CN104360002B - 一种牛皮明胶的定量检测方法 - Google Patents

一种牛皮明胶的定量检测方法 Download PDF

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一种牛皮明胶的定量检测方法，它是联合胞内蛋白酶Lys‑C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，采用HPLC‑LTQ Orbitrap MS鉴定牛皮明胶的特征性质谱峰，通过胰蛋白酶催化H2 18O对牛皮明胶酶解多肽进行标记，借助HPLC‑LTQ Orbitrap MS检测18O标记前后的特征峰峰面积，准确计算牛皮明胶添加量。本发明的有益效果：1、联合胞内蛋白酶Lys‑C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，可有效增强酶解效果，提高牛皮明胶特征峰的检出率；2、LTQ Orbitrap MS具有非常高的分辨率，可保证定量检测的误差低于10%；3、利用胰蛋白酶催化18O标记和HPLC‑LTQ Orbitrap MS检测，能准确定量检测食品中的牛皮明胶添加量，可为相关部门监控食品提供依据。

Description

一种牛皮明胶的定量检测方法
技术领域
本发明涉及一种定量检测牛皮明胶的方法。
背景技术
明胶具有凝胶性、乳化性、起泡性、成膜性等多种功能特性，被广泛应用于食品、医药、照相等领域。目前，商业上大约95%的明胶来源于哺乳动物，如猪皮、牛皮。然而，疯牛病的传播使得消费者对购买牛皮明胶的相关商品产生了一定顾虑，而且印度教徒不食用与牛相关的食物，因此，需要寻找一种能够定量检测牛皮明胶的方法。
本发明联合胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，采用高效液相色谱-LTQ Orbitrap质谱 （HPLC-LTQ Orbitrap MS）鉴定牛皮明胶的特征性质谱峰，通过胰蛋白酶催化H2 18O对牛皮明胶酶解多肽进行标记，借助HPLC-LTQ Orbitrap MS得到的特征峰峰面积，准确计算牛皮明胶添加量。本发明采用HPLC-LTQ Orbitrap MS和胰蛋白酶催化的18O标记对牛皮明胶进行定量检测，国内外未有文献进行相关报道。
发明内容
本发明旨在提供一种牛皮明胶的定量检测方法，以牛皮明胶为对象，采用胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶酶解、胰蛋白酶催化18O标记、HPLC-LTQ Orbitrap MS检测，有效确定食品中牛皮明胶的添加量。
其具体工艺方案如下：
1、牛皮明胶酶解
（1）加入碳酸氢氨溶液配制牛皮明胶溶液：用10-100 mM的碳酸氢氨溶液溶解得到0.1-10 mg/ml的牛皮明胶溶液；
（2）加入胞内蛋白酶 Lys-C，使牛皮明胶酶解：胞内蛋白酶和牛皮明胶质量比mg/mg 为1:200-1:10，酶解温度为20-50 ℃，反应时间为1-24 h；
（3）加入胰蛋白酶使牛皮明胶酶解：胰蛋白酶和牛皮明胶质量比mg/mg 为1:200-1:10，酶解温度为15-50 ℃，反应时间为4-30 h。
2、同位素标记
（1）加酶：将胰蛋白酶加入经胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶酶解的牛皮明胶水解物中，胰蛋白酶和牛皮明胶质量比mg/mg 为1:100-1:1；
（2）冻干：冻干温度为-30至-80℃，冻干时间为2-24h;
（3）进一步去除水分：加入20-200μl色谱乙腈，常温下真空干燥10-60min去除残余的水分和乙腈；
（4）标记：一份牛皮明胶酶解物中加入H2 16O，另一份牛皮明胶酶解物中加入H2 18O，进行标记，H2 16O或H2 18O与牛皮明胶酶解物的质量比mg/mg为10:1-100:1，标记所需温度为10-60℃,时间为3-48h。
3、HPLC-LTQ Orbitrap MS检测
（1）将标记物和未标记物混合：以H2 18O标记的牛皮明胶水解物为内标，与H2 16O标记的牛皮明胶水解物按照1:50-50:1混合；
（2）上样检测：将混合样品注射进入HPLC-LTQ Orbitrap MS设备，检测牛皮明胶酶解物中H2 16O标记的特征峰和H2 18O标记的特征峰，上样量为0.5-20μg。
4、数据分析
（1）根据氨基酸序列，寻找牛皮明胶的特征峰；
（2）分析并记录特征峰在标记前后的峰面积；
（3）定量方法的准确性分析，即通过比较标记物/未标记物即18O/16O的计算值与实际混合比例检验定量方法的准确性，18O/16O按照如下公式计算：
其中，I0, I2 和 I4分别代表未标记（即16O）的特征肽在实验中测得的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积；M0, M2 和 M4分别代表未标记（即16O）的特征肽在理论上的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积。
