CN107973853B - 一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法及其应用，所述特征多肽是由SEQ ID NO：1氨基酸序列组成；SEQ ID NO 1：WLDKVLTQMGSPSVR。利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体，包括以下步骤：S1：用所述特征多肽与KLH偶联作为免疫抗原，用所述特征多肽与BSA偶联作为检测抗原；S2：用PBS将免疫抗原与检测抗原分别稀释为1mg/ml，分装冷冻于‑20℃冷藏；S3：分别用所述免疫抗原与检测抗原免疫动物；S4：采集被免疫动物的静脉血，离心收集上清；S5：抗体纯化；S6：Elisa法确定抗体效价；将所述特异性述抗体用Westernblot法检测猪骨骼肌细胞中Smad2蛋白的表达，进而判定猪背最长肌的肌肉含量，并可将其应用于猪肉质风味方面的选育过程中的辅助选择，在猪种质利用方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体是涉及一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法及其应用。
背景技术
随着人们的生活水平的提高，消费者对猪肉品质的要求越来越高，如何在不降低生长速度的同时维持一个合适的肌内脂水平从而改良肉质已成为当前猪育种工作中的研究热点和难点。肌内脂肪含量是评定肉质优劣的一项尤其重要的指标，肉的风味、多汁性及嫩度随着肌内脂肪含量的增加而改善。
肌肉生长发育受多种因子在时间和空间上的精密调控，MSTN/Smad信号通路在哺乳动物胚胎发育期以及出生后肌肉的生长发育过程中具有重要的调节作用。MSTN主要通过和其受体ActRIIB结合，激活Smad2、Smad3蛋白后，结合Smad4形成异源复合物，进入细胞核作用于靶基因MyoD，从而抑制肌肉的生长发育；Smad2是MSTN的拮抗剂，通过结合MSTN解除其抑制肌肉生长发育的功能。
通过验检测MSTN/Smad信号通路关键基因在两猪骨骼肌中的发育性表达变化，探讨部分基因表达的相关性，为开展猪种质利用具有重要意义。为了检测Smad2在骨骼肌生长发育过程中的表达，本发明利用合成多肽制备出能够与Smad2特异性结合的抗体，采用Western-blot技术检测了Smad2蛋白在猪背最长肌中的发育性表达，可将其应用于猪的肉质风味方面的选育过程中的辅助选择，以为改善猪肉的肉质提供理论依据。
发明内容
本发明解决的技术问题是：本发明旨在提供一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法及其应用，将所制备的特异性抗体采用Western-blot技术检测Smad2蛋白在猪背最长肌中的发育性表达。
本发明的技术方案是：
一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法，所述特征多肽是由SEQ IDNO：1氨基酸序列组成；所述制备方法包括以下步骤：
S1：用所述特征多肽与KLH偶联作为免疫抗原，用所述特征多肽与BSA偶联作为检测抗原；
S2：用PBS将免疫抗原与检测抗原分别稀释为1mg/ml，分装冷冻于-20℃冷藏；
S3：分别用所述免疫抗原与检测抗原免疫动物；
S4：采集被免疫动物的静脉血，4℃放置过夜，4℃、10000rmp离心30min，收集上清；
S5：抗体纯化
(1)将所述特征多肽连接到活化的Sulfolink Resin上，制备抗原亲和柱，1mlSulfolink Resin偶联1mg多肽；
(2)亲和柱用10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；兔血清经0.45um滤膜过滤；
(3)血清过抗原亲和柱，流尽溶液，收集流穿；
(4)10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；
(5)加入5ml抗体洗脱液，分管收集洗脱液，每管1ml；
(6)收集的洗脱液检测280mm处的吸光度，吸光度大于1.0的组分合并，对PBS透析；
S6：Elisa法确定抗体效价；
SEQ ID NO 1：WLDKVLTQMGSPSVR。
进一步地，在上述方案中，步骤S3中用所述免疫抗原与检测抗原免疫动物的具体操作为：
第1天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
第15天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
