CN105651716A - 生鲜乳中皮革水解蛋白l-羟脯氨酸的酶标快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生鲜乳中皮革水解蛋白L-羟脯氨酸的酶标快速检测方法，包括如下步骤：步骤1、试剂准备；步骤2、样品和标准品的制备；步骤3、酶标检测；步骤4、标准曲线建立和结果计算。本发明的检测方法灵敏度高，重复性好，检测速度快，适用于生鲜乳中皮革水解蛋白的快速筛查。而且本发明检测方法与卫生部指定方法相比所用时间要缩短三分之二以上，而所用试剂量几乎是它的百分之三，故本发明方法检测快速、成本低、环境污染少。

Description

生鲜乳中皮革水解蛋白L-羟脯氨酸的酶标快速检测方法

技术领域

本发明涉及生鲜乳检测技术领域，更具体的涉及一种生鲜乳中皮革水解蛋白L-羟脯氨酸的酶标快速检测方法。

背景技术

L-羟脯氨酸，英文名称hydroxyproline，简称HYP，又名反式-4-羟基-L-脯氨酸，分子式为C5H9NO3，分子量131.13。

L-羟脯氨酸是一种亚氨基酸，通常在脯氨酸的第4位上带有羟基，但有时也在第3位上。L-羟脯氨酸是胶原蛋白所特有的氨基酸，约占胶原蛋白中氨基酸总量的10％，而在其他蛋白质中含量甚微，这使得它几乎成为胶原蛋白所特有的成分，因而可通过测定L-羟脯氨酸含量来计算胶原蛋白的含量，从而确定胶原蛋白的总体水平。

动物胶原水解蛋白是一种廉价蛋白原料，是将牛皮及其制品下脚料等成分粗加工后制成的水解蛋白质，皮革水解蛋白粉就是利用皮革下脚料甚至动物毛发等物质，经水解而生成的一种粉状物，因其氨基酸或者说蛋白含量较高，故人们称之为皮革水解蛋白粉。某些非法厂家在生鲜乳中掺入廉价的水解动物蛋白来冒充或替代乳蛋白质，提高乳中蛋白的质量分数，降低成本。掺加动物胶原水解蛋白不但会影响乳的口感和风味，改变牛乳的溶解度，因其氨基酸的组成不合理，且不易消化，所以营养价值低下，导致人体吸收利用率降低，会严重影响消费者的健康状况。严格来讲皮革水解蛋白粉对人体健康并无伤害，不过其前提条件是所用皮革必须是未经糅制、染色等人工加工处理过的；然而这样的皮革水解蛋白粉是不存在的，因为经过糅制、染色等人工加工处理过的皮革比直接制作成蛋白粉利润要高得多，因而皮革水解蛋白粉多用皮革厂制作服装、皮鞋后的下脚料来生产，自然这种蛋白粉中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进来的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，如果长期食用含有皮革水解蛋白粉的食物，铬重金属离子便会被人体吸收、积累、中毒，使人体关节疏松肿大，甚至造成儿童死亡。

L-羟脯氨酸为人体非必需氨基酸，是机体胶原蛋白(动物水解蛋白)的主要成分之一，含量相对稳定，为胶原蛋白中的特有组分，其含量占10％以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若样品中含有L(-)-羟脯氨酸，可判定添加了动物水解蛋白。其检测方法包括比色法、电泳法、高效液相色谱法等。目前常用的比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比色法检测试剂毒性高，操作相对繁琐。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种生鲜乳中皮革水解蛋白L-羟脯氨酸的酶标快速检测方法，该方法灵敏度高，重复性好，检测速度快，适用于生鲜乳中皮革水解蛋白的快速筛查。

