CN108802232A - 一种基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法 - Google Patents

一种基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一组用于鹅源性成分鉴别的种属特征性多肽，以及一种基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法，该特征性多肽包括7个肽段中的任意一或多条：DMWMPVTSATVK；DVASAQWVPVSSSSK；EHTITPEADLSDIPGGQIAVR；FFEAVYPIEAR；AQVHLPVDALSVQAAK；DMDLIEVNEAFAPQYLAVEK；AVSAGGTSVPATLEQPVLVR，该液相质谱方法先将肉类样品进行裂解、提取，最终获得目标肽段，后基于质谱MRM技术和鹅的特征性肽段，构建目标肽段的检测方法。本发明解决了鹅肉制品掺假的食品安全问题，其操作和检测方法清晰，可通量检测，鉴定结果准确。

Description

一种基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法
技术领域
本发明涉及蛋白质检测方法，尤其是提供了一组用于鹅源性成分鉴别的种属特征性多肽，以及一种基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法。
背景技术
肉类是人类动物蛋白质的主要来源，是人们必需的主要副食品之一。随着人们生活水平的不断提高，肉类食品的消费量日益增长，促进了肉类行业的飞速发展。然而在肉品市场上，有些不法企业会使用相对廉价的肉类原料冒充较贵的肉制品，以此谋取暴利，肉制品掺假已成为全球广泛关注的食品安全问题。
目前，鉴别肉源性成分的方法主要有酶联免疫吸附技术、聚合酶链式反应技术和基于特征性肽段的蛋白质组学技术。酶联免疫吸附技术受制于抗体的制备，假阳性率高；聚合酶链式反应技术易受到DNA降解的影响；基于特征性肽段的蛋白质组学技术日渐成熟，已报道的方法可对鸡源性成分、鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分进行鉴别。但是至今仍无鹅源性成分鉴别的方法，主要原因是蛋白质数据库中缺少鹅的蛋白质信息，这使寻找鹅的特征性肽段变得异常困难，另外，鸡、鸭和鹅的亲缘关系近，很难找到差异性的肽段。
鹅肉含有人体生长发育所必需的各种氨基酸，其组成接近人体所需氨基酸的比例，从生物学价值上来看，鹅肉是全价蛋白质，优质蛋白质。为了保证鹅肉品质，找到鹅的特征性肽段用于鹅源性成分的检测具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题，提供一组用于鹅源性成分鉴别的种属特征性多肽，以及一种基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法，所述方法特征性强，灵敏度高，能准确鉴别肉类产品中是否含有鹅源性成分。
本发明首先提供一组用于鹅源性成分鉴别的种属特征性多肽：鹅的特征性肽段由10-22个氨基酸组成，其序列为以下7条肽段中的任意一条或者多条：
(1)DMWMPVTSATVK；
(2)DVASAQWVPVSSSSK；
(3)EHTITPEADLSDIPGGQIAVR；
(4)FFEAVYPIEAR；
(5)AQVHLPVDALSVQAAK；
(6)DMDLIEVNEAFAPQYLAVEK；
(7)AVSAGGTSVPATLEQPVLVR。
本发明还提供一种基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法，采用如上所述的鹅的特征性肽段进行鉴别，并且7条肽段的母离子分别为m/z 683.3，m/z 774.4，m/z740.4，m/z 671.3，m/z 549.6，m/z 1148.1，m/z 976.5；由于同位素效应的存在，上述母离子均可存在±3Da的差值。
优选的，肉类样品的前处理方法包括以下步骤：
S1，配制含有尿素的蛋白质裂解液，用于肉类样品中蛋白质的提取；
S2，将肉类样品冷冻粉碎或者切成肉沫状，加入S1制备的蛋白质裂解液，震荡提取；随后低温高速离心，取上层清液备用；
S3，向S2的上层清液中加入还原剂以打开二硫键，再加入碘代试剂进行烷基化；将反应液转移至超滤管中，低温高速离心，加入碳酸氢铵水溶液洗涤超滤管，再次低温高速离心，上述洗涤、离心过程重复一次以上；
S4，向超滤管中加入碳酸氢铵水溶液和适量的胰蛋白酶进行水解，37℃恒温反应6小时以上，低温高速离心，加入适量碳酸氢铵水溶液洗涤超滤管；低温高速离心，收集合并滤液，等待上机检测。
优选的，肉类样品的前处理方法具体包括以下步骤：
S1，配制含有尿素的蛋白质裂解液，用于肉类样品中蛋白质的提取；
S2，将肉类样品冷冻粉碎或者切成肉沫状，加入S1制备的蛋白质裂解液，震荡提取12个小时以上；随后低温高速离心10分钟以上，取上层清液备用；
