CN114262376A

CN114262376A - 长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114262376A
Application number: CN202210200379.5A
Authority: CN
Inventors: 刘士凯; 李永婧; 李琪
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2022-03-03
Filing date: 2022-03-03
Publication date: 2022-04-01

Abstract

本发明提供了长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体及其制备方法和应用，属于海洋生物技术领域。长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体，为anti‑ILP，anti‑MIRP3，anti‑MIRP3‑like，anti‑ILP7，其对应的抗原表位分别为：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。本发明通过构建重组表达质粒，诱导表达重组蛋白，将重组蛋白作为抗原免疫小鼠，进而获得特异的针对长牡蛎四种胰岛素样肽的多克隆抗体。本发明提供的长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体具有特异性强，灵敏度高等优点，可满足免疫组化、免疫印迹、激光共聚焦等实验要求。

Description

长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体，以及该多克隆抗体的制备方法和用途。

背景技术

脊椎动物的生长是由下丘脑-垂体组成的生长轴起核心调控作用。在下丘脑生长激素释放激素（growth hormone releasing factor, GHRH）和生长抑素（somatostatin,SS）的双重作用下，由垂体生长激素分泌细胞（Somatotropes）分泌生长激素（growthhormone, GH）。GH由循环系统到达肝脏，诱导胰岛素（insulin）和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor, IGF）的表达。Insulin/IGF分别与各自的靶细胞表面受体结合，介导GH的生长调节作用。但是，在牡蛎等无脊椎动物中，没有脑和垂体等结构，它们的生长是如何被调控的，迄今为止，在无脊椎动物中并未发现任何与脊椎动物同源的GH及其受体基因，以及GH相关的调控因子，但发现了胰岛素样肽，胰岛素样肽受体及其结合蛋白等，它们在无脊椎动物的生长调节，能量稳态中发挥了重要的作用。在前期的研究中，我们通过广泛的多组学数据挖掘，在长牡蛎基因组中发现了四种胰岛素样肽基因，包括ILP、MIRP3、MIRP3-like和ILP7。研究发现它们主要在神经丰富的组织以及营养物质消化吸收相关的组织中表达，并且其表达水平与长牡蛎的生长速度呈正相关。除此之外，在食物缺乏、低温等不适于生长的环境条件下，这四种胰岛素样肽基因的表达均受到不同程度的影响，表明胰岛素样肽作为一种重要的神经肽在长牡蛎的生长中发挥了重要的作用。神经肽是神经元分泌的细胞间信号分子，常作为激素、神经递质和调制器发挥作用，它们作为神经元活动的调节因子，在调节生长、新陈代谢、生殖等各种生理过程中起着关键作用。在软体动物中，胰岛素样肽的分泌与调控机制尚不明确。要研究这一问题，首先需要对长牡蛎胰岛素样肽蛋白进行准确的定位。然而，目前市面上只有针对高等动物的胰岛素特异性抗体，由于种属差异性，此类抗体对软体动物胰岛素样肽不具有特异性，不能准确识别长牡蛎胰岛素样肽蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体及其制备方法，本发明的另一目的在于长牡蛎四种胰岛素样肽特异性多克隆抗体（anti-ILP，anti-MIRP3，anti-MIRP3-like，anti-ILP7）的具体应用。

为了上述目的，本发明采取的具体技术方案为：

长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体由pET32a-ILP，pET32a-MIRP3，pET32a-MIRP3-like，pET32a-ILP7重组质粒诱导表达的抗原蛋白免疫小鼠获得。

用于制备长牡蛎四种胰岛素样肽抗体的抗原表位，所述四种胰岛素样肽抗体为anti-ILP，anti-MIRP3，anti-MIRP3-like，anti-ILP7，其对应的抗原表位分别为：SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，上述氨基酸序列的表达质粒后，经诱导表达、纯化获得抗原蛋白。

含有上述抗原多肽编码基因的生物材料，所述生物材料为表达质粒与宿主菌，所述表达质粒为pET32a-ILP，pET32a-MIRP3，pET32a-MIRP3-like，pET32a-ILP7，宿主菌为包含上述重组质粒的BL21（DE3）表达菌株。

所述四种胰岛素样肽蛋白多克隆抗体的制备方法，包含以下步骤：

S1. 预测四种胰岛素样肽的信号肽，去除信号肽序列后，再分析四种胰岛素样肽剩余氨基酸序列的抗原性；

S2. 构建重组质粒：分别针对各胰岛素样肽，设计一对特异性引物以扩增抗原片段，将扩增后的抗原片段与原核表达载体pET32a进行连接，分别构建pET32a-ILP，pET32a-MIRP3，pET32a-MIRP3-like，pET32a-ILP7重组质粒；

