CN105301125B - 重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点的鉴定方法。本发明根据重组人胰岛素及其类似物的氨基酸序列结构，采用酶切还原法将待测重组人胰岛素及类似物样品降解为小肽段，再结合LC‑MS/MS液质联用技术鉴定重组人胰岛素或其类似物的脱氨基肽段并对脱氨基位点进行精确定位。本发明鉴定方法灵敏度高、重复性好、快速简便，可准确鉴定待测重组人胰岛素或其类似物样品中主要脱氨产物的位点，为重组人胰岛素或其类似物有关物质的定性提供了一种快速、简便的鉴定方法。

Description

重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点的鉴定方法

技术领域

本发明涉及胰岛素或其类似物的有关物质的检测方法，尤其涉及重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点的鉴定方法，属于胰岛素类产品脱氨产物的定性与定量分析领域。

背景技术

糖尿病是已成为严重危害人类健康和生命的一大疾病。随着人们生活方式的改变和老龄化进程的加快，糖尿病的患病率逐年上升，尤其是各种急慢性并发症的发生，给患者个人、家庭及社会带来沉重负担。糖尿病治疗最重要的目的是控制血糖水平，1型糖尿病患者及部分2型糖尿病患者需要使用胰岛素来降低血糖。近年来随着重组DNA技术的出现，人们开发出了具有不同作用时间的重组人胰岛素及其类似物，并实现了产业化，给糖尿病患者带来了福音，极大减轻了糖尿病患者的痛苦。

重组人胰岛素是一种利用重组DNA技术，经重组大肠杆菌或者重组酵母菌发酵和纯化制备得到的蛋白质，广泛用于2型和1型糖尿病的临床治疗。重组人胰岛素由A和B两条链组成，A链含有21个氨基酸，B链含有30个氨基酸。两条链之间由两对二硫键相连(A7-B7和A20-B19)，在A链内部还有一对二硫键(A6-A11)，其一级结构见图1。

二硫键的存在对稳定胰岛素结构及生理活性具有重要作用。随着人们对胰岛素结构与功能的深入研究以及基因工程技术和蛋白质工程的应用，通过改变或者修饰重组人胰岛素的部分氨基酸序列，可以赋予胰岛素新的聚合特性，使其具备速效或长效胰岛素的生理特征，以满足人们不同类型的胰岛素需求。

目前市面上的速效重组人胰岛素类似物有赖脯胰岛素、赖谷胰岛素和门 冬胰岛素。赖脯胰岛素是由人胰岛素B链第28位脯氨酸与B链第29位赖氨酸相互交换而形成的一种速效胰岛素类似物，能显著改善2型糖尿病患者的胰岛β和α细胞功能，促进胰岛素分泌；赖谷胰岛素是赖氨酸替代人胰岛素B链第3位天冬酰胺，谷氨酸替代B链第29位赖氨酸而形成的新型速效人胰岛素类似物，局部吸收更快。门冬胰岛素是人胰岛素B链28位脯氨酸被天门冬氨酸所取代而得到的胰岛素类似物，其吸收速率更快，有利于稳定餐后血糖。

长效重组人胰岛素类似物有甘精胰岛素和地特胰岛素。甘精胰岛素在人胰岛素B链C末端增加了2个精氨酸残基，A链C末端的最后一个天冬氨酸被甘氨酸取代，使其六聚体结构更稳定，通过在注射部位缓慢降解成单体吸收，从而具备了长效胰岛素的特性；地特胰岛素是由原型胰岛素去除了B链第30位苏基酸，通过酰化作用在B29位赖氨酸侧链氨基连接了一个十四烷基脂肪酸侧链而成，其被人体吸收缓慢，作用持续时间延长，其结构式见图2。这些速效和长效重组人胰岛素类似物在结构上与重组人胰岛素差异较小，但具有较好的降血糖效果，因此受到广大糖尿病患者的青睐。

