CN115963216A - 鉴别骆驼奶和其他7种动物奶的质谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及鉴别骆驼奶和其他7种动物奶的质谱检测方法。本发明提供了专属性肽段组鉴别骆驼乳及其制品，以及使用所述多肽通过质谱法鉴定骆驼奶及奶粉中骆驼和7种动物乳源性成分的方法。所述肽段组中的多肽具有特定的序列结构及特定m/z值(包括特定的母离子和子离子)，骆驼奶特征多肽在其他7种动物奶中未见存在；牛乳源性多肽、水牛乳源性多肽、牦牛乳源性多肽、山羊乳源性多肽、绵羊乳源性多肽、驴乳源性多肽或马乳源性多肽在骆驼奶中均未见存在。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及鉴别骆驼奶和其他7种动物奶的质谱检测方法。
背景技术
近年来，驼乳、水牛乳、牦牛乳、马乳和山羊乳等特种乳因具有独特营养价值而广受消费者喜爱。联合国粮农组织(Food and agriculture organization，FAO)的数据显示，截止到2020年，牛乳仍占全球生鲜乳生产量排名的榜首，水牛奶、山羊奶、绵羊奶和骆驼奶等特种乳产量相对较低，其中骆驼乳产量远低于其他动物乳。驼乳营养丰富，被誉为“沙漠白金”，不含有过敏原β-乳球蛋白，适合过敏症患者，且成分与人乳相似，可以作为人乳替代品。但由于骆驼乳产量低，乳供应量明显受季节性波动的影响，且奶源质量难以控制，骆驼乳及其制品成为蓄意掺假的目标。往高价值的骆驼乳及其制品中掺入低值的牛、羊等动物乳是最常见的掺假行为，不仅造成消费者的经济损失，还可能危害消费者的身体健康。
食品质量和安全的评估是保证消费者免受健康风险和非法经济行为的主要挑战。人们对骆驼奶的追捧使得骆驼奶及奶粉造假事件频发，屡禁不止的一部分原因是缺少可靠、便捷的鉴定技术支持。奶粉经高温灭菌、喷雾干燥等制作工艺，破坏了本身的特性，为动物乳源性成分的来源鉴别增加了困难。目前国家还没有有效鉴别骆驼乳源性成分的方法，只能靠从生产源头进行控制，导致了许多不法企业钻空子。
目前，基于DNA的聚合酶链式反应(PCR)方法和基于蛋白质组学的质谱(MS)方法在骆驼奶与其他物种奶鉴定方面应用广泛。此外，二维凝胶电泳(2-DE)与核磁共振(NMR)方法也有应用。然而，由于多重引物设计要求高，PCR方法无法实现8物种同时检测；2-DE方法分辨率较低，需要结合MS方法进行验证，上述两种方法均增加了实验的复杂性；而NMR方法无法靶向目标物，同时需要额外的数据解析。基于蛋白质组学的质谱MRM技术克服了以上问题，前处理过程简单，质谱仪可以根据不同物种本身蛋白质氨基酸序列的细微差异识别动物乳来源，同时高效、准确地靶向目标肽。因此，迫切需要一种高效准确鉴定骆驼奶及奶粉真伪的质谱检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供的鉴别骆驼奶和其他7种动物奶的质谱检测方法，能高效、准确地靶向目标肽，对未知乳品进行鉴别，特别是骆驼乳。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了多肽X，具有：
(I)、如SEQ ID NO:X所示的氨基酸序列；或
(II)、如(I)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(I)的相同或相似；或
(III)、与如(I)或(II)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
其中，X选自2～5、7～15、17～25中的任一整数；
所述多个为2个至3个。
本发明还提供了多肽组合Y，Y选自1～7中的任一整数；
其中，多肽X具有：
(IV)、如SEQ ID NO:X所示的氨基酸序列；或
(V)、如(IV)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(IV)的相同或相似；或
(VI)、与如(IV)或(V)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
其中X选自1～25中的任一整数；
所述多个为2个至3个；
所述多肽组合1包括所述多肽1、所述多肽2、所述多肽3或所述多肽4中的两者或以上；
所述多肽组合2包括所述多肽5、所述多肽6或所述多肽7中的两者或以上；
所述多肽组合3包括所述多肽8、所述多肽9或所述多肽10中的两者或以上；
所述多肽组合4包括所述多肽11和所述多肽12；
所述多肽组合5包括所述多肽13和所述多肽14；
所述多肽组合6包括所述多肽16、所述多肽17或所述多肽18的两者或以上；
所述多肽组合7包括所述多肽19、所述多肽20、所述多肽21、所述多肽22、所述多肽23、所述多肽24或所述多肽25的两者或以上。
本发明还提供了上述多肽X的应用，包括：
当X为2、3或4时，上述多肽X在如下方面的应用：
(1)、检测骆驼乳源性成分；和/或
(2)、鉴别骆驼乳；和/或
(3)、制备检测骆驼乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(4)、制备鉴别骆驼乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为5、6或7时，上述多肽X在如下方面的应用：
(5)、检测牛乳源性成分；和/或
(6)、鉴别牛乳；和/或
(7)、制备检测牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(8)、制备鉴别牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为8、9或10时，上述多肽X在如下方面的应用：
(9)、检测水牛乳源性成分；和/或
(10)、鉴别水牛乳；和/或
