CN103360468A - 一种scd1多肽及抗鹅scd1多肽多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鹅硬酯酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）多肽及该多肽多克隆抗体的制备方法。SCD1多肽的氨基酸序列为：HLLQEEEFSSASST。多克隆抗体的制备方法，是合成上述鹅SCD1多肽序列，在其N端增加一个半胱氨酸得N端修饰肽，将N端修饰肽与载体蛋白得到交联的多肽，用交联的多肽免疫动物，收集免疫新西兰兔血液制备抗血清，从血清中分离纯化得到IgG。本发明制备的抗体具有生产成本低；特异性好；效价高，可与细胞内源性SCD1蛋白特异性结合反应，能够满足免疫印迹、免疫组织化学和酶联免疫吸附等试验需求，用于建立体外免疫分析和SCD1蛋白功能研究。

Description

一种SCD1多肽及抗鹅SCD1多肽多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种SCD1多肽及抗鹅SCD1多肽多克隆抗体的制备方法，这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测。

背景技术

硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Stearoyl-CoA desaturase，SCD1）是细胞合成单不饱和酸的限速酶，催化饱和脂肪酸的软脂酰辅酶A脱氢，其首选底物是软脂酰辅酶A和硬脂酰辅酶A，分别转化生成棕榈酸和油酸。SCD1基因也是瘦素作用的目的基因之一，在体内脂质代谢中起到中心调节作用。目前包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊猪和牛、鸡鹅等SCD基因都已被分离鉴定出来。

利用水禽（鸭和鹅）生产的肥肝质地细嫩，口味鲜美，更重要的是其中的富含对人体有益的不饱和脂肪酸，因而被誉为世界三大美食之一。其中鹅肥肝因形大、质优、价高，而格外受到人们的喜爱。肝脏在人和动物脂肪代谢过程起到重要作用，正常情况下肝脏内脂肪处于动态平衡状态，保持肝内脂肪含量正常恒定。在某些特殊状态下，这种平衡被打破很可能造成肝脏脂肪代谢紊乱，本实验室前期通过对鹅填饲过程中差异表达基因和蛋白的筛选，结果表明SCD1在填饲前后鹅肝脏中表达变化差异显著，暗示SCD1可能在鹅肥肝形成过程中起到重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产成本低、特异性好、效价高，可与细胞内源性SCD1蛋白特异性结合反应，能够满足免疫印迹、免疫组织化学和酶联免疫吸附等试验需求的兔抗鹅SCD1多肽多克隆抗体及其制备方法。

本发明目的的实现为：所述的SCD1多肽的氨基酸序列为：HLLQEEEFSSASST，如SEQ ID NO.1所示。

所述的兔抗鹅SCD1多肽多克隆抗体制备方法，合成SEQ ID NO.1所示序列，在其N端增加一个半胱氨酸得N端修饰肽，将N端修饰肽与载体蛋白得到交联的多肽，用交联的多肽免疫动物，收集免疫新西兰兔血液制备抗血清，从血清中分离纯化得到IgG。

本发明方法中所述载体蛋白为匙空血蓝蛋白（KLH）。N端修饰肽通过交联剂与载体蛋白进行交联，形成交联肽。交联的多肽与免疫佐剂混合乳化后，在新西兰兔背部皮下多点注射，共四次免疫。

上述方法中，经过硫酸铵沉淀、蛋白A亲和纯化及肽亲和纯化从抗血清中分离得到高纯度的IgG。

具体的步骤如下：

步骤一：多肽序列分析与设计：经DNAStar软件对SCD1（GenBank：HQ197924）蛋白氨基酸序列分析后，确定SCD1蛋白N末端4-17位14个氨基酸作为其抗原表位，氨基酸序列为HLLQEEEFSSASST。为保证多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在N端添加一个半胱氨酸，故最终合成多肽序列为CHLLQEEEFSSASST(N端修饰肽，SEQ ID NO.2)；

步骤二：SCD1的N端修饰肽肽合成：使用ACT396多肽自动合成仪合成SCD1N端修饰肽；

步骤三：N端修饰肽与载体蛋白交联：N端修饰肽与载体蛋白KLH通过Sulfo-SMCC交联法进行交联。

步骤四：多肽免疫与抗血清制备：将乳化后的SCD1多肽-KLH复合蛋白（即交联肽）于新西兰兔背部皮下免疫注射，共进行四次免疫；收集、分离得到的含有兔抗鹅SCD1多肽抗体的血清;