S3. 将上述四种重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，对重组蛋白进行纯化；

S4. 将重组蛋白进行乳化后，对小鼠采用皮下注射，并进行四次免疫；

S5. 收集、分离得到含有抗体的小鼠血清，采用抗原亲和层析方法纯化血清，即得到四种胰岛素样肽蛋白多克隆抗体。

上述四种胰岛素样肽蛋白多克隆抗体能够用于长牡蛎胰岛素样肽分泌细胞的定位，及长牡蛎神经内分泌调控网络的构建。

本发明的优点和有益效果：

本发明通过构建重组表达质粒，诱导表达重组蛋白，将重组蛋白作为抗原免疫小鼠，进而获得特异的针对长牡蛎四种胰岛素样肽的多克隆抗体。本发明提供的长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体具有特异性强，灵敏度高等优点，可满足免疫组化、免疫印迹、激光共聚焦等实验要求。

本发明为建立体外免疫分析、研究长牡蛎胰岛素样肽的生理功能提供了基础。本发明在长牡蛎胰岛素样肽蛋白的表达与定位中具有重要的应用前景，也为揭示长牡蛎胰岛素样肽分泌细胞与其它神经神经递质分泌细胞之间的空间位置关系提供技术支持，为构建长牡蛎神经内分泌调控网络奠定了基础。

附图说明

图1为长牡蛎四种胰岛素样肽重组蛋白诱导表达及纯化结果。

图2为长牡蛎四种胰岛素样肽重组蛋白特异性His单抗验证结果。

图3为长牡蛎四种胰岛素样肽抗体Western blot特异性检测结果。

图4为长牡蛎四种胰岛素样肽在各组织的免疫组化分析结果。

图5为长牡蛎四种胰岛素样肽与5-羟色胺（5-HT）在神经节中共定位结果。

图6为长牡蛎四种胰岛素样肽与多巴胺在神经节中共定位结果。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

四种胰岛素样肽蛋白多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1. 利用SignalP5.0在线网站预测四种胰岛素样肽的信号肽，去除信号肽序列后，用DNAstar软件分析四种胰岛素样肽剩余氨基酸序列的抗原性。

S2. 重组质粒的构建：针对各胰岛素样肽，分别设计特异性引物anti-ILP-F（SEQID NO：5），anti-ILP-R（SEQ ID NO：6），anti-MIRP3-F（SEQ ID NO：7），anti-MIRP3-R（SEQID NO：8），anti-MIRP3-like-F（SEQ ID NO：9），anti-MIRP3-like-R（SEQ ID NO：10），anti-ILP7-F（SEQ ID NO：11），anti-ILP7-R（SEQ ID NO：12），以扩增对应抗原片段，将扩增后的抗原片段与原核表达载体pET32a进行连接，分别构建pET32a-ILP，pET32a-MIRP3，pET32a-MIRP3-like，pET32a-ILP7重组质粒；

S3. 重组蛋白的表达与纯化：将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，按照His TrapTM HP（GE Healthcare）说明书对重组蛋白进行纯化，诱导表达与纯化结果如图1所示。图1中A为ILP，MIRP3重组蛋白的诱导纯化结果。图1中B为MIRP3-like与ILP7重组蛋白的诱导纯化结果。结果表明长牡蛎胰岛素样肽重组蛋白纯化后均为单一条带；

S4. 将重组蛋白进行乳化后，对小鼠采用皮下注射，并进行四次免疫；取1 mg免疫原溶解在500 µL 0.01 mol/L PBS中与500 µL弗氏完全佐剂（后面加强免疫时采用不完全弗氏佐剂）等体积混合，乳化（一滴乳化液在水面上呈现球形而不散开则表示乳化充分）；乳化完成的重组蛋白作为抗原对小鼠进行四次免疫，采用皮下注射；末次免疫一周左右，断尾取血，收集鼠抗血清，于4℃静置1 h后3500 g离心，收集上清，利用ELISA对血清中的抗体效价进行检测，检测达标后，通过眼眶后静脉丛取血收集免疫血清储存于-80℃备用。