(11)、制备检测水牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(12)、制备鉴别水牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为11或12时，上述多肽X在如下方面的应用：
(13)、检测牦牛乳源性成分；和/或
(14)、鉴别牦牛乳；和/或
(15)、制备检测牦牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(16)、制备鉴别牦牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为13或14时，上述多肽X在如下方面的应用：
(17)、检测山羊乳源性成分；和/或
(18)、鉴别山羊乳；和/或
(19)、制备检测山羊乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(20)、制备鉴别山羊乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为15时，上述多肽X在如下方面的应用：
(21)、检测绵羊乳源性成分；和/或
(22)、鉴别绵羊乳；和/或
(23)、制备检测绵羊乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(24)、制备鉴别绵羊乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为17或18时，上述多肽X在如下方面的应用：
(25)、检测驴乳源性成分；和/或
(26)、鉴别驴乳；和/或
(27)、制备检测驴乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(28)、制备鉴别驴乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为19、20、21、22、23、24或25时，上述多肽X在如下方面的应用：
(29)、检测马乳源性成分；和/或
(30)、鉴别马乳；和/或
(31)、制备检测马乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(32)、制备鉴别马乳的试剂、试剂盒或装置。
本发明还提供了上述多肽组合Y的应用，包括：
当Y为1时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(33)、检测骆驼乳源性成分；和/或
(34)、鉴别骆驼乳；和/或
(35)、制备检测骆驼乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(36)、制备鉴别骆驼乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为2时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(37)、检测牛乳源性成分；和/或
(38)、鉴别牛乳；和/或
(39)、制备检测牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(40)、制备鉴别牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为3时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(41)、检测水牛乳源性成分；和/或
(42)、鉴别水牛乳；和/或
(43)、制备检测水牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(44)、制备鉴别水牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为4时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(45)、检测牦牛乳源性成分；和/或
(46)、鉴别牦牛乳；和/或
(47)、制备检测牦牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(48)、制备鉴别牦牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为5时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(49)、检测山羊乳源性成分；和/或
(50)、鉴别山羊乳；和/或
(51)、制备检测山羊乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(52)、制备鉴别山羊乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为6时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(53)、检测驴乳源性成分；和/或
(54)、鉴别驴乳；和/或
(55)、制备检测驴乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(56)、制备鉴别驴乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为7时，所述多肽组合Y如下方面的应用：
(57)、检测马乳源性成分；和/或
(58)、鉴别马乳；和/或
(59)、制备检测马乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(60)、制备鉴别马乳的试剂、试剂盒或装置。
