CN110982797B - 一种检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法及其产品与应用 - Google Patents

一种检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法及其产品与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法及其产品与应用，包括有PA和PB，其中：PA的氨基酸序列为VSPPSKKSETDTIKR；PB的的氨基酸序列为SHRRHHSNTGSLERD。本发明通过对FAD2蛋白的抗原表位进行分析预测预测，选取两段特征多肽PA和PB，经过多肽合成后，与钥孔血蓝蛋白(KLH)耦联，并采用混合抗原免疫法进行动物免疫，制备了出了油菜脂肪酸脱氢酶FAD2多克隆抗体，该抗体具有很高的灵敏性和特异性。本发明制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与FAD2蛋白发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，具有工业化生产的可行性。

Description

一种检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法及其产 品与应用
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法及其产品与应用。
背景技术
脂肪酸按照脂肪烃的饱和程度-双键的存在，可以分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。而不饱和脂肪酸以其还有双键的数目，又可以分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。菜籽油中最主要的单不饱和脂肪酸为油酸，天然油酸都是顺式结构(反式结构人体不能吸收)，对软化血管有一定效用，在人和动物的新陈代谢过程中也起着重要作用，但人体自身合成的油酸不能满足需要，要从食物中摄取，故食用油酸含量较高的食油有益健康。常见的多不饱和脂肪酸有α-亚麻酸(ALA)，γ-亚麻酸(GLA)，花生四烯酸(ARA)，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳六烯酸(DHA)等。其中，亚油酸(ω-3)和亚麻酸(ω-6)能降低血液胆固醇，预防动脉粥样硬化而倍受重视，更有研究发现，胆固醇必须与亚油酸结合后，才能在体内进行正常的运转和代谢。因人类与哺乳动物体内没有能从脂肪酸的甲基端数起的第三个碳(ω-3)和第六个碳(ω-6)上导入双键的脱氢酶，即缺乏从头合成亚麻酸的酶，这两种脂肪酸只有植物能够合成，作为必需脂肪酸的亚油酸必须从食物中获得。因此，作为油料来源的油菜，其油酸，亚油酸，亚麻酸含量的高低，与其产油的品质有着直接联系。
在植物中，脂肪酸生物合成的饱和产物硬脂酸在可溶性Δ9-18：0-ACP去饱和酶2的作用下，被转化为顺-Δ9-单不饱和脂肪酸油酸酯。膜去饱和酶随后将油酸转化为亚油酸(顺，顺-Δ9，12-十八碳二烯酸)和α-亚麻酸(全顺-Δ9，12,15-十八碳三烯酸)，它们是植物中最丰富的脂肪酸。多不饱和脂肪酸是由两个平行途径之一合成的，它们通常被称为位于质体和内质网中的原核和真核通路。脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturase 2,FAD2)，是由甘蓝型油菜五号染色体上的FAD2基因编码的蛋白质。该蛋白位于内质网上，拥有四个跨膜区。有研究表明，在植物中，油酸到亚油酸的转变，在内质网上主要是由FAD2完成，而亚油酸到亚麻酸的转变，则是由FAD3完成。在对拟南芥原生质体模型研究中发现，当FAD2和FAD3维持酶活性，行使功能时，多以同源二聚体以及异源二聚体的形式存在，其二聚体的比例与产物中亚油酸和亚麻酸的比例有直接关系。这种合成的产物，既是植物生理生化中至关重要的结构单位，又是人体所必须摄取的必须氨基酸，所以FAD2酶活性的高低直接决定了油料作物的油脂品质,同时对植物的抗冻和抗盐等逆境响应产生影响。
迄今为止，对于FAD2的监测，主要基于酶活力的变化，从分子生物学上看，并未能完全体现出基因表达水平的变化。从样本的提取来说，由于酶活力牵涉到蛋白活性和结构，对样本提取，保存，检测环境的要求相对来说比较严格。并且，脂肪酸脱氢酶活力的检测，主要是针对其产物变化来进行判断，对于不饱和脂肪酸的测定需要大型仪器和丰富的科研背景，不利于大量样本的采集和检测。