步骤五：使用Sulfo-link-gel多肽交联为层析填料，半胱氨酸封闭，制备多肽亲和层析柱；将步骤四获得的含有兔抗鹅SCD1多肽抗体的血清加入制备好层析柱中，置于4℃过夜孵育后，洗脱抗体，即得到兔抗鹅SCD1多肽多克隆抗体。

所述的兔抗鹅是通过以下步骤鉴定的：

免疫印迹：将所获得的SCD1多肽多克隆抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法，确认该抗体能够与变性后的天然SCD1蛋白相互作用，可以用于免疫印迹试验。本发明制得的兔抗鹅SCD1多肽多克隆抗体，效价在1：240000以上。

本发明制备的抗体具有生产成本低、特异性好、效价高，可与细胞内源性SCD1蛋白特异性结合反应，能够满足免疫印迹、免疫组织化学和酶联免疫吸附等试验需求，用于建立体外免疫分析和SCD1蛋白生物学功能研究，具有重要的理论和实践价值。

附图说明

图1为本发明的兔抗SCD1多肽多克隆抗体检测不同填饲阶段鹅肝脏SCD1蛋白表达的特异性结果图；1为填饲0天；2为填饲10天；3为填饲19天。

具体实施方式

实施例一：鹅SCD1抗原肽分析与设计

经DNAStar软件对鹅SCD1氨基酸序列进行亲水性（Hydrophilicity）、抗原指数（Antigenicity）、表面可及性（Surface probability）及同源性（Homology）分析后，确定SCD1蛋白N末端4-17位14个氨基酸作为靶标，氨基酸序列为HLLQEEEFSSASST,SEQ ID NO.1。为保证多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在N端添加一个半胱氨酸，故最终合成多肽序列为CHLLQEEEFSSASST,SEQID NO.2。

实施例二：SCD1多肽合成

使用ACT396全自动多通道多肽合成仪合成N端修饰的SCD1多肽；将合成好的多肽用于50%的乙腈，采用质谱仪鉴定以确认其为所需的目的多肽。

实施例三：多肽与载体蛋白交联

采用Sulfo-SMCC作为交联剂将载体蛋白KLH与N端修饰多肽交联，具体方法如下：10mg KLH溶于0.5ml超纯水中；3mg溶于0.5ml超纯水中，用3MNaOH调pH值为7.0。将sulfo-SMCC溶液逐滴加入KLH溶液中，室温下旋转混匀反应30min。将混合液上样到预先用平衡缓冲液平衡过30min的SephadexG25柱中，收集活化的sulfo-SMCC/KLH洗脱液。取2.0mg待交联多肽溶解在200μl PBS中，取0.2体积sulfo-SMCC/KLH洗脱液加入多肽溶液中，调pH值为7.3，室温振摇4h，冷冻干燥备用。

实施例四：多肽免疫与抗血清制备

将500μg的KLH-多肽复合物溶于500μl1×PBS溶液中，与等体积的完全福氏佐剂混合均匀。免疫动物选取适龄新西兰白兔（体重标准为2.0-2.5kg），经适应性饲养后背部皮下进行多点注射（不少于15点）。以后每隔两周进行加强免疫一次，加强免疫所用的KLH-多肽复合物的量为200μg，并改用不完全福式佐剂乳化抗原，反复加强免疫。耳缘静脉采血采用间接ELISA法检测免疫血清效价，至血清抗体效价达到1：240000时停止免疫，采用颈动脉放血的方式收集血液，并制备血清。

实施例五：抗多肽抗体的纯化

采用亲和层析的方法纯化抗体，分为亲和层析柱的制备与抗体纯化两步。

亲和层析柱的制备：取1g CNBr活化的Sepharose4B琼脂糖凝胶珠用1mmol/L HCl进行预处理后，再用偶联缓冲液冲洗2次。迅速与溶于5ml偶联缓冲液的500μg N端修饰肽进行混合，室温条件下旋转混合2h。加入0.2mol/L甘氨酸溶液以终止反应，室温条件下旋转混合1h。用偶联缓冲液和甘氨酸缓冲液交替洗2次，最后用1×PBS清洗凝胶，制备好的凝胶保存于1×PBS中，并加入终浓度为0.02％的叠氮钠，4℃保存。