S5. 收集、分离得到含有抗体的小鼠血清，采用抗原亲和层析方法纯化血清，即得到抗体。

实施例2

长牡蛎四种胰岛素样肽重组蛋白特异性His单抗验证

为了对纯化所获得的重组蛋白特异性进行验证，将纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳（分离胶80V 40 min，浓缩胶120V 120 min），将目的蛋白转到PVDF膜上；5%的脱脂奶粉将PVDF于37℃封闭2h或者4℃过夜；TBST缓冲液于摇床上清洗膜3次；His单抗（1:1000稀释）于摇床37℃振荡孵育1 h；TBST缓冲液于摇床上清洗膜3次；随后，二抗孵育（1:1000倍稀释），TBST缓冲液于摇床上清洗膜3次；将ECL化学发光液淋于膜上，利用化学发光凝胶成像仪进行曝光显色。检测抗体特异性。分析结果如图2所示，纯化后的ILP，MIRP3，MIRP3-like，ILP7蛋白均在目标大小处呈现单一条带，说明经原核表达、诱导纯化后获得的重组蛋白大小正确，且特异性较好，可作为抗原进行后续动物免疫。

实施例3

多克隆抗体的效价测定

为了对所获得的多克隆抗体的效价进行测定，以实施例1中多克隆抗体的制备步骤中第一次免疫前小鼠血清为阴性对照，最后一次免疫后收集的血清在1:1000至1:1000000倍之间稀释作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，以TMB作为显色液，以免疫后血清样品OD 450nm值与阴性对照血清OD 450nm值的比值≥2时作为判定标准，以制备的抗体最大稀释度作为该抗体的有效效价。检测结果如表1所示。结果表明，所获得的小鼠血清中抗体均具有较好的特异性，其中，anti-ILP的抗体效价为1:5x10⁵，anti-MIRP3的抗体效价为1:10⁶，anti-MIRP3-like的抗体效价为1:5x10⁵，anti-ILP7的抗体效价为1:5x10⁵。

表1. 四种胰岛素样肽鼠抗血清的效价测定

实施例4

长牡蛎四种多抗的特异性验证

提取长牡蛎闭壳肌、消化腺、头神经节以及脏神经节总蛋白，进行SDS-PAGE电泳（分离胶80V 40 min，浓缩胶120V 120 min），将目的蛋白转到PVDF膜上；5%的脱脂奶粉将PVDF于37℃封闭2h或者4℃过夜；TBST缓冲液于摇床上清洗膜3次；鼠抗血清（1:1000稀释）于摇床37℃振荡孵育1 h；TBST缓冲液于摇床上清洗膜3次；随后，二抗孵育（1:1000倍稀释），TBST缓冲液于摇床上清洗膜3次；将ECL化学发光液淋于膜上，利用化学发光凝胶成像仪进行曝光显色。检测抗体特异性。分析结果如图3所示，所制备的长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体在长牡蛎闭壳肌、消化腺、头神经节、脏神经节中均可识别单一条带，证明这四个抗体均具有较好的特异性，可用于后续长牡蛎体内胰岛素样肽的定量与定位。

实施例5

长牡蛎胰岛素样肽蛋白的免疫组化分析：

采用石蜡包埋法包埋6月龄长牡蛎整个软体部，以5 μm厚度进行切片；常规脱蜡后，用3%的H₂O₂于37℃孵育10 min，阻断内源过氧化物酶；将用5%牛血清蛋白进行封闭后加入500倍稀释的免疫后小鼠血清37℃温育1 h，用PBS洗涤5次，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育30 min，DAB显色；苏木精复染、脱水透明及树胶封片。分析结果如图4所示。由免疫组化分析结果可知，长牡蛎中四种胰岛素样肽在神经节、消化盲囊、胃以及闭壳肌中均出现特异的阳性信号，且主要分布在神经节与消化盲囊，除此之外，也暗示了胰岛素样肽分泌细胞主要分布于神经节与消化盲囊。