本发明是这样实现的，一种生鲜乳中皮革水解蛋白L-羟脯氨酸的酶标快速检测方法，包括如下步骤：

步骤1、试剂准备：包括氯胺T溶液配制、显色剂配制、L-羟脯氨酸标准储备液配制、L-羟脯氨酸标准工作液配制；

步骤2、样品和标准品的制备：

a、样品制备：准确称取生鲜乳2g，精确到0.0001g，置于水解管中，加浓盐酸2.00mL，加入2滴50g/L苯酚溶液，氮吹3min，在充氮气的状态下封口，将已封口的水解管放入110℃的恒温干燥箱内，水解12h，取出，打开水解管，将水解液经滤纸过滤到250mL容量瓶中，用水反复冲洗水解管和滤纸，洗液并入滤液中，定容，摇匀，作为样品待测；

b、标准品制备：准确称取浓度为20.0μg/mL的L-羟脯氨酸标准工作液0.00mL、2.50mL、5.00mL、7.50mL、10.00mL分别于100mL容量瓶中，用水定容，摇匀，得到浓度分别为0μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL的溶液，作为标准品；

步骤3、酶标检测：

步骤3.1、准备足够用的空白酶标板；

步骤3.2、用移液枪吸取标准品和样品150μL，分别加入到指定的微孔中，然后加入60μL现配的氯胺T溶液到每一个微孔中，用封口膜把酶标板盖住，室温放置20分钟；

步骤3.3、用8通道移液枪移取60μL显色剂到每一孔里，用封口膜将酶标板封好，放到60℃干燥箱中20分钟；

步骤3.4、取出酶标板，室温放置数分钟，待其到室温后，用560nm的酶标仪测定吸光度值；

步骤4、标准曲线建立和结果计算；

以对标准品所测吸光值为纵坐标，以相应的L-羟脯氨酸的浓度作为横坐标，绘制标准曲线，然后根据样品测定的吸光值，从标准曲线中读出样品中L-羟脯氨酸的的浓度c，利用如下公式计算出生鲜乳中L-羟脯氨酸的含量：

$X=\frac{c\×v}{m}$

式中：X-生鲜乳中L-羟脯氨酸的含量，以％表示；

c-从标准曲线上查得相应的L-羟脯氨酸的浓度，单位为μg/mL；

v-样品溶液的体积，mL；

m-样品中生鲜乳的质量，单位为g。

本发明的特点还在于，所述步骤1中，氯胺T溶液配制方式具体为：将1.41g氯胺T溶于10mL水中，然后依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲液；

显色剂配制方式具体为：称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35mL的纯高氯酸溶解，再缓慢加入65mL异丙醇。

L-羟脯氨酸标准储备液配制方式具体为：称取100.00mg的L-羟脯氨酸用少量水溶解，加一滴6mol/L的盐酸，用水定容至100mL容量瓶中，得到1.0mg/mL的L-羟脯氨酸标准储备液；

L-羟脯氨酸标准工作液配制方式具体为：吸取标准储备液2.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，得到20.0μg/mL的L-羟脯氨酸标准工作液。

本发明的特点还在于，所述的标准曲线为y＝0.1248x+0.0644。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种生鲜乳中皮革水解蛋白L-羟脯氨酸的酶标快速检测方法，该检测方法灵敏度高，重复性好，检测速度快，适用于生鲜乳中皮革水解蛋白的快速筛查。而且本发明检测方法与卫生部指定方法相比所用时间要缩短三分之二以上，而所用试剂量几乎是它的百分之三，故本发明方法检测快速、成本低、环境污染少。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的一种生鲜乳中皮革水解蛋白L-羟脯氨酸的酶标快速检测方法流程示意图；

图2为本发明实施例中建立的标准曲线的线性关系图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

图1示例性的示出了本发明实施例提供的一种生鲜乳中皮革水解蛋白L-羟脯氨酸的酶标快速检测方法流程示意图，该方法至少可以应用于乳及乳制品中L-羟脯氨酸含量的测定和判定乳及乳制品中是否添加了动物水解蛋白。这是因为L-羟脯氨酸为胶原蛋白中的特有组分，其含量占10％以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若样品中含有L-羟脯氨酸，则可判定添加了动物水解蛋白。