S3，向S2的上层清液中加入二硫苏糖醇溶液以打开二硫键，再加入碘乙酰胺溶液进行烷基化；将反应液转移至超滤管中，低温高速离心30-40分钟，加入碳酸氢铵水溶液洗涤超滤管，再次低温高速离心30-40分钟，上述洗涤、离心过程重复1-3次；
S4，向超滤管中加入碳酸氢铵水溶液和适量的胰蛋白酶进行水解，37℃恒温反应6小时以上，低温高速离心30-40分钟，加入适量碳酸氢铵水溶液洗涤超滤管，低温高速离心30-40分钟，收集合并滤液，等待上机检测。
优选的，其液相分离条件为：以C18色谱柱为分离色谱柱，0.1％甲酸水溶液和乙腈分别作为A、B流动相；
其质谱条件为：正离子扫描模式，MRM监测模式，根据特征性肽段子离子的丰度，选择丰度较高的前10个离子进行检测分析，优选丰度较高的前6个离子。
优选的，所述液相分离条件中，A、B流动相采用梯度洗脱方式。
优选的，其采用的检测仪器为：沃特世(waters)液相色谱串联AB SCIEX三重四极杆质谱。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明首先找到鹅源性成分鉴别的种属特征性多肽；
2.并基于该特征性肽段，利用沃特世液相色谱串联AB SCIEX三重四极杆质谱作为检测仪器，通过以下的流程：A.肉类样品的蛋白质裂解和提取；B.蛋白质的还原和烷基化；C.蛋白质的酶切水解成肽段；D.通过质谱MRM技术，构建目标肽段的检测方法组建成完整的液相质谱方法；
3.在本发明中，优选含有尿素构成的蛋白质裂解液对肉类样品进行蛋白提取，利用二硫苏糖醇还原蛋白质，碘乙酰胺烷基化，采用超滤法去盐，测序级胰蛋白酶进行水解；
4.通过上述技术方案，首次建立了鹅源性成分的检测方法，可以鉴别肉类样品中是否存在鹅源性成分，解决了鹅肉制品掺假的食品安全问题，其操作和检测方法清晰，可通量检测，鉴定结果准确。
附图说明
图1是本发明提供的7条鹅的特征性肽段的离子流色谱图。
图2是本实施例1提供的鹅肉样品(A)的离子流色谱图。
图3是本实施例1提供的鸡鸭混合肉样品(B)的离子流色谱图。
图4是本实施例2提供的猪鹅混合肉样品(C)的离子流色谱图。
图5是本实施例2提供的猪肉样品(D)的离子流色谱图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面结合附图及具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1
配制含有尿素的蛋白质裂解液(下简称：尿酸裂解液)，称取切成肉沫状的鸡肉和鸭肉的混合(50％：50％)样品1.0g，加入尿素裂解液5mL，震荡提取12小时，14000rpm离心30min，温度控制在10℃以下。取上清液20μL，补加尿酸裂解液至100μL，加入二硫苏糖醇溶液4μL，37℃恒温反应1个小时。加入碘乙酰胺溶液20μL，避光反应30min，转移至超滤管中。14000rpm离心30min，温度控制在10℃以下。加入碳酸氢铵水溶液100μL，14000rpm离心30min，重复洗涤1-3次后，加入碳酸氢铵水溶液100μL，胰蛋白酶10μg，37℃恒温反应12个小时。14000rpm离心30min，温度控制在10℃以下，加入碳酸氢铵水溶液100μL，14000rpm离心30min，离心到低吸附EP管中的液体待上机检测，获得鸡鸭混合肉样品(简称：B)；以鹅肉样品(简称：A)作为对照样品，重复上述实验过程。
检测仪器为：沃特世(waters)液相色谱串联AB SCIEX三重四极杆质谱。
其液相分离条件为：以C18色谱柱为分离色谱柱，0.1％甲酸水溶液和乙腈分别作为A、B流动相；
A、B流动相的梯度列表如下：
其质谱条件为：正离子扫描模式，MRM监测模式，根据特征性肽段子离子的丰度，选择丰度较高的前10个离子进行检测分析，优选丰度较高的前6个离子。
选用以下三条肽段作为鹅肉的特征信号，
(1)DMWMPVTSATVK；
(5)AQVHLPVDALSVQAAK；
(6)DMDLIEVNEAFAPQYLAVEK。
结果如图2所示，鹅肉样品(A)中出现了此3条特征性肽段的峰信号，而如图3所示，鸡鸭混合肉样品(B)除了较低的噪音峰外，并未出现鹅特征性肽段的信息峰，说明肉类样品中没有鹅源性成分，测定结果与肉样中仅有鸡肉和鸭肉的事实一致。
实施例2
配制含有尿素的蛋白质裂解液，称取切成肉沫状的猪肉和鹅肉(50％：50％)的混合样品1.0g，加入尿素裂解液5mL，震荡提取20小时，14000rpm离心30min，温度控制在10℃以下。取上清液40μL，补加尿素裂解液至200μL，加入二硫苏糖醇溶液5μL，37℃恒温反应1个小时。加入碘乙酰胺溶液25μL，避光反应30min，转移至超滤管中。14000rpm离心30min，温度控制在10℃以下。加入碳酸氢铵水溶液100μL，14000rpm离心30min，重复洗涤1-3次后，加入碳酸氢铵水溶液100μL，胰蛋白酶20μg，37℃恒温反应16个小时。14000rpm离心30min，温度控制在10℃以下，加入碳酸氢铵水溶液100μL，14000rpm离心30min，离心到低吸附EP管中的液体待上机检测，获得猪鹅混合肉样品(简称：C)；以猪肉样品(简称：D)作为对照样品，重复上述实验过程。
