CN109651497A - 一种草鱼FoxO1多肽抗原、抗体及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种草鱼FoxO1多肽抗原、抗体及其制备方法、应用，属于生物化学及分子免疫学技术领域。本发明对草鱼FoxO1全长功能蛋白质氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，发现草鱼FoxO1蛋白近N端有15个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强，因此将其作为合适的草鱼FoxO1多肽抗原。以该FoxO1多肽抗原为免疫原免疫新西兰兔制备得到了抗草鱼FoxO1多肽抗原的多克隆抗体，可特异性识别草鱼组织中FoxO1全长功能蛋白质，填补了草鱼FoxO1全长功能蛋白质检测研究领域的空白，为草鱼FoxO1全长功能蛋白质调控动物脂肪代谢功能的研究奠定基础。

Description

一种草鱼FoxO1多肽抗原、抗体及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及一种草鱼FoxO1多肽抗原、抗体及其制备方法、应用，属于生物化学及分子免疫学技术领域。

背景技术

脂肪组织是动物体内最大的能量储存场所，在体内能量平衡中起关键作用，脂肪组织发育失衡往往会引发诸多健康问题。脂肪沉积的部位可能是由组织特异的脂肪代谢通路决定的，而其通路在分子水平上由关键的酶和基因参与调控。因此，采用分子生物学技术开展功能基因调控脂肪代谢的分子机制的研究势在必行。

草鱼是我国特有的淡水性鱼类，属于“四大家鱼”之一，具有较高的经济价值。大多数的养殖鱼类(特别是草鱼)在摄食含过多碳水化合物或脂类饲料后，都会出现脂肪大量蓄积、脂代谢紊乱及肝功能下降等问题。鱼类对脂质的利用代谢能力直接影响脂肪蓄积，脂肪蓄积则会造成鱼类的品质及抗应激能力下降，从而影响鱼肉的风味和品质，在高温季节还会造成鱼类大量死亡，给生产造成巨大损失。

在陆生动物中FoxO1是前体脂肪细胞和成肌细胞分化过程的重要调控因子，可能通过多条通路调控细胞增殖与分化、凋亡和细胞周期以及葡萄糖代谢和脂代谢等，暗示FoxO1在脂肪代谢中发挥重要的调控作用。

公布号CN103709242A的中国发明专利申请公开了一种基于红鳍东方鲀FoxO1基因的重组蛋白，红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是我国北方沿海重要的海水养殖经济鱼类，其肉味鲜美、营养丰富，深受东亚各国消费者的青睐。红鳍东方鲀FoxO1重组蛋白能抑制过氧化物酶体增殖体激活受体PPARγ基因的表达，调节红鳍东方鲀体内脂类代谢平衡，将其应用在鱼类养殖上可以减少鱼类脂肪沉淀，改善肉品质。但是，目前缺乏商品化的鱼FoxO1抗体，而且FoxO1单克隆抗体制备过程复杂，耗时长，耗资大，使得FoxO1全长功能蛋白质的功能研究仅停留在基因水平，严重阻碍了FoxO1全长功能蛋白质调控动物脂肪代谢的功能研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种草鱼FoxO1多肽抗原，由其制备的多克隆抗体可特异性识别草鱼组织中FoxO1全长功能蛋白质，用于检测草鱼脂肪、肝脏和肌肉组织中FoxO1全长功能蛋白质的表达水平。

本发明还提供了一种抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体，该抗体能特异性识别草鱼组织中FoxO1全长功能蛋白质，能够用于检测草鱼脂肪、肝脏和肌肉组织中FoxO1全长功能蛋白质的表达水平，解决现有技术中仍缺乏商品化的草鱼FoxO1抗体的问题，填补草鱼FoxO1全长功能蛋白质检测领域的空白。

本发明还提供了上述抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体的制备方法，能够制得效价高的抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体。

本发明还提供了上述抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体的应用，能够检测出草鱼肝脏、肌肉、脂肪组织中FoxO1全长功能蛋白质的表达水平。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种草鱼FoxO1多肽抗原，所述草鱼FoxO1多肽抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。

本发明对草鱼FoxO1全长功能蛋白氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，发现草鱼FoxO1蛋白近N端有15个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强，因此将其作为合适的抗原多肽序列。