组成蛋白质或多肽的氨基酸中若含有天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)残基，该蛋白质的这两种氨基酸的侧链氨基就有可能发生脱氨基现象，生成对应的天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)残基，最终得到与原蛋白结构类似的副产物，这种脱氨基反应在酸性溶液环境中更为明显。这些副产物的理化性质与原蛋白十分接近，功能与原蛋白相近，但免疫原性可能存在一定的差异，所以脱氨产物一般作为有关物质(杂质)在目的蛋白中的含量有着严格的限制。重组人胰岛素A链含有2个Asn(A18和A21)和2个Gln(A5和A15)，B链中含有1个Asn(B3)和Gln(B4)，而且重组人胰岛素制备工艺中经常使用到酸性溶液，所以最终的重组人胰岛素产品中会含有一定比例的脱氨产物，含量一般不超过1.5％。由于重组人胰岛素类似物氨基酸组成与人胰岛素的氨基酸基本一致，所以胰岛素类似物在生产过程中这两种氨基酸残基也很容易脱掉氨基生成相应的杂质，进而影响胰岛素类似物的纯度和安全性。开发胰岛素类产品脱氨产物的定性与定量分析方法对于保证产品质量至关重要，不但可以更好保证产品的质量安全性，也可以作为生产过程中质量控制和工艺优化的重要依据。特别是对胰岛素类似物而言，目前多国药典中都未收载这类产品，没有对该药品质量控制的质量标准和分析方法。目前有文献报道的鉴定方法是将脱氨产物采用高效液相色谱的方法将其分离、脱盐和浓缩制备，然后再进行液质分析，操作十分复杂，特别是采用高效液相分离目的蛋白和脱氨产物难度较大，很难得到单一产物。因此，建立一种快速简单的鉴定脱氨基产物位点的分析方法对药物研发人员及质控人员来说显得非常重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、准确的鉴定重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点的方法

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点的鉴定方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液用蛋白酶进行酶解再用还原剂还原获得小的肽段；用高效液相色谱法将小的肽段进行分离，得到分离的多个小肽段；将分离的各个小肽段进入质谱仪在电喷雾正离子模式下进行一级全扫，得到未经脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图；

(2)将待检测的重组人胰岛素或其类似物进行脱氨基处理后用蛋白酶进行酶解，再用还原剂还原获得小的肽段；用高效液相色谱法将小的肽段进行分离，得到分离的多个小肽段；将分离的各个小肽段进入质谱仪在电喷雾正离子模式下进行一级全扫，得到脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品 的总离子流图；

(3)将未经脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图和经过脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图进行分析比较，找出出现在经过脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图中但没有出现在未经过脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图的肽段并确定该肽段离子峰的质荷比；

(4)提取该肽段的母离子峰进行MS/MS二级碎片分析，获取二级MS图谱和系列碎片图谱，将该肽段的系列碎片离子与其理论碎片离子进行匹配对比，精确定位该肽段是检测样品中哪个位点的脱氨产物，该位点即为检测样品的主要脱氨产物位点。

所述的脱氨基处理包括将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液用稀酸制成酸性溶液后再进行加热处理；所述稀酸可以为盐酸或醋酸，其浓度优选为0.01-0.05mol/L，更优选为0.02mol/L；所述的加热处理优选采用水浴加热，其中，水浴加热的温度优选为40-60℃，更优选为60℃；所述的加热时间优选为3-6h，更优选为4h。

优选的，将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液用稀酸制成酸性溶液的方法包括：

将重组人胰岛素原料药、赖脯胰岛素原料药、门冬胰岛素原料药、赖谷胰岛素原料药或地特胰岛素原料药直接用稀酸溶液溶解成3-6mg/ml的溶液(优选为5mg/ml)；或者将重组人胰岛素注射液、赖脯胰岛素注射液、门冬胰岛素注射液、赖谷胰岛素注射液或地特胰岛素注射液采用Millipore 3KD的超滤管超滤换相浓缩至稀酸溶液中，使样品的终浓度为3-6mg/ml(优选为5mg/ml)。