在本发明的一些具体的实施方案中，上述应用中所述检测包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与上述多肽X的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽X的质谱峰，获得检测结果；
所述鉴别包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与上述多肽X的质谱检测谱图和其他动物乳特征肽段的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽X的质谱峰和其他动物乳特征肽段的质谱峰，获得鉴别结果。
在本发明的一些具体的实施方案中，上述应用中所述检测包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与上述多肽组合Y的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽组合Y的质谱峰，获得检测结果；
所述鉴别包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与上述多肽组合Y的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽组合Y的质谱峰，获得检测结果。
本发明还提供了试剂、试剂盒和/或装置，包括如下项，以及可接受的辅料、助剂或部件：
(A)、上述多肽X；或
(B)、上述多肽组合Y；
其中，X选自1～25中的任一整数；
Y选自1～7中的任一整数。
在本发明的一些具体的实施方案中，上述试剂、试剂盒和/或装置中，所述多肽X中的X选自2～5、7～15、17～25中的任一整数。
本发明还提供了鉴别乳品的方法，包括如下步骤：
步骤(i)：对待测样品进行质谱前处理，获得待测多肽液；
步骤(ii)：通过质谱法检测上述多肽组合Y和步骤(i)所述待测多肽液，获得质谱检测谱图，通过比较所述质谱检测谱图进行判断，获得鉴别结果；
其中，Y选自1～7中的任一整数；
所述判断包括：
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合1的质谱峰，且不出现所述多肽组合2至7的质谱峰，则所述待测样品为骆驼乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合2的质谱峰，且不出现所述多肽组合1和多肽组合3至7的质谱峰，则所述待测样品为牛乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合3的质谱峰，且不出现所述多肽组合1、多肽组合2和多肽组合4至7的质谱峰，则所述待测样品为水牛乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合4的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至3和多肽组合5至7的质谱峰，则所述待测样品为牦牛乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合5的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至4、多肽组合6和多肽组合7的质谱峰，则所述待测样品为山羊乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽15的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至7的质谱峰，则所述待测样品为绵羊乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合6的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至5和多肽组合7的质谱峰，则所述待测样品为驴乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合7的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至6的质谱峰，则所述待测样品为马乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合1至7的质谱峰中的两者或以上，则所述待测样品为多种动物混合乳或掺假乳。
本发明还提供了检测骆驼乳源性成分的方法，包括如下步骤：
步骤(a)：对待测样品进行质谱前处理，获得待测多肽液；
步骤(b)：通过质谱法检测上述多肽X或上述多肽组合Y，以及步骤(a)所述待测多肽液，获得质谱检测谱图，通过比较所述质谱检测谱图判断所述待测样品是否含有骆驼乳源性成分；
所述判断包括：若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现上述多肽X的质谱峰或上述多肽组合Y的质谱峰，则所述待测样品含有骆驼乳源性成分；
其中，X选自1～4中的任一整数；
Y取值为1。
在本发明的一些具体的实施方案中，上述方法中，所述多肽X中的X选自2～4中的任一整数。
在本发明的一些具体的实施方案中，上述方法中所述质谱前处理包括对所述待测样品进行脱脂、沉淀蛋白和复溶蛋白的步骤；
具体包括如下步骤：
步骤(A)：溶解所述待测样品，冷冻，离心，除去脂肪层，获得脱脂乳；
步骤(B)：取步骤(A)所述脱脂乳与含甲酸的乙腈混合，冷冻，离心，齐去上清，获得沉淀；
步骤(C)：取步骤(B)所述沉淀与含6mol/L尿素的50mmol/L NH4HCO3溶液混合，震荡，获得复溶液；
步骤(D)：对步骤(C)所述复溶液进行还原、烷基化、酶解和过滤，获得所述待测多肽液。
本发明的多肽组合及应用有如下效果：