实施例6

长牡蛎胰岛素样肽与多巴胺、5-羟色胺（5-HT）共定位

采用石蜡包埋长牡蛎神经节与闭壳肌组织，以5μm厚度进行切片；常规脱蜡后，用3%的H₂O₂于37℃孵育10 min，阻断内源过氧化物酶；将用5%牛血清蛋白进行封闭，分别加入anti-ILP（1:500）与anti-TH（1:1000）（多巴胺合成限速酶，常用作多巴胺表达细胞的标记基因），anti-ILP（1:500）与anti-5-HT（1:1000）混合物，4℃过夜避光孵育用PBS洗涤5次，加入Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)（1:500）与Alexa Fluor 647标记山羊抗兔IgG(H+L)（1:500）二抗混合物，37℃孵育1h，用PBS洗涤5次，激光共聚焦下观察结果并拍照（其它三种胰岛素样肽，MIRP3，MIRP3-like，ILP7，做法同ILP）。分析结果如图5，图6所示。其中，图5为长牡蛎四种胰岛素样肽与5-羟色胺在神经节中共定位结果；图6为长牡蛎四种胰岛素样肽与多巴胺在神经节中共定位结果。由共定位结果可知，长牡蛎中四种胰岛素样肽与5-羟色胺、多巴胺在神经均存在共定位，表明在神经节中，多巴胺、5-羟色胺这些神经递质与内分泌激素对胰岛素样肽的分泌存在调控作用，这为构建长牡蛎神经内分泌调控网络提供了基础。

上述结果表明，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

（1）本发明采用分子生物学和基因工程的方法，构建了长牡蛎四种胰岛素样肽的重组表达载体，诱导表达、亲和层析获得纯化的重组蛋白。

（2）本发明制备的长牡蛎四种胰岛素样肽的多克隆抗体具有很强的特异性，可用于免疫组化、免疫印记、激光共聚焦等实验要求，建立体外免疫分析，为深入研究长牡蛎胰岛素样肽在其生长中的生理功能提供了一个重要工具。

（3）本发明提供的长牡蛎四种胰岛素样肽重组蛋白可作用活性因子，开展一系列相关体外研究。

（4）本发明制备的长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体，为构建长牡蛎神经内分泌调节网络提供了实验基础。

本发明提供的长牡蛎四种胰岛素样肽重组蛋白可作用活性因子，开展一系列相关体外研究。本发明解决了目前市面上没有长牡蛎胰岛素样肽特异抗体的问题，为进一步探讨胰岛素样肽在长牡蛎生长中的关键作用提供了重要的技术支持。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 167

<212> PRT

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 1

Ser Gln Leu Gln Ala Cys Gly Ser Ala Leu Thr Asp Ile Leu Ser Leu

1 5 10 15

Val Cys Arg Asn Gln Phe His Ala Pro Ala Lys Arg Ile Asp Ala Pro

20 25 30

Met Val Asn Asp Ile Asp Glu Leu Ala Arg Tyr Lys Arg Ser Arg Gln

35 40 45

Phe Ala Val Ala Gln Lys Arg Gly Gly Val Val Glu Glu Cys Cys Phe

50 55 60

Ser Ser Cys Ser Tyr Glu Asn Leu Leu Leu Tyr Cys Ser Gln Ser Val

65 70 75 80

Asp Pro Leu Asp Val Phe Thr Ala Ala Arg Val Gly Ser Ser Ser Thr

85 90 95

Thr Thr Gln Arg Pro Ile Thr Thr Thr Ser Thr Pro Thr Ala Thr Thr

100 105 110

Thr Pro Leu Ser Val Leu Thr Val Thr Gly His Lys Pro Glu Asp Gln

115 120 125

Ala Glu Leu Asp Glu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Trp Ala Leu Ser

130 135 140

Arg Arg Trp Phe Tyr Val Asn Arg Leu Gly Arg Phe Arg Gly Gln Val

145 150 155 160

Gly Arg Arg Ile Ile Asn Met

165

<210> 2

<211> 143

<212> PRT

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 2

Ser Asp Phe Glu Arg Val Cys Asn Ser Gln Thr Asp Leu Arg Gly Pro

1 5 10 15

Asp Pro Gln Gly Ile Cys Gly Arg Leu Ile Pro Glu Met Leu His Leu

20 25 30

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35 40 45

Leu Ser His His Lys Gln Asp Arg Asn Val Asp Phe Pro Arg Tyr Ser

50 55 60

Pro Leu Glu Gly Leu Ile Leu Gly Lys Arg Glu Ala Ser Met Tyr Leu

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Cys Gly Phe Arg Lys Lys Arg Asn Thr Glu Pro Asp Ser Ile Ser Ala