步骤(1)或步骤(2)中所述的蛋白酶优选为Glu-C蛋白内切酶；所述蛋白酶与样品的用量之比为1:3～1:8，优选为1:5；所述酶切时间优选为4-8h，更优选为6h；所述酶切反应温度优选为30-40℃，更优选为37℃。

步骤(1)或步骤(2)中进行酶解时所用到的酶解缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液或者HEPES缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为15-30mmol/L，优选为20mmol/L；所述HEPES缓冲液的终浓度为30-70mmol/L，优选为50mmol/L；所述缓冲液的pH值为7.0-8.0，优选为7.5。

步骤(1)或步骤(2)中所述的还原剂优选为二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇；所述还原剂终浓度为5-15mmol/L，优选为10mmol/L；所述还原温度为25-35℃，优选为30℃；所述还原时间为20-40min，优选为30min。

步骤(1)或步骤(2)中在正离子模式下进行电离之前先将样品经受甲酸酸化。

步骤(1)中用高效液相色谱进行分离的参数优选为：流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为100％乙腈溶液，色谱柱为C18反相柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流速为0.3ml/min，柱温为40℃；洗脱梯度：0～25min，2～20％B；25～31min，20～26％B；31～45min，26～100％B；45～50min，100％B。

步骤(1)中用质谱仪进行一级扫描的参数优选是：m/z扫描范围为70-1500，分析时长46min。

步骤(3)所述肽段的分子量是比理论值大约1Da的肽段；优选的，所述的肽段的质荷比(m/z)为514.00 ±0.50。

步骤(4)中进行MS/MS碎片分析的参数优选为：质荷比扫描范围为70-1500，碰撞能量为15-23V(优选为18V)，扫描累积时间为1.0s。

本发明采用上述检测方法检测了重组人胰岛素、地特胰岛素以及门冬胰岛素的主要脱氨产物位点，检测结果发现，上述三种样品的脱氨基处理的总离子流图中均出现质荷比(m/z)为514.00± 0.50的离子峰，三种样品的未经脱氨基处理的总离子流图中均未出现质荷比(m/z)为514.00± 0.50的离子峰；二级碎片质谱分析发现，质荷比(m/z)为514.00±0.50的离子峰是检测样品中A21位点脱氨基的肽段，证明A21位点为重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点。

由此，本发明进一步提供了一种鉴定重组人胰岛素或其类似物中是否存在A21位脱氨基产物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液用Glu-蛋白内切酶进行酶解，再用还原剂还原获得小的肽段；用高效液相色谱法将小的肽段进行分离，得到分离的多个小肽段；将分离的各个小肽段进入质谱仪在电喷雾正离子模式下进行一级全扫，得到总离子流图；

(2)如果在总离子流图中出现质荷比(m/z)为514.00± 0.50的离子峰，说明待检测的样品中存在A21位脱氨基的产物。

本发明所述的重组人胰岛素或其类似物包括：重组人胰岛素原料药或注射液、赖脯胰岛素原料药或注射液、门冬胰岛素原料药或注射液、赖谷胰岛素原料药或注射液、地特胰岛素的原料药或注射液。

所述蛋白酶与样品的用量之比为1:3～1:8，优选为1:5；所述酶切时间优选为4-8h，更优选为6h；所述酶切反应温度优选为30-40℃，更优选为37℃。

步骤(1)中进行酶解时所用到的酶解缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液或者HEPES缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为15-30mmol/L，优选为20mmol/L；所述HEPES缓冲液的终浓度为30-70mmol/L，优选为50mmol/L；所述缓冲液的pH值为7.0-8.0，优选为7.5。

步骤(1)中所述的还原剂优选为二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇；所述还原剂终浓度为5-15mmol/L，优选为10mmol/L；所述还原温度为25-35℃，优选为30℃；所述还原时间为20-40min，优选为30min。