所述检测方法中，未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为591.79742+-591.83742+，相应的氨基酸序列为EGPVGL*PGIDGR（*表示P被羟基化），经18O标记后，特征峰的质荷比变成593.79742+-593.83742+ ，氨基酸序列EGPVGL*PGIDGR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
或者，未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为634.32972+-634.36972+，相应的氨基酸序列为GI*PGPVGAAGATGAR（*表示P被羟基化），经18O标记后，特征峰的质荷比变成636.32972+-636.36972+，氨基酸序列GI*PGPVGAAGATGAR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
或者，未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为714.35762+-714.39762+，相应的氨基酸序列为GI*PGEFGL*PGPAGAR（*表示P被羟基化），经18O标记后，特征峰的质荷比变成716.35762+-716.39762+ ，氨基酸序列GI*PGEFGL*PGPAGAR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
或者，未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为780.90102+-780.94102+，相应的氨基酸序列为GETGPAGPAGPIGPVGAR，经18O标记后，特征峰的质荷比变成782.90102+-782.94102+ ，氨基酸序列GETGPAGPAGPIGPVGAR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
或者，未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为790.87712+-790.91712+，相应的氨基酸序列为GP*PGESGAAGPTGPIGSR（*表示P被羟基化），经18O标记后，特征峰的质荷比变成792.87712+-792.91712+ ，氨基酸序列GP*PGESGAAGPTGPIGSR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
或者，未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为923.44312+-923.48312+，相应的氨基酸序列为TG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK（*表示P被羟基化），经18O标记后，特征峰的质荷比变成925.44312+-925.48312+ ，氨基酸序列TG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK中K的羧基末端两个16O原子被18O代替。
本产品的特征：联合胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，采用HPLC-LTQ Orbitrap MS（高效液相色谱-LTQ Orbitrap质谱）鉴定牛皮明胶的特征性质谱峰，通过胰蛋白酶催化H2 18O对牛皮明胶酶解多肽进行标记，借助HPLC-LTQ Orbitrap MS检测18O标记前后的特征峰峰面积，准确计算食品中的牛皮明胶添加量。
本发明的有益效果：1、联合胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，可有效增强酶解效果，提高牛皮明胶特征峰的检出率；2、LTQ Orbitrap MS具有非常高的分辨率，可保证定量检测的误差低于10%；3、利用胰蛋白酶催化18O标记和HPLC-LTQ Orbitrap MS检测，能准确定量检测食品中的牛皮明胶添加量，可为相关部门监控食品提供依据。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实施例一
1、牛皮明胶酶解：（1）牛皮明胶溶液的配制： 用10 mM的碳酸氢氨溶液溶解得到1 mg/ml的牛皮明胶溶液；（2）胞内蛋白酶 Lys-C酶解：按照酶和牛皮明胶质量比1:100（mg/mg）加入胞内蛋白酶 Lys-C，酶解温度为37 ℃，反应时间为4 h；（3）胰蛋白酶酶解：按照酶和牛皮明胶质量比1:50（mg/mg）加入胰蛋白酶，酶解温度为37 ℃，反应时间为12 h。