检测仪器为：沃特世(waters)液相色谱串联AB SCIEX三重四极杆质谱。
其液相分离条件为：以C18色谱柱为分离色谱柱，0.1％甲酸水溶液和乙腈分别作为A、B流动相；
A、B流动相的梯度列表如下：
其质谱条件为：正离子扫描模式，MRM监测模式，根据特征性肽段子离子的丰度，选择丰度较高的前10个离子进行检测分析，优选丰度较高的前6个离子。
选用以下三条肽段作为鹅肉的特征信号，
(2)DVASAQWVPVSSSSK；
(4)FFEAVYPIEAR；
(7)AVSAGGTSVPATLEQPVLVR。
结果如图3所示，含有鹅肉(A)的猪肉样品中出现了所选择的鹅特征性肽段的信号峰(4.0min之前)，而猪肉样品中只存在较低的噪音峰(4.0min之前)，4.2min中虽有较低的杂质峰存在，但并不会干扰检测结果。说明肉类样品中含有鹅源性成分，测定结果与肉样中含有鹅肉的事实一致。
综上所述，本发明解决了肉类样品中鹅源性成分无法鉴别的问题，操作方法清晰，可通量检测，鉴定结果准确。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一组用于鹅源性成分鉴别的种属特征性多肽，其特征在于，鹅的特征性肽段由10-22个氨基酸组成，其序列为以下7条肽段中的任意一条或者多条：
(1) DMWMPVTSATVK；
(2) DVASAQWVPVSSSSK；
(3) EHTITPEADLSDIPGGQIAVR；
(4) FFEAVYPIEAR；
(5) AQVHLPVDALSVQAAK；
(6) DMDLIEVNEAFAPQYLAVEK；
(7) AVSAGGTSVPATLEQPVLVR。
2.一种基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的鹅的特征性肽段进行鉴别，并且7条肽段的母离子分别为m/z 683.3，m/z 774.4，m/z 740.4，m/z 671.3，m/z 549.6，m/z 1148.1，m/z 976.5；由于同位素效应的存在，上述母离子均可存在±3 Da的差值。
3.根据权利要求2所述的基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法，其特征在于，肉类样品的前处理方法包括以下步骤：
S1，配制含有尿素的蛋白质裂解液，用于肉类样品中蛋白质的提取；
S2，将肉类样品冷冻粉碎或者切成肉沫状，加入S1制备的蛋白质裂解液，震荡提取；随后低温高速离心，取上层清液备用；
S3，向S2的上层清液中加入还原剂以打开二硫键，再加入碘代试剂进行烷基化；将反应液转移至超滤管中，低温高速离心，加入碳酸氢铵水溶液洗涤超滤管，再次低温高速离心，上述洗涤、离心过程重复一次以上；
S4，向超滤管中加入碳酸氢铵水溶液和适量的胰蛋白酶进行水解，37℃恒温反应6小时以上，低温高速离心，加入适量碳酸氢铵水溶液洗涤超滤管；低温高速离心，收集合并滤液，等待上机检测。
4.根据权利要求3所述的基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法，其特征在于，肉类样品的前处理方法具体包括以下步骤：
S1，配制含有尿素的蛋白质裂解液，用于肉类样品中蛋白质的提取；
S2，将肉类样品冷冻粉碎或者切成肉沫状，加入S1制备的蛋白质裂解液，震荡提取12个小时以上；随后低温高速离心10分钟以上，取上层清液备用；
S3，向S2的上层清液中加入二硫苏糖醇溶液以打开二硫键，再加入碘乙酰胺溶液进行烷基化；将反应液转移至超滤管中，低温高速离心30-40分钟，加入碳酸氢铵水溶液洗涤超滤管，再次低温高速离心30-40分钟，上述洗涤、离心过程重复1-3次；
S4，向超滤管中加入碳酸氢铵水溶液和适量的胰蛋白酶进行水解，37℃恒温反应6小时以上，低温高速离心30-40分钟，加入适量碳酸氢铵水溶液洗涤超滤管；低温高速离心30-40分钟，收集合并滤液，等待上机检测。
5.根据权利要求2所述的基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法，其特征在于，
其液相分离条件为：以C18色谱柱为分离色谱柱，0.1%甲酸水溶液和乙腈分别作为A、B流动相；
其质谱条件为：正离子扫描模式，MRM监测模式，根据特征性肽段子离子的丰度，选择丰度较高的前10个离子进行检测分析，优选丰度较高的前6个离子。
6.根据权利要求5所述的基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法，其特征在于，所述液相分离条件中，A、B流动相采用梯度洗脱方式。
7.根据权利要求2-6任一项所述的基于特征性肽段鉴别鹅源性成分的液相质谱方法，其特征在于，其采用的检测仪器为：沃特世液相色谱串联AB SCIEX三重四极杆质谱。
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