步骤(1)中在正离子模式下进行电离之前先将样品经受甲酸酸化。

步骤(1)中用高效液相色谱进行分离的参数优选为：流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为100％乙腈溶液，色谱柱为C18反相柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流速为0.3ml/min，柱温为40℃；洗脱梯度：0～25min，2～20％B；25～31min，20～26％B；31～45min，26～100％B；45～50min，100％B。

步骤(1)中用质谱仪进行一级扫描的参数优选是：m/z扫描范围为70-1500，分析时长46min。

本发明根据重组人胰岛素及其类似物的氨基酸序列结构，采用酶切还原法将待测重组人胰岛素及类似物样品降解为小肽段，再结合LC-MS/MS液质联用技术鉴定重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点；本发明鉴定方法灵敏度高、重复性好、快速简便，可有效鉴定待测样品中主要脱氨产物，为重组人胰岛素及其类似物有关物质的定性提供了一种快速、简便的鉴定方法。

附图说明

图1重组人胰岛素的一级结构。

图2地特胰岛素的一级结构。

图3为重组人胰岛素加热脱氨处理前后酶切还原总离子流图对比。

图4为地特胰岛素加热脱氨处理前后酶切还原总离子流图对比。

图5为门冬胰岛素加热脱氨处理前后酶切还原总离子流图对比。

图6为选择反应监测(SRM)扫描模式下选择离子对m/z513.00、514.00监测的质谱图。

图7为合成多肽和各加热处理样品离子m/z为514.00的碎片质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1重组人胰岛素主要脱氨产物的鉴定

1试验材料和试剂

试验材料：重组人胰岛素(购自Sigma公司)。

试验试剂：Glu-C蛋白内切酶(序列纯，NEB)、DTT(分析纯，Bio-rad)、甲酸(色谱纯，Sigma)、乙腈(色谱纯，Merk)。

2试验仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1290)、TSQ Quantum Access MAX质谱仪(ThermoScientific)。

3样品的检测前处理

(1)样品溶液的制备

称取0.025g重组人胰岛素于5ml容量瓶中，加0.02mol/L的醋酸溶液使样品完全溶解，并用0.02mol/L的醋酸稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤。

(2)样品加热处理

取过滤后的溶液1ml于Eppendorf管中，置60℃恒温水浴锅中加热4h，使重组人胰岛素在酸性条件下大量脱氨，以便富集脱氨产物。

(3)样品酶解

分别取加热处理和未处理的样品各12.5μl，加入0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.3)10μl，0.1％Glu-C蛋白内切酶12.5μl，再加入65μl超纯水，混匀，置37℃恒温水浴锅中水浴4h。

(4)样品还原

向酶解后的样品中加入0.1mol/L的DTT溶液12μl，使DTT终浓度为10mmol/L，30℃孵育30min，再加入2μl磷酸终止反应，混匀即得还原后的样品。

4脱氨基肽段的发现

(1)液质检测

还原后的样品取5μl进行液质联用检测。液相条件：流动相A为0.1％ 甲酸溶液，流动相B为100％乙腈溶液，色谱柱为C18反相柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流速为0.3ml/min，柱温为40℃；洗脱梯度：0～25min，2～20％B；25～31min，20～26％B；31～45min，26～100％B；45～50min，100％B。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行一级全扫，m/z扫描范围为70-1500，分析时长46min。

(2)目标母离子的发现

质谱全扫图见图3。分析比较加热处理和未加热处理样品的总离子流图，发现加热处理过的样品在4.3min多出一个肽段，该肽段离子峰的m/z为514.10，而肽段III离子峰(理论肽段)的m/z为513.10，二者m/z相差1，由于均带1个正电荷，所以相对分子质量也相差1；其余各肽段相对分子质量均与理论值一致，没有明显变化。由此推断4.3min的肽段很可能是酸性条件加热后肽段III脱氨基的产物，由于肽段III中含有两个Asn，不能确定是哪个天冬酰胺脱氨基，因此需要提取4.3min的母离子峰进行MS/MS碎片分析。酶切还原后各肽段编号与序列见表1。