2、同位素标记：（1）加酶：按照酶和牛皮明胶质量比1:50（mg/mg）将胰蛋白酶加入经胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶酶解的牛皮明胶水解物中；（2）冻干：冻干温度为-60℃，冻干时间为6h;(3)进一步去除水分：加入100μl乙腈，常温下真空干燥30min去除残余的水分和色谱乙腈；（4）标记：一份牛皮明胶酶解物中加入H2 16O，另一份牛皮明胶酶解物中加入H2 18O，H2 16O或H2 18O与牛皮明胶酶解物的质量比为10:1（mg/mg），标记反应的温度为30℃，时间为12h。
3、HPLC-LTQ Orbitrap MS检测：（1）标记物和未标记物的混合：以H2 18O标记的牛皮明胶水解物为内标，与H2 16O标记的牛皮明胶水解物按照1: 1混合；（2）上样：将混合样品注射进入HPLC-LTQ Orbitrap MS设备，上样量为3 μg；（3）检测：检测牛皮明胶酶解物中H2 16O标记的特征峰和H2 18O标记的特征峰。
4、数据分析：（1）寻找特征峰：找到牛皮明胶的特征峰596.85222+，相应的氨基酸序列为IGQPGAVGPAGIR；（2）分析特征峰标记前后峰面积比例：计算得到的未标记物/标记物为0.98，误差范围小于10%。
实施例二
1、牛皮明胶酶解：（1）牛皮明胶溶液的配制：用10 mM的碳酸氢氨溶液溶解得到1 mg/ml的牛皮明胶溶液；（2）胞内蛋白酶 Lys-C酶解：按照酶和牛皮明胶质量比1:100（mg/mg）加入胞内蛋白酶 Lys-C，酶解温度为37 ℃，反应时间为4 h；（3）胰蛋白酶酶解：按照酶和牛皮明胶质量比1:50（mg/mg）加入胰蛋白酶，酶解温度为37 ℃，反应时间为12 h。
2、同位素标记：（1）加酶：按照酶和牛皮明胶质量比1:20（mg/mg）将胰蛋白酶加入经胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶酶解的牛皮明胶水解物中；（2）冻干：冻干温度为-60℃，冻干时间为6h; (3)进一步去除水分：加入100μl色谱乙腈，常温下真空干燥30min去除残余的水分和乙腈；（4）标记：一份牛皮明胶酶解物中加入H2 16O，另一份牛皮明胶酶解物中加入H2 18O，H2 16O或H2 18O与牛皮明胶酶解物的质量比为20:1（mg/mg），标记反应的温度为37℃，时间为24h。
3、HPLC-LTQ Orbitrap MS检测：（1）标记物和未标记物的混合：以H2 18O标记的牛皮明胶水解物为内标，与H2 16O标记的牛皮明胶水解物按照1: 1（mg/mg）混合；（2）上样：将混合样品注射进入HPLC-LTQ Orbitrap MS设备，上样量为5 μg；（3）检测：检测牛皮明胶酶解物中H2 16O标记的特征峰和H2 18O标记的特征峰。
4、数据分析：（1）寻找特征峰：找到牛皮明胶的特征峰596.85222+，相应的氨基酸序列为IGQPGAVGPAGIR；（2）分析特征峰标记前后峰面积比例：计算得到的未标记物/标记物为1.01，误差范围小于10%。

Claims (9)

1.一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征是：
A、牛皮明胶酶解
（1）加入碳酸氢铵溶液配制牛皮明胶溶液；
（2）加入胞内蛋白酶 Lys-C，使牛皮明胶酶解；
（3）再加入胰蛋白酶使牛皮明胶酶解；
B、同位素标记
（1）加酶：将胰蛋白酶加入经胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶酶解的牛皮明胶水解物中；
（2）冻干;
（3）进一步去除水分；
（4）标记：一份牛皮明胶酶解物中加入H2 16O，另一份牛皮明胶酶解物中加入H2 18O，进行标记；
C、HPLC-LTQ Orbitrap MS检测
（1）将标记物和未标记物混合；
（2）上样检测：将混合样品注射进入HPLC-LTQ Orbitrap MS设备，检测牛皮明胶酶解物中H2 16O标记的特征峰和H2 18O标记的特征峰，上样量为0.5-20μg；
D、数据分析
（1）根据氨基酸序列，寻找牛皮明胶的特征峰；
（2）分析并记录特征峰在标记前后的峰面积；
（3）定量方法的准确性分析，即通过比较标记物/未标记物即18O/16O的计算值与实际混合比例检验定量方法的准确性，18O/16O按照如下公式计算：
其中，I0, I2 和 I4分别代表未标记即16O的特征肽在实验中测得的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积；M0, M2 和 M4分别代表未标记即16O的特征肽在理论上的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积。
2.根据权利要求1所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征是：
所述牛皮明胶溶液的配比中加入10 mM的碳酸氢铵溶液溶解得到1 mg/ml的牛皮明胶溶液；