所述的多肽组合中的多肽具有特定的序列结构及特定m/z值(包括特定的母离子和子离子)，骆驼奶特征多肽在其他7种动物奶中未见存在。经试验验证：
1、本发明的骆驼乳源性多肽特异性良好，无干扰峰；
2、本发明的骆驼乳源性多肽的质谱峰在牛乳、水牛乳、牦牛乳、山羊乳、绵羊乳、驴乳或马乳的质谱检测谱图中未见存在；
本发明的牛乳源性多肽、水牛乳源性多肽、牦牛乳源性多肽、山羊乳源性多肽、绵羊乳源性多肽、驴乳源性多肽或马乳源性多肽的质谱峰在骆驼乳的质谱检测谱图中未见存在；
3、本发明的检测/鉴别乳品的方法中，对待测样品的质谱前处理方法具有提高肽段响应强度的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1A至图1D依次示骆驼乳SEQ ID NO:1～4特征多肽的色谱质谱图；
图2A至图2C依次示牛乳SEQ ID NO:5～7特征多肽的色谱质谱图；
图3A至图3C依次示水牛乳SEQ ID NO:8～10特征多肽的色谱质谱图；
图4A和图4B依次示牦牛乳SEQ ID NO:11～12特征多肽的色谱质谱图；
图5A和图5B依次示山羊乳SEQ ID NO:13～14特征多肽的色谱质谱图；
图6示绵羊乳SEQ ID NO:15特征多肽的色谱质谱图；
图7A至图7C依次示驴乳SEQ ID NO:16～18特征多肽的色谱质谱图；
图8A至图8G依次示马乳SEQ ID NO:19～25特征多肽的色谱质谱图；
图9示骆驼乳代表性特征肽段在牛乳、水牛乳、牦牛乳、山羊乳、绵羊乳、马乳和驴乳中的色谱质谱图(该图为牛乳、水牛乳、牦牛乳、山羊乳、绵羊乳、马乳和驴乳这7个物种乳经过骆驼MRM方法检测后色谱图的整合图)；
图10A至图10G示图9的拆分图；其中，图10A至图10G依次示牛乳、水牛乳、牦牛乳、山羊乳、绵羊乳、马乳和驴乳的色谱质谱图；
图11示样品1经检测的色谱质谱图；
图12示对照品经检测的色谱质谱图；
图13A至图13G示依次示牛乳、水牛乳、牦牛乳、山羊乳、绵羊乳、马乳和驴乳的特征肽段在骆驼奶中的检出情况；
图14示优化前的前处理方法处理的绵羊特征肽段TPEVDNEALEK肽段的色谱质谱图；
图15示优化后的前处理方法处理的绵羊特征肽段TPEVDNEALEK肽段的色谱质谱图；
图16示初步筛选时FLDDDLTDDK为骆驼的特征肽段的色谱质谱图。
具体实施方式
本发明公开了鉴别骆驼奶和其他7种动物奶的质谱检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一组鉴别骆驼奶及骆驼奶粉中骆驼和牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、驴和马乳源性成分的多肽。
本发明对骆驼奶、牛奶、水牛奶、牦牛奶、山羊奶、绵羊奶、驴奶和马奶中的多肽进行了研究，并进行了特异性验证，建立了从多肽水平对骆驼奶及奶粉中骆驼乳源性成分和其他7种动物乳源性成分进行鉴别的技术，填补了国内骆驼奶鉴别的空白。
本发明首先涉及一组用于检测骆驼奶及奶粉中骆驼乳源性成分和其他7种动物乳源性成分的多肽，所述样品包括但不限于液态奶和奶粉，所述的多肽的序列为肽段SEQ IDNO:1～4为骆驼乳源性多肽，肽段SEQ ID NO:5～7为牛乳源性多肽，肽段SEQ ID NO:8～10为水牛乳源性多肽，肽段SEQ ID NO:11～12为牦牛乳源性多肽，肽段SEQ ID NO:13～14为山羊乳源性多肽，肽段SEQ ID NO:15为绵羊乳源性多肽，肽段SEQ ID NO:16～18为驴乳源性多肽，肽段SEQ ID NO:19～25为马乳源性多肽。25条多肽对应的母离子和子离子见下表1。
表1：8个物种多肽序列及其对应的母离子和子离子
本发明所涉及的前处理方法包括如下步骤：
(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液：
(2)通过质谱法检测待测样本的多肽成分，分析样本中的动物乳源性成分。
所述的质谱前处理步骤如下：
1)吸取10mL液态乳(或称取1g奶粉用超纯水定容至10mL)，于-20℃冷冻10min，10000r/min下离心5min，后用玻璃棒挑去液态乳上层的脂肪层；
2)取200μL脱脂乳，加入800μL乙腈(含1％甲酸)，-20℃放置30min。10000r/min下离心5min，弃上清；
3)加入1mL超纯水悬浮沉淀并振荡混匀，10000r/min下离心3min，弃上清；
4)向沉淀中加入800μL 50mM NH4HCO3溶液(含6mol/L尿素)，涡旋振荡5min。观察无明显颗粒，用50mmol/L NH4HCO3溶液(含6mol/L尿素)定容至1mL；
5)超纯水稀释5倍，吸取200μL试样于1.5mL低蛋白吸附离心管，加入200μL500mmol/L NH4HCO3溶液，10μL 500mmol/L DTT，涡旋混匀，于75℃恒温水浴振荡30min；
6)静置室温，加入20μL 500mmol/L IAA，混匀，置于暗处避光反应30min；
7)加入10μL 100mmol/L CaCl2溶液，向离心管中加入20μL 100μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃酶解过夜；
8)放至室温，加入10μL甲酸终止反应，涡旋后静置15min；
9)加水补至1mL，0.22μm低蛋白吸附滤膜过滤，滤液待上机检测。
本发明还涉及骆驼奶及奶粉中骆驼乳源性成分和牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、驴和马乳源性成分检测的质谱方法，所述的质谱法检测为：
采用Shimadzu 8060质谱检测，
流动相A：0.1％(v/v)甲酸-乙腈，流动相B：0.1％(v/v)甲酸-水，