表1酶切还原后各肽段编号

(3)目标母离子的二级碎片质谱分析

提取m/z为514.10的母离子进行MS/MS碎片分析。质荷比扫描范围为70-1500，碰撞能量为18V，扫描累积时间为1.0s。m/z 514.10离子的二级MS图谱和碎片图谱分别见图6和图7。分析N-端b系列碎片峰与C-端y系列碎片峰，可以检测到与理论相对分子量一致的连续b系列碎片峰(除去b1碎片峰，未监测到)，同时可以检测到比理论相对分子质量增加约1的y系列碎片峰，据此可以证明m/z为514.10的离子为A21位脱氨基的肽段。数据统计见表2。

表2二级碎片质谱分析

实施例2地特胰岛素主要脱氨产物的鉴定

1试验材料和试剂

试验材料：地特胰岛素原料药(山东东阿阿胶股份有限公司生产并对外出售)。

试验试剂：Glu-C蛋白内切酶(序列纯，NEB)、β-巯基乙醇(分析纯，Sigma)、甲酸(色谱纯，Sigma)、乙腈(色谱纯，Merk)

2试验仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1290)、TSQ Quantum Access MAX质谱仪(ThermoScientific)

3样品的检测前处理

(1)样品溶液的制备

称取0.025g地特胰岛素原料药于5ml容量瓶中，加0.02mol/L的稀盐酸溶液使样品完全溶解，并用0.02mol/L的稀盐酸稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤。

(2)样品加热处理

取过滤后的溶液1m1于Eppendorf管中，置60℃恒温水浴锅中加热5h， 使地特胰岛素在酸性条件下脱氨，以便富集脱氨产物。

(3)样品酶解

分别取加热处理和未处理的样品各12.5μl，加入0.1mol/L HEPES缓冲液(pH 7.5)50μl，0.1％Glu-C蛋白内切酶12.5μl，再加入25μl超纯水，混匀，置37℃恒温水浴锅中水浴6h。

(4)样品还原

向酶解后的样品中加入0.1mol/L的β-巯基乙醇溶液12μl，使β-巯基乙醇终浓度为10mmol/L，30℃孵育30min，再加入2μl磷酸终止反应，混匀即得还原后的样品。

4脱氨基肽段的发现

(1)液质检测

还原后的样品取5μl进行液质联用检测。液相条件：流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为100％乙腈溶液，色谱柱为C18反相柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流速为0.3ml/min，柱温为40℃；洗脱梯度：0～25min，2～20％B；25～31min，20～26％B；31～45min，26～100％B；45～50min，100％B。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行一级全扫，扫描范围m/z 70-1500，分析时长46min。

(2)目标母离子的发现

质谱全扫图见图4。分析比较加热处理和未加热处理样品的总离子流图，发现加热处理过的样品在4.3min多出一个肽段，该肽段离子峰的m/z为514.08，而肽段III离子峰(理论肽段)的m/z为513.08，二者m/z相差1，由于均带1个正电荷，所以相对分子质量也相差1；其余各肽段相对分子质量均与理论值一致，没有明显变化。由此推断4.3min的肽段很可能是酸性条件加热后肽段III脱氨基的产物，由于肽段III中含有两个Asn，不能确定是哪个天冬酰胺脱氨基，因此需要提取4.3min的母离子峰进行MS/MS碎片分析。酶切还原后各肽段编号与序列见表3。

表3酶切还原后各肽段编号

(3)目标母离子的二级碎片质谱分析

提取m/z为514.08的母离子进行MS/MS碎片分析。质荷比扫描范围为70-1500，碰撞能量为18V，扫描累积时间为1.0s。m/z 514.08离子的二级MS图谱和碎片图谱分别见图6和图7。分析N-端b系列碎片峰与C-端y系列碎片峰，可以检测到与理论相对分子量一致的连续b系列碎片峰(除去b1碎片峰，未监测到)，同时可以检测到比理论相对分子质量增加约1的y系列碎片峰，据此可以证明m/z为514.08的离子为A21位脱氨基的肽段。数据统计见表4。