所述草鱼FoxO1多肽抗原具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该序列为在SEQID NO.1所示的氨基酸序列C端连接一个半胱氨酸形成，多肽抗原的序列较短，因此其免疫原性较弱，半胱氨酸的添加有利于多肽抗原与载体蛋白(马来酰胺活化的匙孔血蓝蛋白KLH)偶联。

一种抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体，所述抗体特异性地与草鱼FoxO1多肽抗原结合；所述草鱼FoxO1多肽抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。

本发明中的抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体该抗体是以上述草鱼FoxO1多肽抗原为免疫抗原免疫动物制备而成的，能特异性识别草鱼组织中FoxO1全长功能蛋白质，能够用于检测草鱼脂肪、肝脏和肌肉组织中FoxO1全长功能蛋白质的表达水平，解决现有技术中仍缺乏商品化的草鱼FoxO1抗体的问题，填补草鱼FoxO1全长功能蛋白质检测领域的空白。

所述抗体为与草鱼FoxO1多肽抗原特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体和多克隆抗体可以采用常规的制备方法制得，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体都能够准确的识别草鱼组织中FoxO1全长功能蛋白质。

一种抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)将草鱼FoxO1多肽抗原免疫动物；

2)取动物的抗血清，纯化后得到所述抗体。

本发明中的抗体的制备方法能够简单、快速的制备得到抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体。

优选的，上述的抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体包括以下步骤：

1)将草鱼FoxO1多肽抗原与载体蛋白偶联，并与佐剂一起免疫动物；

2)取动物的抗血清，过所述草鱼FoxO1多肽抗原偶联的亲和层析柱纯化，得到所述抗体。

该种抗体的制备方法中选用的免疫原为草鱼FoxO1多肽抗原，但是其序列较短，因此其免疫原性较弱，而草鱼FoxO1多肽抗原与载体蛋白偶联后，免疫原性会大大增强；最终制得的多克隆抗体效价高。

更为优选的，步骤1)中采用MBS作为交联剂将所述草鱼FoxO1多肽抗原与马来酰胺活化的匙孔血蓝蛋白偶联后再免疫动物；所述草鱼FoxO1多肽抗原具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

MBS全称为顺丁烯酰胺苯甲酸琥珀酸酯，其能够将巯基和氨基交联，而如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列中C端添加了半胱氨酸(含有巯基)，在MBS存在下能够与血蓝蛋白中的氨基交联，得到偶联产物，具有更强的免疫原性，进而能刺激机体产生更多的抗体。

上述的抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体在检测草鱼组织中FoxO1全长功能蛋白质表达水平方面的应用。

上述的抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体能够特异性识别草鱼组织中FoxO1全长功能蛋白质，因此能够用于检测草鱼组织中FoxO1全长功能蛋白质的表达水平。

所述抗体在检测草鱼肝脏、肌肉、脂肪组织中FoxO1全长功能蛋白质表达水平方面的应用。肝脏、肌肉、脂肪组织中FoxO1全长功能蛋白质的含量与鱼类脂肪代谢功能有密切的关系，所述抗体可以用于检测这些组织中的FoxO1全长功能蛋白质的表达水平，进而为鱼类的脂肪代谢功能的研究提供基础。

附图说明

图1为本发明中HPLC检测如SEQ ID NO.2所示的C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原纯度的结果图；

图2为本发明中电喷雾电离质谱检测如SEQ ID NO.2所示的C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原相对分子量的结果图；

图3为本发明中应用抗草鱼FoxO1多肽抗原的多克隆抗体检测草鱼组织中FoxO1全长功能蛋白质表达量的免疫印迹结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

草鱼FoxO1多肽抗原的实施例1

本实施例中的草鱼FoxO1多肽抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

上述草鱼FoxO1多肽抗原的获得过程如下所示：

1)草鱼FoxO1多肽的设计及合成：根据GenBank上的FoxO1序列(登录号：ALI97589)获得草鱼FoxO1蛋白序列，含有654个氨基酸(如SEQ ID NO.3所示)。