所述加入胞内蛋白酶酶解时，胞内蛋白酶与牛皮明胶质量比mg/mg 为1:100，酶解温度为37 ℃，反应时间为4 h；
所述再加入胰蛋白酶酶解时，胰蛋白酶和牛皮明胶质量比mg/mg 为1:50，酶解温度为37 ℃，反应时间为12 h。
3.根据权利要求1所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征是：
所述同位素标记中胰蛋白酶和牛皮明胶质量比为1:100-1:1；
所述冻干温度为-30至-80℃，冻干时间为2-24h;
所述进一步去除水分的条件是：加入20-200μl色谱乙腈，常温下真空干燥10-60min；
所述标记中H2 16O或H2 18O与牛皮明胶酶解物的质量比为10:1-100:1，标记所需温度为10-60℃,时间为3-48h。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征在于：未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为591.79742+-591.83742+，相应的氨基酸序列为EGPVGL*PGIDGR，其中*表示P被羟基化，经18O标记后，特征峰的质荷比变成593.79742+-593.83742+ ，氨基酸序列EGPVGL*PGIDGR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
5.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征在于：未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为634.32972+-634.36972+，相应的氨基酸序列为GI*PGPVGAAGATGAR，其中*表示P被羟基化，经18O标记后，特征峰的质荷比变成636.32972+-636.36972+，氨基酸序列GI*PGPVGAAGATGAR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
6.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征在于：未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为714.35762+-714.39762+，相应的氨基酸序列为GI*PGEFGL*PGPAGAR，其中*表示P被羟基化，经18O标记后，特征峰的质荷比变成716.35762+-716.39762+ ，氨基酸序列GI*PGEFGL*PGPAGAR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
7.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征在于：未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为780.90102+-780.94102+，相应的氨基酸序列为GETGPAGPAGPIGPVGAR，经18O标记后，特征峰的质荷比变成782.90102+-782.94102+ ，氨基酸序列GETGPAGPAGPIGPVGAR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
8.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征在于：未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为790.87712+-790.91712+，相应的氨基酸序列为GP*PGESGAAGPTGPIGSR，其中*表示P被羟基化，经18O标记后，特征峰的质荷比变成792.87712+-792.91712+ ，氨基酸序列GP*PGESGAAGPTGPIGSR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
9.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征在于：未标记时，胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为923.44312+-923.48312+，相应的氨基酸序列为TG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK，其中*表示P被羟基化，经18O标记后，特征峰的质荷比变成925.44312+-925.48312+ ，氨基酸序列TG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK中K的羧基末端两个16O原子被18O代替。
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