表4二级碎片质谱分析

实施例3门冬胰岛素主要脱氨产物的鉴定

1试验材料和试剂

试验材料：门冬胰岛素注射液(购自诺和诺德)；

试验试剂：Glu-C蛋白内切酶(序列纯，NEB)、DTT(分析纯，Bio-rad)、甲酸(色谱纯，Sigma)、乙腈(色谱纯，Merk)；

2试验仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1290)、TSQ Quantum Access MAX质谱仪(ThermoScientific)

3样品的检测前处理

(1)样品溶液的制备

取门冬胰岛素注射液1ml加入到15ml Millipore 3KD的超滤离心管中，再加入9ml0.01mol/L的稀盐酸进行超滤换相，4℃，5000g，离心1h，反复超滤4次，最终浓缩至体积为500μl，并用0.01mol/L的稀盐酸调整样品终浓度约5mg/ml。

(2)样品加热处理

取过滤后的溶液1m1于Eppendorf管中，置60℃恒温水浴锅中加热5h，使门冬胰岛素在酸性条件下脱氨，以便富集脱氨产物。

(3)样品酶解

分别取加热处理和未处理的样品各12.5μl，加入0.1mol/L HEPES缓冲液50μl，0.1％Glu-C蛋白内切酶12.5μl，再加入25μl超纯水，混匀，置37℃恒温水浴锅中水浴6h。

(4)样品还原

向酶解后的样品中加入0.1mol/L的DTT溶液12μl，使DTT终浓度为10mmol/L，30℃孵育30min，再加入2μl磷酸终止反应，混匀即得还原后的样品。

4脱氨基肽段的发现

(1)液质检测

还原后的样品取5μl进行液质联用检测。液相条件：流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为100％乙腈溶液，色谱柱为C18反相柱(2.1mm×100 mm，1.7μm)，流速为0.3ml/min，柱温为40℃；洗脱梯度：0～25min，2～20％B；25～31min，20～26％B；31～45min，26～100％B；45～50min，100％B。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行一级全扫，扫描范围m/z70-1500，分析时长46min。

(2)目标母离子的发现

质谱全扫图见图5。分析比较加热处理和未加热处理样品的总离子流图，发现加热处理过的样品在4.3min多出一个肽段，该肽段离子峰的m/z为514.09，而肽段III离子峰(理论肽段)的m/z为513.08，二者m/z相差1，由于均带1个正电荷，所以相对分子质量也相差1；其余各肽段相对分子质量均与理论值一致，没有明显变化。由此推断4.3min的肽段很可能是酸性条件加热后肽段III脱氨基的产物，由于肽段III中含有两个Asn，不能确定是哪个天冬酰胺脱氨基，因此需要提取4.3min的母离子峰进行MS/MS碎片分析。酶切还原后各肽段编号与序列见表5。

表5酶切还原后各肽段编号

(3)目标母离子的二级碎片质谱分析

提取m/z为514.09的母离子进行MS/MS碎片分析。质荷比扫描范围为70-1500m/z，碰撞能量为18V，扫描累积时间为1.0s。m/z 514.09离子的二级MS图谱和碎片图谱分别见图6和图7。分析N-端b系列碎片峰与C-端y系列碎片峰，可以检测到与理论相对分子量一致的连续b系列碎片峰(除去b1碎片峰，未监测到)，同时可以检测到比理论相对分子质量增加约1的y系列碎片峰，据此可以证明m/z为514.09的离子为A21位脱氨基的肽段。数据统计见表6。

表4二级碎片质谱分析

实施例4利用合成多肽验证主要脱氨产物

1试验材料和试剂

试验材料：合成多肽1(序列：Asn-Tyr-Cys-Asn)和合成多肽2(序列：Asn-Tyr-Cys-Asp)，委托上海吉尔生化有限公司合成。

试验试剂：甲酸(色谱纯，Sigma)、乙腈(色谱纯，Merk)