流速：0.3mL/min，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，雾化气：氮气，2L/min；加热气：空气，12L/min；干燥气：氮气，6L/min；碰撞气：氩气；离子源接口温度：350℃；脱溶剂管温度：300℃；加热模块温度：400℃。
所述的分析样本中的骆驼乳源性成分和其他7种动物乳源性成分，将待测样品的质谱结果对比SEQ ID NO:1～25的各条特异性多肽的质谱谱图，仅出现SEQ ID NO:1～4的各条特异性多肽的质谱检测谱图时，即可判断该组织样本仅存在骆驼乳源性成分，不存在其他动物乳源性成分；若存在SEQ ID NO:1～4特异性多肽的质谱检测谱图，同时存在SEQIDNO:5～25中某几条特异性多肽的质谱检测谱图，即可判断该组织样品存在骆驼乳源性成分，同时存在SEQ ID NO:5～25多肽对应物种的动物乳源性成分；若SEQ ID NO:1～4的各条特异性多肽的质谱检测不存在，则该组织样品不存在骆驼乳源性成分。
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
通过质谱分析纯骆驼奶/奶粉样本和牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、驴和马奶/奶粉样本，利用ProteinPilot软件对质谱结果进行检索比对分析，发现骆驼奶/奶粉专属性特征多肽，序列SEQ ID NO:1～4；以及牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、驴和马奶/奶粉专属性特征多肽，序列SEQ ID NO:5～25。
具体的质谱分析方法如下：
首先，对选取的纯奶/奶粉样本进行质谱分析，步骤包括：
(一)样本前处理步骤：
1)吸取10mL液态乳(或称取1g奶粉用超纯水定容至10mL)，于-20℃冷冻10min，10000r/min下离心5min，后用玻璃棒挑去液态乳上层的脂肪层；
2)取200μL脱脂乳，加入800μL乙腈(含1％甲酸)，-20℃放置30min。10000r/min下离心5min，弃上清；
3)加入1mL超纯水悬浮沉淀并振荡混匀，10000r/min下离心3min，弃上清；
4)向沉淀中加入800μL 50mmol/L NH4HCO3溶液(含6mol/L尿素)，涡旋振荡5min。观察无明显颗粒，用50mmol/L NH4HCO3溶液(含6mol/L尿素)定容至1mL；
5)超纯水稀释5倍，吸取200μL试样于1.5mL低蛋白吸附离心管，加入200μL500mmol/L NH4HCO3溶液，10μL 500mmol/L DTT，涡旋混匀，于75℃恒温水浴振荡30min；
6)静置室温，加入20μL 500mmol/L IAA，混匀，置于暗处避光反应30min；
7)加入10μL 100mmol/L CaCl2溶液，向离心管中加入20μL 100μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃酶解过夜；
8)放至室温，加入10μL甲酸终止反应，涡旋后静置15min；
9)加水补至1mL，0.22μm低蛋白吸附滤膜过滤，滤液待上机检测。
(二)上机检测，
采用Shimadzu 8060质谱的检测方法如下：
流动相A：0.1％(v/v)甲酸-乙腈，流动相B：0.1％(v/v)甲酸-水，
流速：0.3mL/min，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，雾化气：氮气，2L/min；加热气：空气，12L/min；干燥气：氮气，6L/min；碰撞气：氩气；离子源接口温度：350℃；脱溶剂管温度：300℃；加热模块温度：400℃。
其次，依据纯奶/奶粉样本的质谱结果，利用ProteinPilot软件对质谱结果进行检索比对分析，
(1)筛选得到在骆驼奶/奶粉中确实存在的专属特征多肽组，组中的各条多肽序列信息如下SEQ ID NO:1～4；
(2)筛选得到在牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、驴和马奶/奶粉中确实存在的专属特征多肽组，组中的各条多肽序列信息分别如下SEQ ID NO:5～7、SEQ ID NO:8～10、SEQ IDNO:11～12、SEQ ID NO:13～14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16～18、SEQ ID NO:19～25。
肽段1～25的色谱质谱图如图1～图8所示。
最后，用相同的方法处理并检测骆驼、牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、驴和马奶/奶粉样本，质谱检测结果进行匹配，结果显示，SEQ ID NO:1～4所示的各条多肽样本，在牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、驴和马奶/奶粉中均不存在。图9示牛乳、水牛乳、牦牛乳、山羊乳、绵羊乳、驴乳和马乳这7个物种乳经过骆驼MRM方法检测后色谱图的整合图，图10A～图10G示图9的拆分图。
实施例2
检测不特定骆驼奶/奶粉样本，判断是否为其他动物奶掺杂产品。
对送检的骆驼奶或骆驼奶粉样本及市售骆驼奶/奶粉进行质谱分析，确定是否为纯骆驼奶/奶粉。
对待测样品的处理和检测方法同实施例1中的处理和检测方法。
(1)出现实施例1所述SEQ ID NO:1～4的各条特异性多肽的质谱检测谱图时，若SEQ IDNO:5～25特异性多肽的质谱检测存在，即可判断该样本存在其他动物奶成分，根据所属物种特异性肽段可进一步判断存在该种动物奶成分；若SEQ ID NO:1～4特异性多肽的质谱检测存在，且SEQ ID NO:5～25特异性多肽的质谱检测均不存在，即可判断该样品为纯骆驼奶/奶粉；