本发明所用主要仪器设备如下：

酶标分析仪(配置560nm滤光片)，氮吹仪，恒温干燥箱(110℃，60℃)，具盖螺纹口试管(10mL，110℃)，可拆的96孔酶标板(空白板)。

本发明所用试剂如无特殊说明均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。

如图1所示，本发明实施例提供的一种生鲜乳中皮革水解蛋白L-羟脯氨酸的酶标快速检测方法，包括如下步骤：

步骤1、试剂准备：包括氯胺T溶液配制、显色剂配制、L-羟脯氨酸标准储备液配制、L-羟脯氨酸标准工作液配制；

在本发明实施例中，氯胺T溶液配制方式具体为：将1.41g氯胺T溶于10mL水中，然后依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲液；

显色剂配制方式具体为：称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35mL的纯高氯酸溶解，再缓慢加入65mL异丙醇。

L-羟脯氨酸标准储备液配制方式具体为：称取100.00mg的L-羟脯氨酸用少量水溶解，加一滴6mol/L的盐酸，用水定容至100mL容量瓶中，得到1.0mg/mL的L-羟脯氨酸标准储备液；

L-羟脯氨酸标准工作液配制方式具体为：吸取标准储备液2.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，得到20.0μg/mL的L-羟脯氨酸标准工作液。

步骤2、样品和标准品的制备：

a、样品制备：准确称取生鲜乳2g，精确到0.0001g，置于水解管中，加浓盐酸2.00mL，加入2滴50g/L苯酚溶液，氮吹3min，在充氮气的状态下封口，将已封口的水解管放入110℃的恒温干燥箱内，水解12h，取出，打开水解管，将水解液经滤纸过滤到250mL容量瓶中，用水反复冲洗水解管和滤纸，洗液并入滤液中，定容，摇匀，作为样品待测；

b、标准品制备：准确称取浓度为20.0μg/mL的L-羟脯氨酸标准工作液0.00mL、2.50mL、5.00mL、7.50mL、10.00mL分别于100mL容量瓶中，用水定容，摇匀，得到浓度分别为0μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL的溶液，作为标准品。

步骤3、酶标检测：

步骤3.1、准备足够用的空白酶标板；

步骤3.2、用移液枪吸取标准品和样品150μL，分别加入到指定的微孔中，然后加入60μL现配的氯胺T溶液到每一个微孔中，用封口膜把酶标板盖住，室温放置20分钟；

步骤3.3、用8通道移液枪移取60μL显色剂到每一孔里，用封口膜将酶标板封好，放到60℃干燥箱中20分钟；

步骤3.4、取出酶标板，室温放置数分钟，待其到室温后，用560nm的酶标仪测定吸光度值。

步骤4、标准曲线建立和结果计算；

以对标准品所测吸光值为纵坐标，以相应的L-羟脯氨酸的浓度作为横坐标，绘制标准曲线，得到的标准曲线为y＝0.1248x+0.0644，然后根据样品测定的吸光值，从标准曲线中读出样品中L-羟脯氨酸的的浓度c，利用如下公式计算出生鲜乳中L-羟脯氨酸的含量：

$X=\frac{c\×v}{m}$

式中：X-生鲜乳中L-羟脯氨酸的含量，以％表示；

c-从标准曲线上查得相应的L-羟脯氨酸的浓度，单位为μg/mL；

v-样品溶液的体积，mL；

m-样品中生鲜乳的质量，单位为g。

1、本发明检测方法的准确度试验

取10支水解管，每管中均准确加入2g空白生鲜乳(不含L-羟脯氨酸)，其中2个作为空白样品，再精密移取浓度为1.0mg/mL的L-羟脯氨酸储备液100、200、400、500μL各两次，分别置于剩下的8支管中，制成浓度为50μg/g、100μg/g、200μg/g、250μg/g各2个平行样品，共8个加标样品，然后将此10个样品按本发明检测方法进行试验检测。