酶作为一种特殊功能性蛋白，其活性收到多种因素的调控，其活力变化只能说明该蛋白功能上的变化，由于蛋白质表达之后，还有修饰，组装，激活等一系列复杂的过程，酶活性的变化却不能完整的体现出基因在转录后调控中，蛋白表达的变化，为此出现了一种监控研究上的检测手段断层。其次，目前FAD2酶活力检测，主要以其底物经酶作用后，其产物的鉴定以及产物量的变化来作为酶活变化指征。该步骤繁琐，并需要特殊的仪器进行检测，且仪器的价值不菲，检测费和维护费用高。
抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。抗体独特的生物学活性使其在疾病的诊断、免疫防治及基础研究中发挥作重要作用。多克隆抗体主要从动物免疫血清、恢复期患者血清或免疫接种人群的血清中获得。多克隆抗体最大的优势即作用全面。
免疫酶联反应(Elisa)以及蛋白质印记技术(Western Blot)利用抗原和抗体特异性结合来定性定量检测复杂样品中某目的蛋白，具有灵敏度高、特异性好、操作简便和结果直观等优点。而多克隆抗体可识别多个抗原决定簇，相较于单克隆抗体，对于蛋白的识别能力更强。由于脂肪酸脱氢酶(FAD2)是属于跨膜蛋白，其天然蛋白的提取难度大，重组蛋白的制备也存在表达不量不足的特点，所以制备其多克隆抗体时，怎样选择结合抗原性和免疫原性的特征片段，并获得能具有多表位良好识别能力的多克隆抗体，是急需解决的问题。
用哺乳动物脂肪酸脱氢酶(FADS2)抗体检测样本脂肪酸脱氢酶含量的技术已经在动物样本检测中应用，由于动物和植物的脂肪酸脱氢酶的蛋白同源性差异大，所以不能直接用动物脂肪酸脱氢酶抗体检测油菜脂肪酸脱氢酶。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法及其产品与应用。
一种制备检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的抗原多肽，包括PA和PB PA的氨基酸序列为VSPPSKKSETDTIKR，如序列1所示；PB的的氨基酸序列为SHRRHHSNTGSLERD，如序列2所示。
一种采用抗原多肽制备检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的方法，包括以下步骤：
1)抗原的合成：合成抗原多肽PA和PB，然后分别将PA和PB偶联到具有强免疫原功能的KLH蛋白上，得到KLH-PA和KLH-PB，然后将KLH-PA和KLH-PB按照设定的比例混合，并用PBS稀释后，得到抗原溶液；
2)动物免疫：将步骤1)制备的抗原溶液对动物进行免疫使其产生多克隆抗体，然后采集动物的多抗血清，分离纯化后，即得多克隆抗体。
所述步骤1)中，KLH-PA和KLH-PB设定的质量比(MKLH-PA:MKLH-PB)为0.5～2；PBS稀释至抗原总浓度为0.5～5mg/mL。
所述步骤2)中，动物为兔、小鼠、大鼠、山羊中的一种，动物免疫需要定期多次注射抗原，确保抗体的产生；纯化方法为亲和层析纯化。
根据上述的制备方法制备得到多克隆抗体。
一种检测油菜脂肪酸脱氢酶的试剂盒，该试剂盒包含有多克隆抗体。
所述的多克隆抗体在检测植物中脂肪酸脱氢酶的应用。
本发明的有益效果：1)本发明通过对FAD2蛋白的抗原表位进行分析预测预测，选取两段特征多肽PA和PB，经过多肽合成后，与钥孔血蓝蛋白(KLH)耦联，并采用混合抗原免疫法进行动物免疫，制备了出了油菜脂肪酸脱氢酶FAD2多克隆抗体，该抗体具有很高的灵敏性和特异性。2)本发明制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与FAD2蛋白发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，具有工业化生产的可行性。3)本发明的抗体可对油菜在不同发育时期、不同生长条件下的表达情况进行分析研究，可以在一切与油菜脂肪酸脱氢酶作用相关的代谢机理研究中得到应用，为油菜脂肪酸脱氢酶的功能和作用机理的研究提供了检测与验证技术支持。4)目前检测油菜脂肪酸脱氢酶最好的现有技术，主要采取的是对其催化产物的鉴定，来检测其酶活力的变化，从而体现蛋白的变化；然而，酶蛋白活力主要跟酶的结构，修饰激活密切相关，单纯的采用酶活力的变化，并不能完全体现出蛋白表达的变化。本发明的抗体是一种特异性识别抗原的功能性蛋白，一般情况下，主要识别的是蛋白质的一级结构，也就是其具有抗原性的氨基酸序列；因而采用本发明的抗体来识别油菜脂肪酸脱氢酶，能准确的反应蛋白质的含量，而不会由于样本处理或保存条件不当，而引起结构变化造成酶活力变化。5)本发明采用的是混合特征多肽法免疫获得多克隆抗体，可识别多个已知抗原决定簇，既有空间结构的识别能力，又具有蛋白一级结构的识别能力。
附图说明