2)用DNAstar软件分析草鱼FoxO1蛋白特性，分析结果见表1，该蛋白的分子量为69444.26道尔顿，等电点为6.408，为酸性蛋白。

表1草鱼FoxO1蛋白特性

分析项目(Analysis)	全蛋白(Whole Protein)
		分子量(Molecular Weight	69444.26Daltons
长度(Length)	654
		等电点(Isoelectric Point)	6.408
电荷(Charge at pH7)	-5.989

3)用DNAstar软件分析草鱼FoxO1蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明草鱼FoxO1蛋白近N端有15个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强。

4)草鱼FoxO1多肽抗原筛选：经过上述分析，最终筛选草鱼FoxO1多肽序列为：MADAAQNQMVEIDPD(1aa-15aa，如SEQ ID NO.1所示)。

草鱼FoxO1多肽抗原的实施例2

本实施例中的草鱼FoxO1多肽抗原为C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原，具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列。该序列为在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列C端连接一个半胱氨酸形成，多肽抗原的序列较短，因此其免疫原性较弱，半胱氨酸的添加有利于多肽抗原与载体蛋白(马来酰胺活化的匙孔血蓝蛋白KLH)偶联，进而增强多肽抗原免疫原性。

将上述的C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原送交上海生工(Sangon Biotech)公司进行合成。

本实施例中草鱼FoxO1多肽抗原的鉴定包括如下步骤：

1)应用HPLC，C184.6×250mm Alltima^TM分离柱进行分析，并用0.065wt％三氯乙酸的水溶液和0.05wt％三氯乙酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，于220nm检测C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原的纯度。结果表明，本发明设计并合成的C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原纯度约为98.50％(如图1所示)，图1中各个峰的出峰时间及面积大小汇总如表2所示，其中2号峰为本实施例中的草鱼FoxO1多肽抗原。

表2C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原的HPLC鉴定中各个峰汇总结果表

色谱峰#	保留时间(min)	面积(mV×s)	峰高(mV)	峰面积比(％)
					1	13.625	20254	3767	0.286
2	13.885	6974863	1019208	98.498
					3	15.001	30048	5234	0.424
4	26.095	38307	8941	0.541
					5	26.275	17769	5192	0.251
总计		7081241	1042342	100.000

2)采用电喷雾电离质谱方法测定本发明设计并合成的C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原的分子量。结果如图2所示，结果表明，本发明设计并合成的C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原的实际分子量为1750.50Da(876.25*2-2)，与理论值(1750.95Da)一致。

抗草鱼FoxO1多肽抗原的的抗体及其制备方法的实施例1

本实施例中抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体为多克隆抗体，其制备方法如下所示：

1、C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原与钥孔血蓝蛋白偶联

采用MBS作为交联剂将血蓝蛋白(马来酰亚氨活化的钥孔血蓝蛋白KLH)和C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原(见草鱼FoxO1多肽抗原的实施例2)进行交联。其操作方法是，将2mg的血蓝蛋白和2mg的C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原(见草鱼FoxO1多肽抗原的实施例2)在25℃条件下交联3h，并将上述反应液用预冷的1×PBS(pH＝7.4)中透析过夜，然后收集并获得血蓝蛋白-C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原的偶联产物。

血蓝蛋白、牛血清白蛋白和鸡卵白蛋白均可刺激辅助性T细胞并进一步诱导B细胞免疫反应，由于血蓝蛋白的抗原性比牛血清白蛋白和鸡卵白蛋白的抗原性强，因而本发明选择血蓝蛋白作为交联蛋白。本实施例的抗原氨基酸序列中C端添加了半胱氨酸(含有巯基)，在MBS存在下能够与血蓝蛋白中的氨基交联，得到偶联产物，具有更强的免疫原性，进而能刺激机体产生更多的抗体。

2、动物免疫

将上述得到的偶联产物免疫两只新西兰兔，体重2-2.5Kg。将偶联产物与弗氏完全佐剂(FCA)等体积混合并充分乳化，静脉注射免疫新西兰兔，第一次免疫15天后进行第二次免疫；此后每隔15天再加强免疫一次，共免疫注射四次，注射量为0.5mL/次。第五次免疫一周后，对免疫的新西兰兔进行颈动脉放血法采血；将全血置37℃温箱1h，再置4℃冰箱内3h(3-4h都可)，待血液凝固、血块收缩后，用毛细滴管吸取血清；于3000rpm离心15min，上清即为抗血清；分装后置4℃冰箱中保存备用(本实施例中采用该种方法)。

