CN101921312A

CN101921312A - 一种人hnrpf多肽及其抗体制备方法

Info

Publication number: CN101921312A
Application number: CN2009101365628A
Authority: CN
Inventors: 王敏; 石春林; 张虎生; 田睿; 薛沿宁; 江虹
Original assignee: BEIJING AVIVA SYSTEMS BIOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING AVIVA SYSTEMS BIOLOGY Co Ltd
Priority date: 2009-05-08
Filing date: 2009-05-08
Publication date: 2010-12-22

Abstract

本发明公开了一种C端特异的人HNRPF多肽以及抗体的制备方法，属于以抗体为特征的体外实验用的生物制品。C端特异的人HNRPF多肽的氨基酸序列为：SAAQATYSGLESQS。抗人HNRPF多肽抗体按以下方法制备：(1)人HNRPF抗原表位分析；(2)人HNRPF C端多肽合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔抗人HNRPF多肽抗体；(5)收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗人HNRPF多肽抗体。本发明制备的C端特异的抗人HNRPF合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然人HNRPF发生特异性结合反应；制备成本低；纯化后的抗体可以用于免疫印迹和免疫组化。该抗体为HNRPF蛋白的基础研究，比如对HNRPF的特性、功能、表达谱和含量的分析，及其相关疾病的研究提供了一个重要的工具。

Description

一种人HNRPF多肽及其抗体制备方法

1.技术领域

本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法，这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测。

2.背景技术

1)HNRPF功能：HNRPF是核不均一核糖核蛋白家族的成员(J Biol Chem.1995 Dec1；270(48)：28780-9)。核不均一核糖核蛋白是和核不均一核RNA结合的RNA结合蛋白。这些蛋白和核内Pre-mRNA相关，他们调节Pre-mRNA的选择性剪切，多聚腺苷酸化以及mRNA代谢和转运中的其他方面。核不均一核糖核蛋白有独特的核酸结合特性。HNRPF有三个重复的类RRM结构域，他们与RNA的富鸟苷酸区域结合。(Nucleic Acids Res.2006Aug 2；34(13)：3634-45)

2)HNRPF抗体产品信息：经检索，市场上有抗HNRPF的多克隆抗体，但这些多克隆抗体均不能用于免疫组化。

3)HNRPF抗体的应用：在结肠癌的癌前病变和癌变阶段，HNRPF呈现出高水平的表达，这反应出HNRPF在结肠癌的早期发生中扮演着一定的角色(Cancer Res.2006Jan 15；66(2)：763-9)。这提示我们，HNRPF可以作为结肠癌发展中的标志物。

3.发明内容

本发明提供了一种HNRPF多肽，其序列为：SAAQATYSGLESQS。用此多肽制备的抗HNRPF抗体可以在免疫印迹(Western blot)及免疫组化(IHC)分析中特异识别组织或细胞中的天然HNRPF蛋白。抗HNRPF抗体是通过以下步骤获得的：

步骤一：多肽序列的分析和设计：利用DNAstar软件对HNRPF蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定HNRPF蛋白383-396位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为SAAQATYSGLESQS。

步骤二：多肽合成和交联：采用ACT396全自动多通道多肽合成仪合成目的多肽，并采用质谱进行鉴定；

为增强多肽的抗原性，将HNRPF多肽与载体蛋白KLH采用Sulfo-SMCC交联法进行交联。

步骤三：多肽免疫和抗血清制备：将交联后的HNRPF-KLH与弗氏佐剂混合乳化，在新西兰兔背部进行皮内注射免疫，并反复加强免疫，至取血检测抗体效价达到标准时停止免疫。

步骤四：抗体纯化：实验兔抗体效价达到标准后，采用心脏取血，分离抗血清，采用Protein A纯化全抗体后，进一步采用肽亲和纯化，得到目标抗体。

抗HNRPF抗体是通过以下步骤鉴定的：

步骤一：免疫印迹：将所获得的HNRPF抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法，用于检测抗原，确认该抗体能够与变性后的天然HNRPF蛋白相互作用，可用于免疫印迹试验。

步骤二：免疫组化：将所获得的HNRPF抗体作为一抗，采用标准的免疫组化方法，用于检测组织芯片(9种胎儿组织)，确认该抗体能够与具有天然结构的HNRPF蛋白相互作用，可用于免疫组化试验。

4.附图说明

图1为Western blot图，泳道B检测的约48kDa的条带即为HNRPF蛋白信号。

图2为IHC图，图中箭头所指为HNRPF蛋白阳性反应信号。

5.具体实施方式

1)多肽序列的分析和设计

利用DNAstar软件对HNRPF蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定HNRPF蛋白383-396位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为SAAQATYSGLESQS。同时，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在N末端增加一个半胱氨酸C，最终待合成多肽序列为CSAAQATYSGLESQS。

2)多肽合成和交联

采用ACT396全自动多通道多肽合成仪，按照编制好的程序自动合成目的多肽，将合成后的多肽溶于50％乙睛，采用质谱仪进行鉴定，确认所获得的多肽为目的多肽。采用Sulfo-SMCC作为交联剂将载体蛋白KLH与合成多肽进行交联：取10mg KLH溶于0.5ml超纯水中；取3mg sulfo-SMCC溶于0.5ml超纯水中，用3M NaOH调pH值7左右。在混匀情况下，把sulfo-SMCC溶液逐滴缓慢加入KLH溶液中，室温下旋转混匀反应物30min。将反应好的sulfo-SMCC/KLH混合液上样到预先用平衡缓冲液(0.05M PB，pH6.0)平衡过30min的Sephadex G25柱中，收集浅灰色洗脱液，即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ul PBS(pH7.3)溶解2mg交联多肽，把0.2体积的sulfo-SMCC/KLH复合物溶液加入到多肽溶液中，调pH值到7.3，室温振摇4小时，-70℃冷冻后，用冻干机冻干24小时后备用。通过Ellman法检测交联前后多肽巯基确定多肽交联效率。