图1油菜脂肪酸脱氢酶(FAD2)多克隆抗体(10倍稀释)SDS-PAGE鉴定图。图2油菜脂肪酸脱氢酶(FAD2)多克隆抗体与宁油16蛋白提取物WB结果图；(a)BnFAD2多克隆抗体对WT油菜果荚内质网和叶片内质网蛋白中FAD2的识别结果；(b)BnFAD2多克隆抗体对WT油菜果荚总蛋白中FAD2的识别结果。
具体实施方式
下面将结合实例对本发明的技术方案进行详细描述。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为对本发明进行限制。实施例中未注明的具体技术或者条件，均按照本领域内的文献所记载或本领域常规技术手段进行操作。
实施例一：序列分析以及候选抗原表位的预测
在UniProtKB数据库中搜索关键词：BnFAD2，得到油菜FAD2蛋白序列信息。
ABCpred Prediction Server在线软件，分析BnFAD2(UniProtKB：C3W518)氨基酸B细胞抗原表位，将预测表位阵列得分超过0.9的序列，输入NCBI数据库中，与油菜蛋白库进行氨基酸比对，验证氨基酸表位序列的特异性，即与油菜蛋白数据库中其他蛋白质无连续5个或5个以上氨基酸序列同源的情况。选取得分以及特异性最高的两条多肽序列PA(氨基酸序列如序列1所示)和PB(氨基酸序列如2所示)进行多肽合成，合成好的多肽分别偶联到KLH；得到偶联后的多肽KLH-PA和KLH-PB；合成好的多肽分别与BSA偶联；得到偶联后的多肽BSA-PA和BSA-PB。
将偶联后的多肽KLH-PA和KLH-PB，按质量比1：1的比例进行混合，作为油菜脂肪酸脱氢酶(FAD2)多克隆抗体的专用抗原。
实施例二：多克隆抗体血清的制备
免疫动物选择年龄在三个月左右、体重2.5kg左右，健康的雄性新西兰大白兔，以实施例1中制备的专用抗原，进行动物免疫。具体步骤如下：
首次免疫前，经耳静脉取血作为阴性对照。将抗原用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)稀释至1mg/mL，分装后储存于-20℃。取500μL的1mg/mL抗原(即0.5mg。加入300μL PBS再次稀释，然后加入等体积的弗氏完全佐剂(首次免疫)或弗氏不完全佐剂(第二次至第四次免疫)，并在涡旋仪上混匀和乳化。对兔子进行四肢、腋下及背部皮下多点注射，首次免疫三周后进行第二次免疫，以后每间隔两周加强一次(共进行4次免疫)。第三次免疫7天后，经耳静脉取血测定抗体效价(用实施例1中偶联了BSA的多肽BSA-PA和BSA-PB为检测抗原)。达到要求者，于第四次免疫11天后颈动脉放血，收集血样。将血样静置于4℃过夜或者37℃温育3h，在4℃条件下，5000rpm离心10min，收集血清，分装后-80℃保存。
实施例三：油菜脂肪酸脱氢酶(FAD2)多克隆抗体的制备
硫酸铵沉淀法浓缩蛋白样品：将20mL的血清用TBS缓冲溶液稀释到100mL，然后边搅拌该溶液中边加入饱和硫酸铵溶液，直至硫酸铵溶液浓度达到50-60％，4℃条件下，使用磁力搅拌器搅拌过夜。第二天将含有大量沉淀的溶液进行离心处理，弃上清，保留沉淀。加入10mL含有叠氮钠的PBS缓冲溶液溶解沉淀，用透析袋进行透析处理(每隔4小时换一次透析液，共换液六次)，以便去除硫酸铵。透析后，对透析袋中的溶液进行离心处理，收集上清。
亲和层析纯化抗多肽抗体：将上述透析离心后的蛋白溶液以0.5mL/min的速度加入层析柱(protein A FF)内，为保证抗体蛋白与填料的充分结合，需连续上柱两次。用TBS清洗层析柱至洗脱液的A280nm＜0.008后，用洗脱缓冲液(50mM甘氨酸，pH2.7)以相同的速度洗脱，用事先加入中和缓冲液(1M Tris-HCl,pH8.0,1.5M NaCl，1mM EDTA)的离心管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查溶液的pH，如果pH低于7.4，可用中和缓冲液调至约pH7.4，以防止抗体变性，同时检测抗体的浓度，最后加入等体积的甘油，保存在-20℃条件下，即得纯化好的多克隆抗体。
对制备的多克隆抗体进行SDS-PAGE测试，其结果如图1所示，经检测纯化抗体的最高浓度为4.5mg/mL，20mL血清共纯化出26.5mg抗体，得率较高。
实施例四：油菜脂肪酸脱氢酶(FAD2)的特异性检验
取速冻于液氮后，保存于-80℃的甘蓝型油菜品种(WT)果荚，以及成熟叶片为样本。