(2)若SEQ ID NO:1～4的各条特异性多肽的质谱检测不存在，则该样品不存在骆驼奶成分。
样品1仅检出骆驼乳源性成分：
选取实施例1中的两条骆驼奶特征多肽(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4)、两条牛奶特征多肽(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7)和两条山羊奶特征多肽(SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14)作为参考，相同的检测条件下，样品1中检出选取的两条骆驼奶特征多肽的色谱峰，未见牛奶和山羊奶的特异性多肽色谱峰(详见图11)；可见，样品1中仅含有骆驼乳源性成分。
对照品仅检出牛奶乳源性成分，未检出骆驼乳源性成分：
选取实施例1中的两条骆驼奶特征多肽(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4)、两条牛奶特征多肽(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7)和两条山羊奶特征多肽(SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14)作为参考，相同的检测条件下，对照品牛奶中检出牛奶特征多肽的色谱峰，未检出骆驼奶和山羊奶的特征多肽色谱峰(详见图12)。
实施例3
本发明还了验证了牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、驴、马奶的特征肽段在骆驼奶中的检出情况，处理方法和检测方法同实施例1，结果如图13A至图13G所示，其它7个物种的特征肽段在骆驼奶中均未检出。上述验证结果表明所选骆驼的4条肽段确为该物种特异性肽段。
对比例1
以下为优化前的前处理方式，待测样品的检测方法同实施例1。
取10mL液态乳(1g奶粉定容至10mL)，加入1mL 5％醋酸水溶液、2mL二氯甲烷。10000rpm离心10min，液体分3层，取顶层乳清蛋白溶液200μL于1.5mL低蛋白吸附离心管，加入200μL 500mmol/L的碳酸氢铵、10μL 500mmol/L DDT后涡旋1min，置于75℃水浴锅中30min。加入20μL 500mmol/L IAA，涡旋混匀后避光反应30min。向离心管中加入20μL100μg/mL的胰蛋白酶(溶于缓冲液)，37℃酶解过夜。放至室温，加入10μL甲酸，涡旋后静置15min。向其加入540μL超纯水至1mL，混匀后通过注射器过滤。
结果绵羊特征肽段TPEVDNEALEK(SEQ ID NO:26)肽段响应如图14所示，而采用本发明所述的前处理方式(如图15所示)，TPEVDNEALEK肽段响应强度提高了约100倍。
对比例2
初步筛选时FLDDDLTDDK(SEQ ID NO:27)为骆驼的特征肽段，但因其存在干扰峰(见图16)，所以后续将其删除。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.多肽X，其特征在于，具有：
(I)、如SEQ ID NO:X所示的氨基酸序列；或
(II)、如(I)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(I)的相同或相似；或
(III)、与如(I)或(II)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
其中，X选自2～5、7～15、17～25中的任一整数；
所述多个为2个至3个。
2.多肽组合Y，其特征在于，Y选自1～7中的任一整数；
其中，多肽X具有：
(IV)、如SEQ ID NO:X所示的氨基酸序列；或
(V)、如(IV)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(IV)的相同或相似；或
(VI)、与如(IV)或(V)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
其中X选自1～25中的任一整数；
所述多个为2个至3个；
所述多肽组合1包括所述多肽1、所述多肽2、所述多肽3或所述多肽4中的两者或以上；
所述多肽组合2包括所述多肽5、所述多肽6或所述多肽7中的两者或以上；
所述多肽组合3包括所述多肽8、所述多肽9或所述多肽10中的两者或以上；
所述多肽组合4包括所述多肽11和所述多肽12；
所述多肽组合5包括所述多肽13和所述多肽14；
所述多肽组合6包括所述多肽16、所述多肽17或所述多肽18的两者或以上；
所述多肽组合7包括所述多肽19、所述多肽20、所述多肽21、所述多肽22、所述多肽23、所述多肽24或所述多肽25的两者或以上。
3.如权利要求1所述的多肽X的应用，其特征在于，包括：
当X为2、3或4时，如权利要求1所述的多肽X在如下方面的应用：
(1)、检测骆驼乳源性成分；和/或
(2)、鉴别骆驼乳；和/或
(3)、制备检测骆驼乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(4)、制备鉴别骆驼乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为5、6或7时，如权利要求1所述的多肽X在如下方面的应用：
(5)、检测牛乳源性成分；和/或
(6)、鉴别牛乳；和/或
(7)、制备检测牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(8)、制备鉴别牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为8、9或10时，如权利要求1所述的多肽X在如下方面的应用：
(9)、检测水牛乳源性成分；和/或