2试验仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1290)、TSQ Quantum Access MAX质谱仪(ThermoScientific)

3样品检测前处理

称取2.0mg合成多肽于20ml容量瓶中，加0.02mol/L的稀盐酸溶液使样品完全溶解，并用0.02mol/L的稀盐酸稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤。

4样品二级质谱扫描

取1μl样品进行子离子全扫及碎片分析。液相条件：流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为100％乙腈溶液，色谱柱为C18反相柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流速为0.3ml/min，柱温为40℃；洗脱梯度：0～25min，2～20％B；25～31min，20～26％B；31～45min，26～100％B；45～50min，100％B。质谱条件：质荷比扫描范围为70-1500m/z，碰撞能量为18V，扫描累积时间为1.0s。结果见图6和图7。

同时提取各样品母离子m/z为513.00和m/z为514.00的离子进行MS扫描，发现未经过加热处理的各样品能监测到与合成多肽1相同的离子峰(m/z 513.00)，经过加热处理的各样品检测到两个离子峰(m/z 513.00和m/z514.00)，分别与合成多肽1和合成多肽2吻合，从而证明了经过加热处理的样品确实增加了一个与合成多肽2吻合的肽段。并且对比合成多肽2与各加热处理样品的m/z 514.00离子峰的碎片，发现碎片片段一致，更进一步证实了质荷比为m/z 514.00的离子峰确实为A21脱氨基的肽段。

Claims (17)

1.一种重组人胰岛素或其类似物的主要脱氨产物位点的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液用蛋白酶进行酶解后再用还原剂还原获得小的肽段；用高效液相色谱法将小的肽段进行分离，得到分离的多个小肽段；将分离的小肽段进入质谱仪在电喷雾正离子模式下进行一级全扫，得到未经脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图；

（2）将待检测的重组人胰岛素或其类似物进行脱氨基处理后用蛋白酶进行酶解，再用还原剂还原获得小的肽段；用高效液相色谱法将小的肽段进行分离，得到分离的多个小肽段；将分离的各个小肽段进入质谱仪在电喷雾正离子模式下进行一级全扫，得到脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图；

（3）将未经脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图和经过脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图进行分析比较，找出出现在经过脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图中但没有出现在未经过脱氨基处理的重组人胰岛素或其类似物样品的总离子流图的肽段并确定该肽段离子峰的质荷比；

（4）提取该肽段的母离子峰进行MS/MS二级碎片分析，获取二级MS图谱和系列碎片图谱，将该肽段的系列碎片离子与其理论碎片离子进行匹配对比，精确定位该肽段是检测样品中哪个位点的脱氨产物，该位点即为检测样品的主要脱氨产物位点；

步骤（1）中用高效液相色谱进行分离的参数为：流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为100%乙腈溶液，色谱柱为C18反相柱，流速为0.3 ml/min，柱温为40℃；洗脱梯度：0~25 min，2~20% B；25~31 min，20~26% B；31~45 min，26~100% B；45~50 min，100% B；

步骤（1）中用质谱仪进行一级扫描的参数是：m/z扫描范围为70-1500，分析时长46min；

所述的重组人胰岛素或其类似物选自（1）-（5）中的任何一种：（1）重组人胰岛素原料药或重组人胰岛素注射液、（2）赖脯胰岛素原料药或赖脯胰岛素注射液、（3）门冬胰岛素原料药或门冬胰岛素注射液、（4）赖谷胰岛素原料药或赖谷胰岛素注射液、（5）地特胰岛素原料药或地特胰岛素注射液。

2.按照权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：

所述的脱氨基处理包括：将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液进行加热处理；

所述的加热处理采用水浴加热，其中，水浴加热的温度为40-60℃；所述的加热时间为3-6 h。

3.按照权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于：水浴加热的温度为60℃；所述的加热时间为4 h。