115 120 125

Ser Ser Gln Asn Ser Gly Lys Leu Ile Asp Ser Val Leu Asn Lys

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<210> 3

<211> 138

<212> PRT

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 3

Gly Phe Glu Lys Val Cys Thr Phe Glu Thr Tyr Arg Arg Gly Val His

1 5 10 15

Gln Gln Gly Ala Cys Gly Asp Asn Leu Ala Asp Met Leu Arg Leu Val

20 25 30

Cys Arg Lys Tyr Lys Arg Ser Gly Gly Thr Arg Pro Gly Lys Thr Tyr

35 40 45

Asp Val Leu Lys Arg Ala Asn Phe Thr Ala Gly Gly Leu Ser Pro Pro

50 55 60

Gln Ile Gln Ala Arg Ser Ala Pro Trp Lys Ser Val Leu Lys Arg Met

65 70 75 80

Met Val Ser Lys Glu Lys Ala Leu Ala Phe Ile Ala Asn Asn Leu Asp

85 90 95

Phe His Arg Arg Lys Lys Lys Gly Ser Pro Tyr Asn Leu Asp Lys Arg

100 105 110

Tyr Gly Asp Ile Asn Ile Val Cys Glu Cys Cys Tyr His Ser Cys Ser

115 120 125

Val Ala Glu Phe Glu Asp Tyr Cys Ala Glu

130 135

<210> 4

<211> 137

<212> PRT

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 4

Ala Ile His Tyr Gln Ser Tyr Asn Pro Val Phe Leu Gln Arg Thr Glu

1 5 10 15

Ala Glu Trp Arg Ser Leu Trp His Asn Asp Cys His Arg Val Cys His

20 25 30

Phe Glu Leu Asp Gln His Val Asp Leu Ala Cys Arg Met Asp Ile Tyr

35 40 45

Arg Ile Arg Lys Arg Ser Val Asp Ala Ala Glu Glu Pro Arg Ile Ser

50 55 60

Asn Lys Tyr Glu Thr Asp Asn Gln Asn Thr Lys Arg Ile Phe Ile Asp

65 70 75 80

Lys Ser Thr Ser Met Lys Phe Leu Ser Pro Asp Ser Val His Ser Ile

85 90 95

Arg Arg Lys Arg Asn Val Leu Asn Glu Cys Cys Tyr Ser Lys Gly Cys

100 105 110

Ser Trp Glu Glu Phe Ala Glu Phe Cys Gln Phe Ser Ile Arg Leu Pro

115 120 125

Ala Thr Asn Ala Asn Ser Cys Val Ser

130 135

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 5

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<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

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gtggtggtgg tggtgctcga gtcacatatt gattatgcgc ctcc 44

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<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 7

gccatggctg atatcggatc ctcagacttt gagcgagtgt gtaatt 46

<210> 8

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<212> DNA

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 8

gtggtggtgg tggtgctcga gtcatttgtt caagacacta tcaatcaa 48

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 9

gccatggctg atatcggatc cgggtttgaa aaggtgtgca cg 42

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 10

gtggtggtgg tggtgctcga gtcactctgc gcagtaatcc tca 43

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 11

gccatggctg atatcggatc cgctatccat taccaaagct acaacc 46

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 12

gtggtggtgg tggtgctcga gttaggatac gcaagagtta gcgtt 45

Claims

1.长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体，其特征在于，该四种胰岛素样肽多克隆抗体为anti-ILP、anti-MIRP3、anti-MIRP3-like和anti-ILP7；anti-ILP对应的抗原表位为SEQ IDNO.1所示，anti-MIRP3对应的抗原表位为SEQ ID NO.2所示，anti-MIRP3-like对应的抗原表位为SEQ ID NO.3所示，anti-ILP7对应的抗原表位为SEQ ID NO.4所示。

2.含有权利要求1所述的抗原表位的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达质粒与宿主菌；所述表达质粒为通过将抗原表位片段与原核表达载体pET32a进行连接构建，宿主菌为包含所述表达质粒的BL21表达菌株。

3.所述四种胰岛素样肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

S2. 构建表达质粒：分别针对各胰岛素样肽，设计一对特异性引物以扩增抗原片段，将扩增后的抗原片段与原核表达载体pET32a进行连接，分别构建pET32a-ILP，pET32a-MIRP3，pET32a-MIRP3-like，pET32a-ILP7表达质粒；

S3. 将上述四种表达质粒导入大肠杆菌BL21进行表达，对重组蛋白进行纯化；

S5. 收集、分离得到含有抗体的小鼠血清，采用抗原亲和层析方法纯化血清，即得到四种胰岛素样肽多克隆抗体。

4.权利要求1所述的四种胰岛素样肽多克隆抗体在长牡蛎胰岛素样肽分泌细胞的定位及长牡蛎神经内分泌调控网络构建中的应用。