(10)、鉴别水牛乳；和/或
(11)、制备检测水牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(12)、制备鉴别水牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为11或12时，如权利要求1所述的多肽X在如下方面的应用：
(13)、检测牦牛乳源性成分；和/或
(14)、鉴别牦牛乳；和/或
(15)、制备检测牦牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(16)、制备鉴别牦牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为13或14时，如权利要求1所述的多肽X在如下方面的应用：
(17)、检测山羊乳源性成分；和/或
(18)、鉴别山羊乳；和/或
(19)、制备检测山羊乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(20)、制备鉴别山羊乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为15时，如权利要求1所述的多肽X在如下方面的应用：
(21)、检测绵羊乳源性成分；和/或
(22)、鉴别绵羊乳；和/或
(23)、制备检测绵羊乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(24)、制备鉴别绵羊乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为17或18时，如权利要求1所述的多肽X在如下方面的应用：
(25)、检测驴乳源性成分；和/或
(26)、鉴别驴乳；和/或
(27)、制备检测驴乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(28)、制备鉴别驴乳的试剂、试剂盒或装置；
当X为19、20、21、22、23、24或25时，如权利要求1所述的多肽X在如下方面的应用：
(29)、检测马乳源性成分；和/或
(30)、鉴别马乳；和/或
(31)、制备检测马乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(32)、制备鉴别马乳的试剂、试剂盒或装置。
4.如权利要求2所述的多肽组合Y的应用，包括：
当Y为1时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(33)、检测骆驼乳源性成分；和/或
(34)、鉴别骆驼乳；和/或
(35)、制备检测骆驼乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(36)、制备鉴别骆驼乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为2时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(37)、检测牛乳源性成分；和/或
(38)、鉴别牛乳；和/或
(39)、制备检测牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(40)、制备鉴别牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为3时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(41)、检测水牛乳源性成分；和/或
(42)、鉴别水牛乳；和/或
(43)、制备检测水牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(44)、制备鉴别水牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为4时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(45)、检测牦牛乳源性成分；和/或
(46)、鉴别牦牛乳；和/或
(47)、制备检测牦牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(48)、制备鉴别牦牛乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为5时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(49)、检测山羊乳源性成分；和/或
(50)、鉴别山羊乳；和/或
(51)、制备检测山羊乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(52)、制备鉴别山羊乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为6时，所述多肽组合Y在如下方面的应用：
(53)、检测驴乳源性成分；和/或
(54)、鉴别驴乳；和/或
(55)、制备检测驴乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(56)、制备鉴别驴乳的试剂、试剂盒或装置；
当Y为7时，所述多肽组合Y如下方面的应用：
(57)、检测马乳源性成分；和/或
(58)、鉴别马乳；和/或
(59)、制备检测马乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或
(60)、制备鉴别马乳的试剂、试剂盒或装置。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与如权利要求1所述的多肽X的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽X的质谱峰，获得检测结果；