3)多肽免疫和抗血清制备

将交联好的KLH-多肽400μg溶于400μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化(至在水中不扩散为准)。采用兔龄3个月，体重1.75-2.25Kg的健康新西兰兔进行免疫，进行背部皮内注射免疫，至少要注射20点以上。首次免疫3周后，将300μg多肽溶于300μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行皮内免疫，作为第一次加强免疫，要求背部皮内注射免疫，至少要注射15点以上。第二次免疫3周后，进行第二次加强免疫，方法和要求同第一次加强免疫。1周后，采用耳缘静脉微量取血，用未交联的合成多肽包被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价。重复加强免疫和效价测定，直至血清效价达到1∶10000以上，采用心脏取血标准方法获得抗血清。

4)抗体亲和纯化

(1)、TIgG纯化：用移液器将50％的Protein-A Sepharose混悬液10ml加到30ml层析柱中，去掉顶盖和底帽，液体流出后的柱床体积即为5ml，然后用25ml去离子水冲洗3遍。取出对应的血清10ml，与2ml PBS混合后加入30ml层析柱中，旋转混合器上室温(20-25℃)混旋1小时，让血清样品流出。再用15ml纯化洗液洗层析柱3次，加入10ml洗脱液进行洗脱。

(2)、肽亲和纯化：在层析柱中加入1ml Sulfo-link凝胶悬液(0.5ml凝胶)，待柱内液体流干，用4ml偶联缓冲液冲洗层析柱。用1ml偶联缓冲液溶解合成的HNRPF多肽，并加入层析柱，再加入1ml偶联缓冲液至层析柱中，室温颠倒混匀1小时。用6ml偶联缓冲液冲洗层析柱，然后加入3ml封闭液，室温混匀1小时。冲洗层析柱3次，然后向层析柱内加入6ml IgG及3ml PBS，室温颠倒混匀1小时。用PBS冲洗层析柱3次，然后用2ml洗脱液洗脱。将所获得的纯化抗体装入透析袋内4℃透析。透析过夜，然后4000rpm×35min离心除沉淀，收集上清。用间接ELISA法测定抗体效价并用Bradford法测定蛋白浓度。

5)免疫印迹分析

按照标准方法配制SDS-PAGE凝胶，将5μl蛋白浓度为5mg/ml的裂解液依次加样，恒压80V约30分钟，待样品跑过浓缩胶基本呈一条直线时，改换160V电压，电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶(约60分钟)时终止电泳，采用电转膜方法恒压100V电转80分钟转膜至PVDF膜。将所获得的HNRPF抗体作为一抗，采用浓度为1.25μg/ml与上述转膜得到的抗原在室温下杂交1小时，然后用HRP标记的羊抗兔抗体在室温下杂交1小时，采用ECL显色法进行显色，在暗室中用X片进行显色和曝光，得到免疫印迹结果。

6)免疫组织化学分析

将4％甲醛溶液固定的组织切成1.5mm×1.5mm×2.0-3.0mm的组织块，乙醇梯度脱水后二甲苯透明30分钟，62℃石蜡浸蜡2小时后，在组织包埋机上将9种组织按照3×3的排列方式用石蜡进行包埋。采用标准石蜡切片方法将切好的4-5μm厚的组织芯片蜡片贴附于APES处理过的载玻片上，在烤片机60℃烤片1小时，然后在烤箱中60℃烤片6小时。采用标准免疫组化方法，室温下用100μl 10％羊血清于湿盒中封闭切片30分钟，加入100μl浓度为4-8μg/ml的HNRPF抗体，湿盒中4℃过夜，PBS清洗后加入生物素标记羊抗兔IgG于湿盒中37℃孵育30分钟，然后PBS清洗后加入HRP标记的链霉卵白素浓缩液，湿盒中37℃孵育30分钟，洗片后1％DAB显色，苏木素复染，复蓝，脱水，透明，封片，镜检，检查结果并拍照。

序列表：

Ser Ala Ala Gln Ala Thr Tyr Ser Gly Leu Glu Ser Gln Ser

Claims

1.一种人HNRPF多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列为：SAAQATYSGLESQS

2.一种抗人HNRPF多肽的抗体制备方法，其特征在于按权力要求1所述序列合成N端修饰肽，将合成的N端修饰肽与载体蛋白交联，用交联的肽免疫动物，取免疫动物的血制备抗血清，从血清中分离纯化IgG。

3.根据权力要求2所述的抗体制备方法，其特征在于N端修饰为在序列N端增加一个半胱氨酸残基。

4.根据权力要求2所述的抗体制备方法，其特征在于载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。

5.根据权力要求2所述的抗体制备方法，其特征在于N端修饰肽通过交联剂将其巯基与载体蛋白氨基共价交联。

6.根据权力要求2所述的抗体制备方法，其特征在于交联肽与免疫佐剂混合乳化后，在兔背部通过多点皮下注射，并经二次以上加强免疫，血清的效价大于1∶10000。

7.根据权力要求2所述的抗体制备方法，其特征在于经过硫酸铵沉淀、蛋白A亲和纯化以及肽亲和纯化可以从抗血清中获得高纯度的IgG。