也可以采用如下的方法进行免疫：取健康成年雄性新西兰兔4只，体质量2-2.5Kg，初次免疫用弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化上述偶联产物，每只1mL背部多点注射，抗原量1mg/只；第一次免疫后15天进行第二次免疫；此后每隔15天再加强免疫一次，共免疫注射四次，改用等量不完全福氏佐剂(IFA)乳化抗原，剂量减半；第四次免疫一周后，对免疫新西兰兔进行颈动脉放血法采血；将全血置37℃温箱1h，再置4℃冰箱内3-4h，待血液凝固、血块收缩后，用毛细滴管吸取血清于3000rpm离心15min，上清即为抗血清；分装后置4℃冰箱中保存备用。

3、血清抗体效价检测

用4μg/mL浓度C末端修饰的草鱼FoxO1多肽抗原在4℃条件下包被间接ELISA板12h。然后，在室温条件下，用山羊血清封闭，再用磷酸盐缓冲液洗涤以去除未包被的抗原。将制备的抗体按比例为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000进行稀释。按照每孔100μL的剂量加入检测板，同时设立阴性对照和空白对照，然后每孔再加入200μL的磷酸盐缓冲液洗涤2次，再加入1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗100μL，37℃孵育45min，每孔加入200μL的磷酸盐缓冲液洗涤2次，每孔中加入100μL的TBE显色液，37℃孵育15min后，测定450nm的吸光值，与阴性血清的比值大于2.1判定为阳性，计算抗体效价。本实验得出的血清抗体效价为1:64000以上(如表3所示)。

表3新西兰兔血清抗体效价检测表

4、抗体纯化

1)饱和硫酸铵沉淀法初步纯化

a、沉淀：样品(抗血清)12000rpm离心30min，除去细胞碎片；保留上清液并测量体积；边搅拌边慢慢加入等体积的SAS(饱和硫酸铵)到上清液中，终浓度为1:1；将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6h或搅拌过夜(4℃)，使蛋白质充分沉淀。

b、透析：蛋白质溶液4℃12000rpm离心30min,弃上清保留沉淀；将沉淀溶于含20mL5wt％甘油的1×PBS，并装到透析袋中于4℃透析3次，每隔3-6h换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；透析液离心，得到上清液作为初纯抗体，测定上清液中蛋白质含量。

2)抗原偶联树脂(该树脂购自常州天地人和公司，以下各步骤均按照其说明书进行操作)

a、取适量的PabPur SulfoLink Beads加入合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。

b、关闭柱子的下端出口，加入等体积的含巯基的抗原(抗原中加巯基，便于偶联)，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育4h(3-5h都可，也可以于2-8℃震荡孵育过夜(12-15h))。

c、将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的抗原溶液，并收集流出液，再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出液，留待测试。

d、关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。

e、将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液，得到偶联了抗原的树脂。

3)抗体精细纯化

a、将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5倍柱体积的结合液进行平衡。

b、将上述得到的初纯抗体加到平衡好的树脂中，控制上样流速在1mL/min(0.5-1mL/min都可)，并收集流出液。

c、用15倍(10-15倍都可)柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。

d、使用10倍(5-10倍都可)柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。

抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体及其制备方法的实施例2

本实施例中抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体为单克隆抗体，其可以采用常规的制备方法制得，也可以采用如下所示的方法制得：

1)将草鱼FoxO1多肽抗原与载体蛋白偶联，并与佐剂一起免疫动物；

2)取动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞株融合，筛选得到单克隆抗体细胞株；

3)培养所述单克隆抗体细胞株，分泌得到所述抗体。

抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体的应用的实施例1

采用RIPA裂解液提取分别草鱼的肝脏、肌肉和脂肪组织。按照标准方法配制SDS-PAGE凝胶，分别取50μg的组织总蛋白，并加入蛋白上样缓冲液5μL，95℃高温变性5min后置于冰上，将变性后的蛋白质产物全部加入到胶孔中，先用80V恒压电泳跑浓缩胶，当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用120V恒压电泳进行分离。