所述鉴别包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与如权利要求1所述的多肽X的质谱检测谱图和其他动物乳特征肽段的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽X的质谱峰和其他动物乳特征肽段的质谱峰，获得鉴别结果。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与如权利要求2所述的多肽组合Y的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽组合Y的质谱峰，获得检测结果；
所述鉴别包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与如权利要求2所述的多肽组合Y的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽组合Y的质谱峰，获得检测结果。
7.试剂、试剂盒和/或装置，其特征在于，包括如下项，以及可接受的辅料、助剂或部件：
(A)、如权利要求1所述的多肽X；或
(B)、如权利要求2所述的多肽组合Y；
其中，X选自1～25中的任一整数；
Y选自1～7中的任一整数。
8.鉴别乳品的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(i)：对待测样品进行质谱前处理，获得待测多肽液；
步骤(ii)：通过质谱法检测如权利要求2所述的多肽组合Y和步骤(i)所述待测多肽液，获得质谱检测谱图，通过比较所述质谱检测谱图进行判断，获得鉴别结果；
其中，Y选自1～7中的任一整数；
所述判断包括：
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合1的质谱峰，且不出现所述多肽组合2至7的质谱峰，则所述待测样品为骆驼乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合2的质谱峰，且不出现所述多肽组合1和多肽组合3至7的质谱峰，则所述待测样品为牛乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合3的质谱峰，且不出现所述多肽组合1、多肽组合2和多肽组合4至7的质谱峰，则所述待测样品为水牛乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合4的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至3和多肽组合5至7的质谱峰，则所述待测样品为牦牛乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合5的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至4、多肽组合6和多肽组合7的质谱峰，则所述待测样品为山羊乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽15的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至7的质谱峰，则所述待测样品为绵羊乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合6的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至5和多肽组合7的质谱峰，则所述待测样品为驴乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合7的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至6的质谱峰，则所述待测样品为马乳；或
若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合1至7的质谱峰中的两者或以上，则所述待测样品为多种动物混合乳或掺假乳。
9.检测骆驼乳源性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(a)：对待测样品进行质谱前处理，获得待测多肽液；
步骤(b)：通过质谱法检测如权利要求1所述的多肽X或如权利要求2所述的多肽组合Y，以及步骤(a)所述待测多肽液，获得质谱检测谱图，通过比较所述质谱检测谱图判断所述待测样品是否含有骆驼乳源性成分；
所述判断包括：若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现如权利要求1所述的多肽X的质谱峰或如权利要求2所述的多肽组合Y的质谱峰，则所述待测样品含有骆驼乳源性成分；
其中，X选自1～4中的任一整数；
Y取值为1。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述质谱前处理包括对所述待测样品进行脱脂、沉淀蛋白和复溶蛋白的步骤；
具体包括如下步骤：
步骤(A)：溶解所述待测样品，冷冻，离心，除去脂肪层，获得脱脂乳；
步骤(B)：取步骤(A)所述脱脂乳与含甲酸的乙腈混合，冷冻，离心，齐去上清，获得沉淀；
步骤(C)：取步骤(B)所述沉淀与含6mol/L尿素的50mmol/L NH4HCO3溶液混合，震荡，获得复溶液；
步骤(D)：对步骤(C)所述复溶液进行还原、烷基化、酶解和过滤，获得所述待测多肽液。
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