第29天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
第43天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔。
进一步地，在上述方案中，所述Elisa法确定抗体效价的具体操作为：
(1)包被：将包被抗原用CBS稀释为1ug/ml，加入酶标板中，每孔100ul，4℃过夜；
(2)密封：将包被液弃去，每孔加入200ul封闭液，37℃放置1.5小时；
(3)加入样本：弃去封闭液，加入样品，每孔100ul加入酶标板，37℃放置1小时；
(4)洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；
(5)加入二抗：酶标羊抗兔用封闭液稀释至工作浓度，每孔100ul加入酶标板，37℃放置30分钟；
(6)用自来水冲洗10次，拍干；
(7)加入TMB显色底物：每孔100ul加入酶标板，37℃放置15分钟；
(8)加入终止液：每孔加入2M H2SO4 50ul；
(9)读数：酶标仪0D450nm读数。
本发明还提供了一种上述方法制备的特异性抗体的应用，将所述特异性抗体应用于检测猪骨骼肌细胞中Smad2蛋白的表达。
进一步地，所述特异性抗体在制备检测猪骨骼肌细胞中Smad2蛋白的表达的检测试剂中的应用。
更进一步地，所述猪骨骼肌为猪背最长肌。
进一步地，所述检测试剂适用于Westernblot法。
更进一步地，所述检测方法具体包括以下步骤：
(1)蛋白的提取：
从-80℃取出背最长肌组织，放于研钵中，加入液氮研磨成粉末状；取适量粉末于1.5ml的离心管中，称量并按照组织净重(g):裂解液(ml)＝1:10的比例，加入相应体积的裂解液，再加入PMSF，使其终浓度达到1mmol/L，然后置于冰上裂解3h，直到组织充分裂解；充分裂解后，在4℃，12000g离心10min，取上清液即为蛋白质提取样品，分装后置于-80℃保存备用；
(2)SDS-PAGE凝胶电泳：
A.玻璃板的清洗：用洗涤剂清洗玻璃板和梳子，之后用自来水、蒸馏水依次冲洗多次，放入烘箱烘干，玻璃板要清洗干净，以免影响制胶；
B.灌分离胶：玻璃板对齐后放入夹子中间，确保玻璃板底部平整，以免漏胶；夹好之后，准备灌胶，配制好浓缩胶，最后加入TEMED，摇匀后立刻灌胶，然后缓慢均匀地加酒精，目的是将浓缩胶压平；
C.灌浓缩胶：待水和胶之间出现折射线时，倒掉酒精并使酒精完全挥发，配制浓缩胶，然后在分离胶的上面灌满浓缩胶，缓慢垂直插入梳子；待到浓缩胶凝固以后，两手分别捏住梳子的两边垂直向上缓慢拔掉梳子，用水冲洗浓缩胶，放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，准备上样；
D.上样：计算含有50ng总蛋白质对应的加样体积，按照1:4体积比例加入5×SDS上样缓冲液后，混匀100℃水浴变性10min，恢复到常温后，进行上样；
E.电泳：浓缩胶80V 40min，分离胶100V直到溴酚蓝跑到最底部为止；
(3)转膜：
A.提前将转膜所需的滤纸和硝酸纤维素膜剪好放入水中，一般转一张膜需要6张滤纸，且膜要稍大于滤纸，转膜所用的架子和海绵浸泡于转膜缓冲液中大约2h才可使用；
B.电泳结束后，尽量在湿润的时候撬开玻璃板，切去浓缩胶，按照标准蛋白maker所指位置，切下目的和内参所在胶的区域；
C.将夹子打开，使黑面朝下放平，在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒赶走气泡，在海绵上放3层浸湿的滤纸，再按照胶-膜-滤纸的顺序铺好，并赶走气泡，夹好夹子，放入转移槽中，使得夹子的黑面对槽的黑面，转膜过程中会产热，所以在转膜槽的周围放入冰块来降温；
D.转膜电压为100V，时间为90min，转膜结束后将膜用丽春红染液染5min(于脱色摇床上摇)，待看到膜上的蛋白条带后，用TBST缓冲液进行脱色，接着进行后续；
(4)免疫反应：
A.封闭：将膜放入含有封闭液的培养皿中，脱色摇床上室温封闭2h，之后洗膜2次，每次5min；
B.一抗的孵育：将所述特异性抗体作为一抗，经过条件优化后，一抗按照1:3000稀释,内参基因GAPDH按照1:3000稀释，将膜放入抗体溶液中，摇床上室温孵育1.5h，一抗孵育结束后，用TBST在脱色摇床上洗3次，每次10min；
C.二抗的孵育：选择羊抗兔IgM作为二抗，按照1:3000稀释二抗，室温下孵育1.5h后，用TBST再次洗3次，最后放入TBST缓冲液中，用于进行化学发光反应；