在转膜仪上采用湿转法将分离的蛋白产物转至PVDF膜，200mA恒流转膜90min，用封闭液(封闭液为5％脱脂奶粉)室温摇床封闭1h后回收封闭液，将获得的FoxO1抗体(抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体及其制备方法的实施例1中得到)作为一抗，用稀释液稀释到1:1000后，4℃孵育过夜。1×TBST洗膜3次，加入HRP标记的山羊抗兔二抗孵育1h后，将1×TBST洗膜3次，ECL显色反应后得到免疫印迹结果图(如图3所示)。

从图3中可以看出，免疫印迹实验结果显示条带清晰，特异性好，说明本发明中得到的抗体能够检测出草鱼的肝脏、肌肉和脂肪组织中的FoxO1全长功能蛋白质，并且能够出表现各组织FoxO1全长功能蛋白质的表达水平。

<110> 新乡医学院

<120> 一种草鱼FoxO1多肽抗原、抗体及其制备方法、应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 草鱼FoxO1多肽抗原

<400> 1

Met Ala Asp Ala Ala Gln Asn Gln Met Val Glu Ile Asp Pro Asp

1 5 10 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> C端修饰草鱼FoxO1多肽抗原

<400> 2

Met Ala Asp Ala Ala Gln Asn Gln Met Val Glu Ile Asp Pro Asp

1 5 10 15

Cys

16

<211> 654

<212> PRT

<213> 草鱼

<221> 草鱼FoxO1蛋白全长序列

<400> 3

Met Ala Asp Ala Ala Gln Asn Gln Met Val Glu Ile Asp Pro Asp

1 5 10 15

Phe Glu Pro Leu Ser Arg Pro Arg Ser Cys Thr Trp Pro Leu Pro

20 25 30

Arg Pro Glu Phe Pro Asn Pro Ala Ala Ala Asp Ser Asn Thr Ser

35 40 45

Ser Pro Ala Pro Ser Val Lys Gln Glu Pro Ser Ser Asn Thr Asp

50 55 60

Phe Ile Asn Asn Leu Ser Leu Leu Glu Glu Asn Glu Asp Tyr Pro

65 70 75

Asp Gln Lys Pro Leu Met Leu Cys Gly Asp Phe Gln Cys Gln Glu

80 85 90

Asn Cys Ile His Gln Gln Gln Ile Pro Ser His Pro Gln Gln Val

95 100 105

Pro Val Leu Ser Ser Pro Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

110 115 120

Ala Ala Gln Arg Lys Ser Ser Ser Ser Arg Arg Asn Ala Trp Gly

125 130 135

Asn Met Ser Tyr Ala Asp Leu Ile Thr Lys Ala Ile Glu Ser Ser

140 145 150

Pro Glu Lys Arg Leu Thr Leu Ser Gln Ile Tyr Asp Trp Met Val

155 160 165

Lys Ser Val Pro Tyr Phe Lys Asp Lys Gly Asp Ser Asn Ser Ser

170 175 180

Ala Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Ser

185 190 195

Arg Phe Ile Arg Val Gln Asn Glu Gly Thr Gly Lys Ser Ser Trp

200 205 210

Trp Met Leu Asn Pro Glu Gly Gly Lys Ser Gly Lys Ser Pro Arg

215 220 225

Arg Arg Ala Ala Ser Met Asp Asn Asn Ser Lys Phe Ala Lys Ser

230 235 240

Arg Gly Arg Ala Ala Lys Lys Lys Leu Ala Leu Gln Gly Gly Pro

245 250 255

Glu Gly Gly Ala Asp Ser Pro Gly Ser Gln Tyr Gly Lys Trp Pro

260 265 270

Gly Ser Pro Asn Ser His Ser Asn Asp Asp Phe Asp Ala Trp Thr

275 280 285

Ala Phe Arg Pro Arg Thr Ser Ser Asn Ala Ser Thr Leu Ser Gly

290 295 300

Arg Leu Ser Pro Phe Ile Asp Asp Glu Leu Gly Asp Ser Asp Val

305 310 315

His Met Val Tyr Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Lys Met Thr Ser