每个样本2g，液氮研磨成粉末状后，加入30mL体积的预冷的研磨缓冲液(240mmol/L Hepes·NaOH pH7.5,60mmol/L KCl，250mmol/L sucrose，24mmol/L MgCl2，用前现加入：6mmol/L DTT,6mmol/L PMSF)，研磨直至研磨液内不再有肉眼可见的组织碎片；4℃、1000g离心5min，保留上清、丢弃沉淀；4℃、2000g离心，保留2mL上清样品，剩下的上清加入到超离管(Beckman)中，将5mL50％蔗糖溶液缓慢加到超离管的底部，配平后，使用Beckman超速离心机(Optima XPN-100Ultracentrifuge)，4℃、100000g离心20min。离心后吸出富集在50％蔗糖溶液和研磨液之间的一层总膜，加入等体积的预冷的内质网分离缓冲液(40mmol/LHepes·NaOH pH7.5,10mmol/L KCl，4mmol/L MgCl2，5mmol/L EDTA,用前现加入：1mmol/LDTT,1mmol/L PMSF)，混匀；缓慢地用枪头将分离的总膜溶液加到的蔗糖溶液的上方，蔗糖梯度为7mL 15％蔗糖溶液，12mL 35％蔗糖溶液和5mL 40％蔗糖溶液，在4℃，100000g离心30min,用枪头吸出富集在35％蔗糖与40％蔗糖溶液之间的一层粗面内质网膜组分；将多次收集的粗面内质网合并，加入3倍体积的预冷的内质网分离缓冲液，混匀，配平；在4℃、100000g离心30min，取出超离管，丢弃上清溶液，用少量预冷的内质网分离缓冲液悬浮沉淀的粗面内质网膜组分；液氮速冻后于-80℃冰箱保存。
提取的油菜总蛋白，将总蛋白以及内质网蛋白分别进行SDS-PAGE电泳分离，上样量为30μg。将分离好的蛋白质经槽式转印系统快速转印(高电场强度)至硝酸纤维素膜上，转印结束后用封闭液(含5％脱脂奶粉的TBS[20mM Tris–HCl，pH7.5，500mM NaCl])在室温下封闭硝酸纤维素膜1-2h。使用实施例三中制备的多克隆抗，用含有0.05％Tween-20的封闭液以1:1000的比例稀释后，与封闭好的膜在37℃下孵育1h，TTBS(20mM Tris–HCl，pH7.5，500mM NaCl，0.05％Tween-20)洗膜5次，每次10min，用含有0.05％Tween-20的封闭液以1:30000的比例稀释HRP标记的山羊抗兔二抗(ABCAM，ab6721)，与洗好的膜在37℃下孵育1h，TTBS洗膜5次，每次10min。将膜用滤纸吸干，放入仪器，加入发光液(Thermo Pierce化学发ECL光底物，NCI4106)，机器曝光，保存图片。结果如图2所示，抗体在经1:1000稀释后，仍能检测到不同部位样本中的FAD2,说明制备的抗体效价较高、亲和力强，且主带分子量为95kD，与文献中描述FAD2以多聚体形式存在时的分子量一致，具有很高的特异性。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 一种检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法及其产品与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser Glu Thr Asp Thr Ile Lys Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
Ser His Arg Arg His His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp
1 5 10 15

Claims (5)

1.一种制备检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的方法，包括以下步骤：
1）抗原的合成：合成抗原多肽PA和PB，然后分别将PA和PB偶联到具有强免疫原功能的KLH蛋白上，得到KLH-PA和KLH-PB，然后将KLH-PA和KLH-PB按照1:1比例混合，并用PBS稀释至抗原总浓度为0.5~5mg/mL，得到抗原溶液；
其中：PA的氨基酸序列为VSPPSKKSETDTIKR，如序列1所示；PB的氨基酸序列为SHRRHHSNTGSLERD，如序列2所示；
2）动物免疫：将步骤1）制备的抗原溶液对新西兰大白兔进行免疫，使其产生多克隆抗体，然后采集动物的多抗血清，分离纯化后，即得多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备检测油菜脂肪酸脱氢酶的多克隆抗体的方法，其特征在于，所述步骤2）中，免疫需要定期多次注射抗原，确保抗体的产生；纯化方法为亲和层析纯化。
3.一种根据权利要求1或2所述的制备方法制备得到的多克隆抗体。
4.一种检测油菜脂肪酸脱氢酶的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求3所述的多克隆抗体。
5.一种权利要求3所述多克隆抗体在检测植物中脂肪酸脱氢酶的应用。
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