本试验中，酶标板中样品排列按照表1所示。S1(0.0)、S2(0.5)、S3(1.0)、S4(1.5)、S5(2.0)代表标准曲线中各浓度的标准品；Blank代表空白样品；T1(50)、T2(50)、T3(100)、T4(100)、T5(200)、T6(200)、T7(250)、T8(250)代表各浓度的加标样品。本试验中，酶标板中样品吸光度测定结果如表2所示。

表1酶标板中样品排列

	1	2	3	4
					A	S1(0.0)	S1(0.0)	T2(50)	T2(50)
B	S2(0.5)	S2(0.5)	T3(100)	T3(100)
					C	S3(1.0)	S3(1.0)	T4(100)	T4(100)
D	S4(1.5)	S4(1.5)	T5(200)	T5(200)
					E	S5(2.0)	S5(2.0)	T6(200)	T6(200)
F	Blank 1	Blank 1	T7(250)	T7(250)
					G	Blank 2	Blank 2	T8(250)	T8(250)
H	T1(50)	T1(50)	/	/

表2560nm测定后的结果

根据试验测定结果，建立的标准曲线的线性关系图如图2所示。建立的标准曲线为y＝0.1248x+0.0644，R²＝0.9980。可以看出，本方法中吸光值与浓度呈良好的线性关系，线性范围为0～2.0μg/mL

根据线性关系计算各样品回收率，结果如表3所示。

表3样品回收率

以上检测结果表明，样品浓度在50μg/g～250μg/g范围内，回收率在70％～90％之间，可达到一般检测要求。

2、本发明检测方法的精密度试验

取8支水解管，每管中均准确加入2g空白生鲜乳，再精密移取浓度为1.0mg/mL的L-羟脯氨酸储备液100μL分别置于其中的6支管中，制成2个空白样品、6个浓度为100μg/g的加标样品。然后将各样品按本发明检测方法进行试验检测。

本试验中，酶标板中样品排列按照表4所示。S1(0.0)、S2(0.5)、S3(1.0)、S4(1.5)、S5(2.0)代表标准曲线中各浓度的标准品；Blank代表空白样品；T1(100)、T2(100)、T3(100)、T4(100)、T5(100)、T6(100)代表浓度为100μg/g的6个加标样品。本试验中，酶标板中样品吸光度测定结果如表5所示。

表4酶标板中样品排列

	1	2	3	4
					A	S1(0.0)	S1(0.0)	T2(100)	T2(100)
B	S2(0.5)	S2(0.5)	T3(100)	T3(100)
					C	S3(1.0)	S3(1.0)	T4(100)	T4(100)
D	S4(1.5)	S4(1.5)	T5(100)	T5(100)
					E	S5(2.0)	S5(2.0)	T6(100)	T6(100)
F	Blank 1	Blank 1	/	/
					G	Blank 2	Blank 2	/	/6 -->
H	T1(100)	T1(100)	/	/

表5560nm测定后的结果

	1	2	3	4
					A	0.057	0.060	0.146	0.148
B	0.132	0.129	0.144	0.147
					C	0.196	0.189	0.148	0.146
D	0.257	0.249	0.150	0.153
					E	0.317	0.302	0.147	0.149
F	0.060	0.062	/	/
					G	0.058	0.060	/	/
H	0.150	0.152	/	/

RSD值的计算结果如表6所示。

表6RSD值的计算结果

根据本发明精密度试验的检测结果，可以看出在检测限浓度100μg/g时，变异系数为2.9％，表明该方法的重复性良好。

3、本发明检测方法和卫生部指定方法进行试验比较

用本发明检测方法和卫生部制定方法(《乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定方法》)同时检测11批生鲜乳样品，并同时做100μg/g的加标样品，分别测定吸光值。检测结果如下表7：