抗体纯化：在层析柱中加入1ml Sulfo-link-gel，待柱内液体流干后再用4ml偶联缓冲液洗层析柱。合成的N端修饰肽用1ml偶联缓冲液溶解后加入层析柱中，再向其中加入1ml偶联缓冲液，室温颠倒混匀1h。用6ml偶联缓冲液洗层析柱后加入3ml半胱氨酸进行封闭1h。用20ml50mM pH值为7.4的PBS对柱子进行预处理，流速为60ml/h。将10ml抗血清用稀释为20ml后加入预处理后的柱子，重复上样一次。用30ml50mM pH值为7.4的PBS冲洗层析柱后用15ml0.1M pH值为3.0的Glycine-HCl进行洗脱后即为纯化的抗体。用50mM pH值为7.4的PBS和0.02%硫柳汞钠对柱子进行再生，4℃保存多肽柱。

实施例六：间接ELISA法测定抗血清的效价。

ELISA法测板用KLH-SCD1多肽复合物以1μg/ml的浓度包被，每孔100μl，4℃条件下包被过夜。然后每孔用10％的山羊血清200μl室温封闭2小时后洗涤，将由实施方案四制备的抗体按稀释比例为1∶200、1∶1000、1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶60000、1∶120000、1：240000进行稀释后加入各孔，用TBST以200μl/孔洗涤2遍。再加入以1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗37℃条件下孵育45min，用TPBS以200μl/孔洗涤3遍，以100μl/孔加入TBE显色液，在37℃条件下孵育15min后测定450nm波长的吸光值，用Multiskantransmit软件分析得出抗体效价，本实施方式抗体效价为1：240000。

实施例七：免疫印迹实验确定抗体的特异性。

采用RIPA裂解液提取鹅肝脏组织蛋白。按照标准方法配制SDS-PAGE凝胶，取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度，和等体积2×上样缓冲液混合后于100℃沸水中煮沸5min，使蛋白变性，冰上骤冷，3000rpm/m离心1min。每孔加上样液2μl，使得总蛋白量为20ug。先用80v恒压电泳约20min，当指示剂溴芬兰进入分离胶后改用110V恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时终止电泳。采用电转膜法恒流300mA90min转膜至PVDF膜，用5％BSA室温封闭2h，于摇床上用TBST洗膜3次。将实施方式四获得的SCD1抗体作为一抗，用TBST按1：50稀释后加入孵育袋中，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次后辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔二抗室温孵育2h，于化学发光检测试剂（试剂A：试剂B＝1：1）反应2min，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用X胶片感光、显影、定影，得到免疫印迹结果。免疫印迹试验结果图见附图1。

试验效果

抗体效价：多只兔抗血清效价在1：240000以上

免疫印迹：免疫印迹试验表明所制备的抗体可以用于检测鹅肝脏组织中SCD1蛋白表达。

Claims (7)

1.一种鹅SCD1多肽，其特征在于：SCD1多肽的氨基酸序列为：HLLQEEEFSSASST。

2.一种兔抗鹅SCD1多肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于：合成权利要求1所述鹅SCD1多肽序列，在其N端增加一个半胱氨酸得N端修饰肽，将N端修饰肽与载体蛋白得到交联的多肽，用交联的多肽免疫动物，收集免疫新西兰兔血液制备抗血清，从血清中分离纯化得到IgG。

3.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于：所用载体蛋白为匙空血蓝蛋白（KLH）。

4.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于：N端修饰肽通过交联剂与载体蛋白进行交联，形成交联肽。

5.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于：交联的多肽与免疫佐剂混合乳化后，在新西兰兔背部皮下多点注射，共四次免疫。

6.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于：经过硫酸铵沉淀、蛋白A亲和纯化及肽亲和纯化从抗血清中分离得到高纯度的IgG。

7.一种兔抗鹅SCD1多肽多克隆抗体，其特征在于：该多克隆抗体效价在1：240000以上。

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