(5)化学发光反应：将ECL化学发光试剂的A液和B液等体积混合，均匀地涂到硝酸纤维素膜上，放到凝胶成像系统的载物台上曝光；
(6)数据分析：应用Image Lab TM软件分析目标条带的分子量和净光密度值，之后计算目的基因的相对表达量，即目的基因的灰度值/内参基因的灰度值，结果用4次的平均数±标准误表示。
本发明的有益效果是：本发明利用合成的特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体，然后再利用该特异性抗体去检测猪背最长肌细胞中Smad2蛋白的表达情况，根据检测到的Smad2蛋白的表达情况来判定猪背最长肌的肌肉含量，为改善猪肉的肉质提供理论依据，并可将其应用于猪肉质风味方面的选育过程中的辅助选择，在猪种质利用方面具有重要意义。
具体实施方式
实施例1：
合成特征多肽：特征多肽是由SEQ ID NO：1氨基酸序列组成；SEQ ID NO 1：WLDKVLTQMGSPSVR。
利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体，包括以下步骤：
S1：用所述特征多肽与KLH偶联作为免疫抗原，用所述特征多肽与BSA偶联作为检测抗原；
S2：用PBS将免疫抗原与检测抗原分别稀释为1mg/ml，分装冷冻于-20℃冷藏；
S3：分别用所述免疫抗原与检测抗原免疫动物：具体操作为：
第1天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
第15天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
第29天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
第43天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
S4：采集被免疫动物的静脉血，4℃放置过夜，4℃、10000rmp离心30min，收集上清；
S5：抗体纯化；
(1)将所述特征多肽连接到活化的Sulfolink Resin上，制备抗原亲和柱，1mlSulfolink Resin偶联1mg多肽；
(2)亲和柱用10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；兔血清经0.45um滤膜过滤；
(3)血清过抗原亲和柱，流尽溶液，收集流穿；
(4)10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；
(6)加入5ml抗体洗脱液，分管收集洗脱液，每管1ml；
(8)收集的洗脱液检测280mm处的吸光度，吸光度大于1.0的组分合并，对PBS透析；
S6：Elisa法确定抗体效价；
(1)包被：将包被抗原用CBS稀释为1ug/ml，加入酶标板中，每孔100ul，4℃过夜；
(2)密封：将包被液弃去，每孔加入200ul封闭液，37℃放置1.5小时；
(3)加入样本：弃去封闭液，加入样品，每孔100ul加入酶标板，37℃放置1小时；
(4)洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；
(5)加入二抗：酶标羊抗兔用封闭液稀释至工作浓度，每孔100ul加入酶标板，37℃放置30分钟；
(6)用自来水冲洗10次，拍干；
(7)加入TMB显色底物：每孔100ul加入酶标板，37℃放置15分钟；
(8)加入终止液：每孔加入2M H2SO4 50ul；
(9)读数：酶标仪0D450nm读数。
最终得到568-2-R1抗体1.3ml，1.68mg/ml；568-2-R2抗体1.2ml，3.4mg/ml；结果如表1所示：
表1：制备得到的568-2-R1抗体和568-2-R2抗体
实施例2：
将实施例1制备的特异性抗体应用于检测猪骨骼肌细胞中Smad2蛋白的表达，将所述特异性抗体用于制备检测猪骨骼肌细胞中Smad2蛋白的表达的检测试剂，所述猪骨骼肌为猪背最长肌，检测试剂适用于Westernblot法。
检测方法具体包括以下步骤：
(1)蛋白的提取：
准备好研磨组织所需的器械(研钵、剪刀、镊子、酒精棉)，从-80℃取出猪背最长肌组织，放于研钵中，加入液氮研磨成粉末状；取适量粉末于1.5ml的离心管中，称量并按照组织净重(g):裂解液(ml)＝1:10的比例，加入相应体积的裂解液，再加入PMSF，使其终浓度达到1mmol/L，然后置于冰上裂解3h，直到组织充分裂解；充分裂解后，在4℃，12000g离心10min，取上清液即为蛋白质提取样品，分装后置于-80℃保存备用；