表7本发明检测方法和卫生部指定方法试验结果比较

从以上结果可以看出，两种方法的标准曲线都有很好的相关性。11批生鲜乳样品的吸光值均低于加标样品100μg/g样品的吸光值，依据卫生部指定方法的检测限100μg/g，用两种方法都可以明确判断11批样品均未检出皮革水解蛋白。本发明快速方法的吸光值低于卫生部指定方法的吸光值，是因为本发明快速方法省去调节样品PH值、多次稀释和定容等步骤，但不影响样品判定结果。本方法与卫生部指定方法相比所用时间要缩短三分之二以上，而所用试剂量几乎是它的百分之三。故本发明方法检测快速、成本低、环境污染少。而且本方法与其他商业酶标试剂盒相比，所用试剂都可在一般实验室自行配制，成本要低很多。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (3)

1.一种生鲜乳中皮革水解蛋白L-羟脯氨酸的酶标快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、试剂准备：包括氯胺T溶液配制、显色剂配制、L-羟脯氨酸标准储备液配制、L-羟脯氨酸标准工作液配制；

步骤2、样品和标准品的制备：

a、样品制备：准确称取生鲜乳2g，精确到0.0001g，置于水解管中，加浓盐酸2.00mL，加入2滴50g/L苯酚溶液，氮吹3min，在充氮气的状态下封口，将已封口的水解管放入110℃的恒温干燥箱内，水解12h，取出，打开水解管，将水解液经滤纸过滤到250mL容量瓶中，用水反复冲洗水解管和滤纸，洗液并入滤液中，定容，摇匀，作为样品待测；

b、标准品制备：准确称取浓度为20.0μg/mL的L-羟脯氨酸标准工作液0.00mL、2.50mL、5.00mL、7.50mL、10.00mL分别于100mL容量瓶中，用水定容，摇匀，得到浓度分别为0μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL的溶液，作为标准品；

步骤3、酶标检测：

步骤3.1、准备足够用的空白酶标板；

步骤3.2、用移液枪吸取标准品和样品150μL，分别加入到指定的微孔中，然后加入60μL现配的氯胺T溶液到每一个微孔中，用封口膜把酶标板盖住，室温放置20分钟；

步骤3.3、用8通道移液枪移取60μL显色剂到每一孔里，用封口膜将酶标板封好，放到60℃干燥箱中20分钟；

步骤3.4、取出酶标板，室温放置数分钟，待其到室温后，用560nm的酶标仪测定吸光度值；

步骤4、标准曲线建立和结果计算；

以对标准品所测吸光值为纵坐标，以相应的L-羟脯氨酸的浓度作为横坐标，绘制标准曲线，然后根据样品测定的吸光值，从标准曲线中读出样品中L-羟脯氨酸的的浓度c，利用如下公式计算出生鲜乳中L-羟脯氨酸的含量：

$X=\frac{c\×v}{m}$

式中：X-生鲜乳中L-羟脯氨酸的含量，以％表示；

c-从标准曲线上查得相应的L-羟脯氨酸的浓度，单位为μg/mL；

v-样品溶液的体积，mL；

m-样品中生鲜乳的质量，单位为g。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中，氯胺T溶液配制方式具体为：将1.41g氯胺T溶于10mL水中，然后依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲液；

显色剂配制方式具体为：称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35mL的纯高氯酸溶解，再缓慢加入65mL异丙醇；

L-羟脯氨酸标准储备液配制方式具体为：称取100.00mg的L-羟脯氨酸用少量水溶解，加一滴6mol/L的盐酸，用水定容至100mL容量瓶中，得到1.0mg/mL的L-羟脯氨酸标准储备液；

L-羟脯氨酸标准工作液配制方式具体为：吸取标准储备液2.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，得到20.0μg/mL的L-羟脯氨酸标准工作液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标准曲线为y＝0.1248x+0.0644。