320 325 330

Thr Leu Pro Ser Leu Ser Glu Met Ala Gly Ser Met Gly His Ser

335 340 345

Gly Ser Glu Asn Val Met Glu Asn Leu Leu Asp Asn Leu Asn Leu

350 355 360

Leu Ser Pro Lys Asn Gln Ser Val Gly Pro Thr Gly Gly Pro Gly

365 370 375

Ser Gly Ser Asn Gln Ser Ser Pro Ser Ser Leu Met Gln Ala Ser

380 385 390

Pro Gly Tyr Ser Pro Tyr Ser Ser Pro Ser Leu Ala Ala Val Asn

395 400 405

Gln Gln Thr Gln Gln Asp Tyr Arg Lys Cys Leu Tyr Gly Gln Ala

410 415 420

Gly Met Gly Ser Met Ser Pro Met Pro Met Gln Ser Leu Pro Glu

425 430 435

Ser Lys Ser Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Thr Met Gly Gln Phe

440 445 450

Asn Cys Thr Ala Gly Leu Leu Lys Glu Leu Leu Thr Ser Asp Gly

455 460 465

Glu Pro Gly Glu Leu Leu Pro Ser Val Asp Thr Val Val Ser Gln

470 475 480

Ser Ala Gly Gly Gly Gly Cys Met Leu Pro Pro Tyr Ser Ser Gly

485 490 495

Arg Asn Glu Leu Met Gly Gly Gly Ala Ser His Ser His Ala Leu

515 520 525

Ser His Pro His Asn Met His Gly Gln Ala Pro Pro Thr Ser Val

530 535 540

Ala Leu Asn Gly Arg Ser Leu His Pro Leu Ala Ala Ile Gly His

500 505 510

Ser Gly Pro Gly Gly Arg Leu Gly Ser Ile Lys Ser Ala Met Gln

545 550 555

Met Gln Tyr Gly Gly Ser Gly His Leu Gly Gly Gly Ile Pro Tyr

560 565 570

Cys Ser Ile Asn Ser Asn Gly Tyr Gly Arg Ser Pro Gly Met Leu

575 580 585

Pro His Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Lys Leu Pro Ser Asp Leu

590 595 600

Asp Gly Met Pro Val Glu Arg Phe Glu Cys Asp Val Glu Ser Ile

605 610 615

Leu His Asp Thr Leu Met Asp Gly Glu Ser Leu Asp Phe Asn Phe

620 625 630

Asp Pro Met Ala Thr Gln Gln Gly Phe Pro Pro His Ser Val Lys

635 640 645

Thr Thr Thr His Ser Trp Val Ser Gly

650 654

Claims (9)

1.一种草鱼FoxO1多肽抗原，其特征在于：所述草鱼FoxO1多肽抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的草鱼FoxO1多肽抗原，其特征在于：所述草鱼FoxO1多肽抗原具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.一种抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体，其特征在于：所述抗体特异性地与草鱼FoxO1多肽抗原结合；所述草鱼FoxO1多肽抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体，其特征在于：所述抗体为与草鱼FoxO1多肽抗原特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体。

5.一种抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将草鱼FoxO1多肽抗原免疫动物；

2）取动物的抗血清，纯化后得到所述抗体。

6.根据权利要求5所述的抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将草鱼FoxO1多肽抗原与载体蛋白偶联，并与佐剂一起免疫动物；

2）取动物的抗血清，过所述草鱼FoxO1多肽抗原偶联的亲和层析柱纯化，得到所述抗体。

7.根据权利要求6所述的抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体的制备方法，其特征在于：步骤1）中采用MBS作为交联剂将所述草鱼FoxO1多肽抗原与马来酰胺活化的匙孔血蓝蛋白偶联；所述草鱼FoxO1多肽抗原具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

8.如权利要求3所述的抗草鱼FoxO1多肽抗原的抗体在检测草鱼组织中FoxO1全长功能蛋白质表达水平方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗体在检测草鱼肝脏、肌肉、脂肪组织中FoxO1全长功能蛋白质表达水平方面的应用。