(2)SDS-PAGE凝胶电泳：
A.玻璃板的清洗：用洗涤剂清洗玻璃板和梳子，之后用自来水、蒸馏水依次冲洗多次，放入烘箱烘干，玻璃板要清洗干净，以免影响制胶；
B.灌分离胶：玻璃板对齐后放入夹子中间，确保玻璃板底部平整，以免漏胶；夹好之后，准备灌胶，按照表2配方配制浓缩胶，最后加入TEMED，摇匀后立刻灌胶，然后缓慢均匀地加酒精，目的是将浓缩胶压平；
C.灌浓缩胶：待水和胶之间出现折射线时，倒掉酒精并使酒精完全挥发，配制浓缩胶，然后在分离胶的上面灌满浓缩胶，缓慢垂直插入梳子；待到浓缩胶凝固以后，两手分别捏住梳子的两边垂直向上缓慢拔掉梳子，用水冲洗浓缩胶，放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，准备上样；
D.上样：计算含有50ng总蛋白质对应的加样体积，按照1:4体积比例加入5×SDS上样缓冲液后，混匀100℃水浴变性10min，恢复到常温后，进行上样；
E.电泳：浓缩胶80V 40min，分离胶100V直到溴酚蓝跑到最底部为止；
表2：聚丙烯酰胺凝胶分离胶(10％)和浓缩胶(5％)的配方
(3)转膜：
A.提前将转膜所需的滤纸和硝酸纤维素膜剪好放入水中，一般转一张膜需要6张滤纸，且膜要稍大于滤纸，转膜所用的架子和海绵浸泡于转膜缓冲液中大约2h才可使用；
B.电泳结束后，尽量在湿润的时候撬开玻璃板，切去浓缩胶，按照标准蛋白maker所指位置，切下目的和内参所在胶的区域；
C.将夹子打开，使黑面朝下放平，在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒赶走气泡，在海绵上放3层浸湿的滤纸，再按照胶-膜-滤纸的顺序铺好，并赶走气泡，夹好夹子，放入转移槽中，使得夹子的黑面对槽的黑面，转膜过程中会产热，所以在转膜槽的周围放入冰块来降温；
D.转膜电压为100V，时间为90min，转膜结束后将膜用丽春红染液染5min(于脱色摇床上摇)，待看到膜上的蛋白条带后，用TBST缓冲液进行脱色，接着进行后续；
(4)免疫反应：
A.封闭：将膜放入含有封闭液的培养皿中，脱色摇床上室温封闭2h，之后洗膜2次，每次5min；
B.一抗的孵育：将所述特异性抗体作为一抗，经过条件优化后，一抗按照1:3000稀释，内参基因GAPDH按照1:3000稀释，将膜放入抗体溶液中，摇床上室温孵育1.5h，一抗孵育结束后，用TBST在脱色摇床上洗3次，每次10min；
C.二抗的孵育：选择羊抗兔IgM作为二抗，按照1:3000稀释二抗，室温下孵育1.5h后，用TBST再次洗3次，最后放入TBST缓冲液中，用于进行化学发光反应；
(5)化学发光反应：将ECL化学发光试剂的A液和B液等体积混合，均匀地涂到硝酸纤维素膜上，放到凝胶成像系统的载物台上曝光；
(6)数据分析：应用Image Lab TM软件分析目标条带的分子量和净光密度值，之后计算目的基因的相对表达量，即目的基因的灰度值/内参基因的灰度值，结果用4次的平均数±标准误表示。
检测试验：
分别选择大白猪和马身猪背最长肌分别进行检测，检测结果显示，Smad2蛋白杂交条带清晰，特异性高。Smad2蛋白在大白猪和马身猪背最长肌中的发育性表达模式相一致，均是先增加后降低。大白猪在1日龄的表达量最低，极显著低于其它日龄(P<0.01)，30日龄的表达量最高，显著高于其它日龄(P<0.05)，之后出现表达下降趋势。马身猪表达趋势与大白猪相似，在1日龄时表达量最低，极显著低于其它日龄(P<0.01)，在60日龄后处于高水平表达，直到120日龄后表达出现下降趋势。两品种相比，1日龄时，两品种间没有显著差异；30日龄时大白猪Smad2蛋白的表达量极显著高于马身猪(P<0.01)；而在其它日龄，马身猪的表达量极显著高于大白猪(P<0.01)。
SEQUENCE LISTING
<110> 山西农业大学
<120> 一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法及其应用
<130> 无
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(15)
<400> 1
Trp Leu Asp Lys Val Leu Thr Gln Met Gly Ser Pro Ser Val Arg
1 5 10 15
Claims (8)
1.一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法，其特征在于，所述特征多肽是由SEQ ID NO：1氨基酸序列组成；所述制备方法包括以下步骤：