4.按照权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤（1）或步骤（2）中所述的蛋白酶为Glu-C蛋白内切酶；所述蛋白酶与样品的用量之比为1:3~1:8；所述酶解时间为4-8 h；所述酶解反应温度为30-40℃；

步骤（1）或步骤（2）中进行酶解时所用到的酶解缓冲液为Tris-HCl缓冲液或者HEPES缓冲液；

步骤（1）或步骤（2）中所述的还原剂为二硫苏糖醇或β-巯基乙醇。

5.按照权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于：所述蛋白酶与样品的用量之比为1:5；所述酶解时间为6 h；所述酶解反应温度为37℃。

6.按照权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为15-30mmol/L；所述HEPES缓冲液的终浓度为30-70mmol/L。

7.按照权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为20mmol/L；所述HEPES缓冲液的终浓度为50mmol/L。

8.按照权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤（1）或步骤（2）中在正离子模式下进行电离之前先将样品经受甲酸酸化。

9.按照权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤（3）所述肽段的分子量是比理论值大约1Da的肽段；所述的肽段的质荷比为514.00+0.50。

10.按照权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤（4）中进行 MS/MS碎片分析的参数为：质荷比扫描范围为70-1500，碰撞能量为15-23 V ，扫描累积时间为1.0 s。

11.一种鉴定重组人胰岛素或其类似物中是否存在A21位脱氨基产物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）将待检测的重组人胰岛素或其类似物样品溶液用Glu-蛋白内切酶进行酶解，再用还原剂还原获得小的肽段；用高效液相色谱法将小的肽段进行分离，得到分离的多个小肽段；将分离的各个小肽段进入质谱仪在电喷雾正离子模式下进行一级全扫，得到总离子流图；

（2）如果在总离子流图中出现质荷比为514.00+0.50的离子峰，确定待检测的样品中存在A21位脱氨基的产物；

步骤（1）或步骤（2）中在正离子模式下进行电离之前先将样品经受甲酸酸化；

步骤（1）中用高效液相色谱进行分离的参数为：流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为100%乙腈溶液，色谱柱为C18反相柱，流速为0.3 ml/min，柱温为40℃；洗脱梯度：0~25 min，2~20% B；25~31 min，20~26% B；31~45 min，26~100% B；45~50 min，100% B；

步骤（1）中用质谱仪进行一级扫描的参数是：m/z扫描范围为70-1500，分析时长46min；

所述的重组人胰岛素或其类似物选自（1）-（5）中的任何一种：（1）重组人胰岛素原料药或重组人胰岛素注射液、（2）赖脯胰岛素原料药或赖脯胰岛素注射液、（3）门冬胰岛素原料药或门冬胰岛素注射液、（4）赖谷胰岛素原料药或赖谷胰岛素注射液、（5）地特胰岛素原料药或地特胰岛素注射液。

12.按照权利要求11所述的方法，其特征在于：

所述蛋白酶与样品的用量之比为1:3~1:8；所述酶解时间为4-8 h；所述酶解反应温度为30-40℃；

步骤（1）中进行酶解时所用到的酶解缓冲液为Tris-HCl缓冲液或者HEPES缓冲液；

步骤（1）中所述的还原剂为二硫苏糖醇或β-巯基乙醇。

13.按照权利要求12所述的方法，其特征在于：

所述蛋白酶与样品的用量之比为1:5；所述酶解时间为6 h；所述酶解反应温度为37℃。

14.按照权利要求12所述的方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为15-30mmol/L；所述HEPES缓冲液的终浓度为30-70mmol/L。

15.按照权利要求14所述的方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为20mmol/L；所述HEPES缓冲液的终浓度为50mmol/L。

16.按照权利要求12所述的方法，其特征在于：所述还原剂终浓度为5-15mmol/L；所述还原温度为25-35℃；所述还原时间为20-40 min。

17.按照权利要求16所述的方法，其特征在于：所述还原剂终浓度为10mmol/L；所述还原温度为30℃；所述还原时间为30 min。