测基质)的制备同实施例1.
试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯)
2检测方法
1)基质溶液的制备：
称取0.50g对照品检测基质于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH4HCO3溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀。
2)对照品母液的制备：
称取15.3mg的多肽I、24.7mg的多肽II和17.3mg的多肽III于25ml量瓶中，用上述配制的基质溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
3)对照品溶液的制备：
采用分步稀释的方法，以基质溶液为溶剂，分别将对照品母液稀释500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、10000倍，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。
4)待检测样品溶液的制备：
将待检样品粉碎均质后称取5.0g(重量记为N1)，加入10ml水震荡充分混合，8000rpm离心10min，取上清液5ml加入30％(w/v)的三氯乙酸溶液5ml，超声15min，4℃静置30min，离心后去除清液，沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重(重量记为N2)，称取0.05g的沉淀物于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)的NH4HCO3溶液(pH8.0)溶解后，用1％(w/w)的NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。
5)分别取对照品溶液、待检测纯品胶样品溶液各5μl放入液质联用仪进行检测。液相条件：C18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％甲酸的水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0→40min，流动相A 100％→50％，流动相B 0％→50％。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测，选择m/z393.4→499.3、643.3，m/z634.7→927.5、830.4，m/z444.0→331.2、613.3作为检测离子对进行MRM扫描，其中选择m/z393.4→499.3、m/z634.7→927.5、m/z444.0→331.2分别作为多肽I、多肽II和多肽III的定量离子对。待检测阿胶样品中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3；
6)计算出阿胶糕样品中阿胶的含量：
以对照品溶液的各多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制，各多肽的线性相关系数R≥0.998，由此计算出待检样品中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待检测阿胶样品中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3，然后，按下式计算出各样品中阿胶的含量：
样品中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％。
样品1中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％＝(0.2733/784.8–0.3667/1267.4)×1771.8/0.6082×3×0.3622/5.0086×100％＝3.7％
样品2中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％＝(0.2702/784.8–0.3052/1267.4)×1771.8/0.5992×3×0.3652/5.0084×100％＝6.7％
样品3中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％＝(0.2688/784.8–0.1756/1267.4)×1771.8/0.6102×3×0.3612/5.0116×100％＝12.8％
上述计算结果表明：检测含量与实际情况相符，表明该方法能准确检测阿胶糕中阿胶成分的含量，从而实现判别阿胶糕真伪的目的。
综上所述，利用本发明公开的三个多肽以及对照品检测基质，采用液质联用仪，能准确检测阿胶糕中阿胶的含量。
需要说明的是，以上实施例仅用以说明发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域技术人员对本发明作的各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。
序列表
<110> 东阿阿胶股份有限公司
<120> 一种用于检测阿胶糕中阿胶含量的组合物及其检测方法
<130> KLPI161257
<160> 3
<170>PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 多肽I
<400> 1
Gly Ala Thr Gly Pro Ala Gly Val Arg
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 多肽II
<400> 2
Gly Ile Hyp Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 多肽III
<400> 3
Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg

Claims (4)

1.一种检测阿胶糕中阿胶含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)对照品溶液的制备：
对照品检测基质粉碎后，称取一定量的对照品检测基质于量瓶中，加入NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，得到基质溶液，用配制得到的基质溶液溶解称量好的多肽I、多肽II和多肽III，摇匀，得到对照品母液，采用分步稀释的方法，以基质溶液为溶剂，将对照品母液稀释500-10000倍，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；
其中，所述多肽I的氨基酸序列为Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg，多肽II的氨基酸序列为Gly-Ile-Hyp-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Arg，多肽III的氨基酸序列为Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg，对照品检测基质为鱼皮胶；
2)待检测样品溶液的制备：
将待检样品粉碎均质后，称取一定量，重量记为N1，加入水充分混合，离心，取上清液加入三氯乙酸和水，超声5-20min，4℃静置，离心后去除上清液，沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重，重量记为N2，称取一定量的沉淀干燥物，用胰蛋白酶酶解；
3)将对照品溶液、待检测样品溶液分别放入液质联用仪，选择m/z393.4→499.3、643.3，m/z634.7→927.5、830.4，m/z444.0→331.2、613.3作为检测离子对进行MRM扫描，其中选择m/z393.4→499.3、m/z634.7→927.5、m/z444.0→331.2分别作为多肽I、多肽II、多肽III的检测离子进行定量检测，待检测阿胶样品中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3；
4)按下式计算出阿胶糕样品中阿胶的含量：
阿胶糕中阿胶的含量(％)＝(M1/784.8–M2/1267.4)×1771.8/M3×3×N2/N1×100％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对照品溶液的制备包括以下步骤：
1)基质溶液的制备：对照品检测基质粉碎后，称取0.50g的对照品检测基质于250ml量瓶中，加少量1％w/w pH8.0的NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，用1％w/w pH8.0的NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀；
2)对照品母液的制备：称取15.3mg的多肽I、24.7mg的多肽II和17.3mg的多肽III于25ml量瓶中，用步骤1)配制的基质溶液稀释至刻度，摇匀，得到对照品母液；
3)对照品溶液的制备：采用分步稀释的方法，以基质溶液为溶剂，将对照品母液稀释500-10000倍，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的待检测样品溶液的制备包括以下步骤：将待检样品粉碎均质后称取5.0g，重量记为N1，加入10ml水充分混合，离心，取上清液5ml，加入30％w/v的三氯乙酸溶液5ml，超声15min，4℃静置30min，离心后去除清液，沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重，重量记为N2，称取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中，加入少量1％w/w pH8.0的NH4HCO3溶液溶解后，用1％w/w pH8.0的NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中液质联用仪检测的液相条件为：C18反相色谱柱，流动相A为0.1％v/v甲酸的水溶液，流动相B为0.1％甲酸v/v的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0→40min，流动相A 100％→50％，流动相B 0％→50％，质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测。
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