S1：用所述特征多肽与KLH偶联作为免疫抗原，用所述特征多肽与BSA偶联作为检测抗原；
S2：用PBS将免疫抗原与检测抗原分别稀释为1mg/ml，分装冷冻于-20℃冷藏；
S3：分别用所述免疫抗原与检测抗原免疫动物；
S4：采集被免疫动物的静脉血，4℃放置过夜，4℃、10000rmp离心30min，收集上清；
S5：抗体纯化
(1)将所述特征多肽连接到活化的Sulfolink Resin上，制备抗原亲和柱，1mlSulfolink Resin偶联1mg多肽；
(2)亲和柱用10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；兔血清经0.45 μ m 滤膜过滤；
(3)血清过抗原亲和柱，流尽溶液，收集流穿；
(4)10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；
(5)加入5ml抗体洗脱液，分管收集洗脱液，每管1ml；
(6)收集的洗脱液检测280mm处的吸光度，吸光度大于1.0的组分合并，对PBS透析；
S6：Elisa法确定抗体效价；
SEQ ID NO 1：WLDKVLTQMGSPSVR。
2.根据权利要求1所述的一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法，其特征在于，步骤S3中用所述免疫抗原与检测抗原免疫动物的具体操作为：
第1天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
第15天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
第29天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
第43天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔。
3.一种如权利要求1所述方法制备的特异性抗体的应用，其特征在于，将所述特异性抗体应用于检测猪骨骼肌细胞中Smad2蛋白的表达。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性抗体在制备检测猪骨骼肌细胞中Smad2蛋白的表达的检测试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述猪骨骼肌为猪背最长肌。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述猪骨骼肌为猪背最长肌。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测试剂适用于Westernblot法。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：
(1)蛋白的提取：取猪背最长肌组织，研磨，裂解，离心，取离心后的上清液即为蛋白质提取样品，置于-80℃保存备用；
(2)SDS-PAGE凝胶电泳：计算含有50ng总蛋白质对应的加样体积，按照1:4体积比例加入5×SDS上样缓冲液后，混匀100℃水浴变性10min，恢复到常温后，进行上样；浓缩胶80V40min，分离胶100V直到溴酚蓝跑到最底部为止；
(3)转膜：按照标准蛋白maker所指位置，切下目的和内参所在胶的区域，进行转膜，转膜电压为100V，时间为90min，转膜结束后将膜用染液染5min，待看到膜上的蛋白条带后，用TBST缓冲液进行脱色；
(4)免疫反应：
A.封闭：将膜放入含有封闭液的培养皿中，脱色摇床上室温封闭2h，之后洗膜2次，每次5min；
B.一抗的孵育：将所述特异性抗体作为一抗，经过条件优化后，按照1:3000稀释，内参基因GAPDH按照1:3000稀释，将膜放入抗体溶液中，摇床上室温孵育1.5h，一抗孵育结束后，用TBST在脱色摇床上洗3次，每次10min；
C.二抗的孵育：选择羊抗兔IgM作为二抗，按照1:3000稀释二抗，室温下孵育1.5h后，用TBST再次洗3次，最后放入TBST缓冲液中，用于进行化学发光反应；
(5)化学发光反应：将ECL化学发光试剂的A液和B液等体积混合，均匀地涂到硝酸纤维素膜上，放到凝胶成像系统的载物台上曝光；
(6)数据分析：应用Image Lab TM软件分析目标条带的分子量和净光密度值，之后计算目的蛋白的相对表达量，即目的基因的灰度值/内参基因的灰度值，结果用4次的平均数±标准误表示。
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