CN114920820A - 一种长牡蛎分化抗原蛋白cd9及其单克隆抗体的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于软体动物亚型血淋巴细胞的新型膜表面标记分子的鉴定及应用，涉及一种长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9及其单克隆抗体的制备和应用。长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9在作为长牡蛎无粒细胞膜表面标记分子中的应用。本发明首次在长牡蛎中克隆获得CgCD9分子，其包含典型的四次跨膜结构域，对其表达特征分析发现，CgCD9mRNA在长牡蛎无粒细胞的表达量显著高于半粒细胞和颗粒细胞，其主要位于无粒细胞的细胞膜上。利用本发明制备的CgCD9单克隆抗体结合免疫磁珠法可高纯度地分离有活力的无粒细胞，为无粒细胞的体外培养及对无粒细胞的发育过程和免疫学功能的深入研究提供了有力的工具。

Description

一种长牡蛎分化抗原蛋白CD9及其单克隆抗体的制备和应用
技术领域
本发明属于软体动物亚型血淋巴细胞的新型膜表面标记分子的鉴定及应用，涉及一种长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9及其单克隆抗体的制备和应用。
背景技术
CD9属于白细胞分化抗原中的一种，是由Kersey于1981年利用单克隆抗体Ba-2首次发现的。CD9是一种四次跨膜糖蛋白，分子量为24～27kDa，其Tetraspanin结构包括四个高度疏水的跨膜结构域，2个细胞外环，1个细胞内环，及两侧处于胞浆区的N端和C端。高等动物中，CD9被鉴定在多种造血和非造血细胞中表达，如基质细胞、巨核细胞、血小板、B和T淋巴细胞、树突状细胞、内皮细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。 CD9具有多种多样的生物学活性，如细胞粘附、运动、转移、生长、信号转导、增殖分化和精卵融合等[1,2]。
CD9被鉴定为人类淋巴造血祖细胞的抗原分子[3,4]。至今，CD9作为一类膜表面标记分子已被广泛用于区分和分离多种细胞类群。例如，在人中， CD9是胰腺癌干细胞的特异性标记分子，CD9high细胞增加了器官形成能力。 CD9也被鉴定为浆母细胞的新型标记分子。在小鼠和大鼠中，CD9可以用作生殖干细胞、边缘区B细胞、B1细胞、浆细胞、IL-10+B细胞及其祖细胞的特异性膜表面标记物[5]。在大鼠中，CD9被鉴定为S100β/SOX2+细胞的标记分子，其单克隆抗体可用于S100β/SOX2+细胞的高纯度分离，进而对该类细胞进行形态结构和功能上的表征。BMP/ID2刺激后，体外培养的S100β/SOX2+细胞可以分化为内皮细胞[4]。位于细胞膜上的标记分子为亚型细胞的分离提供了一个很有前景的分子工具。细胞表面抗原CD9在高等动物中被鉴定为一种有效且可靠的标记物，标记多种干/祖细胞和免疫细胞。但目前在软体动物中，还未见该基因的研究及报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9及其单克隆抗体的制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9，长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
所述的长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9的应用，所述长牡蛎分化抗原蛋白 CgCD9在作为长牡蛎无粒细胞膜表面标记分子中的应用。
一种长牡蛎无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的特异性序列，特异性序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一种长牡蛎无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的特异性序列的应用，所述特异性序列在制备无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的单克隆抗体中的应用。
一种无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的单克隆抗体，单克隆抗体中含权利要求3所述的SEQ ID NO:2所示的特异性序列。
所述的单克隆抗体是由杂交瘤细胞CgCD9-6-3D8(依据其所在96孔板中的位置命名为CgCD9-6-3D8)分泌所得，所述杂交瘤细胞CgCD9-6-3D8为免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后得到的可持续稳定分泌针对 CgCD9特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
所述CgCD9-6-3D8是以长牡蛎CgCD9胞外小环的多肽-牛血清白蛋白 (BovineSerum Albumin:BSA)复合物作为抗原，免疫6周龄、Balb/C雌性小鼠，采用细胞融合法和有限稀释法制备杂交瘤细胞。其中，长牡蛎CgCD9胞外小环的多肽是委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，且委托该公司将合成的CgCD9胞外小环的15个氨基酸(SDDFTKYSDADDSL)偶联至BSA标签上，抗原复合物合成的纯度为98％。
通过Western Blotting验证，结果显示CgCD9-6-3D8单克隆抗体可与长牡蛎无粒细胞的天然蛋白发生特异性反应，在25.2kDa处出现一条单一且明显的黑色条带，表明该抗体具有良好的特异性。
通过免疫荧光细胞实验，结果显示CgCD9-6-3D8单克隆抗体可与长牡蛎无粒细胞发生反应，荧光显微镜下观察到CgCD9阳性信号(绿色)主要分布于无粒细胞的细胞膜上，与细胞膜染料DiI(红色)呈共定位分布。与实验用到的其他2类亚型细胞(半粒细胞和颗粒细胞)均无阳性反应。
一种长牡蛎无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的单克隆抗体的应用，所述CgCD9单克隆抗体在用于对长牡蛎无粒细胞的特异性识别、活性细胞的分离、对分离细胞的形态结构鉴定及体外培养中的应用。
本发明所具有的优点：
1.本发明首次在长牡蛎中克隆获得一个CD9分子，命名为CgCD9，其包含一个典型的四次跨膜结构域，对其表达特征分析发现，CgCD9 mRNA在长牡蛎无粒细胞的表达量显著高于半粒细胞和颗粒细胞，其主要位于无粒细胞的细胞膜上。
2.通过在长牡蛎中克隆获得的CgCD9分子中得到其胞外小环区的特征性序列，该特征性序列是分选无粒细胞且不对细胞活性造成损失的基本条件，是用于细胞体外功能研究的基本要求。
3.通过本发明所得胞外小环区的特征性序列并利用细胞融合和有限稀释法亚克隆技术，筛选获得了CgCD9的单克隆细胞株CgCD9-6-3D8。其分泌的单克隆抗体特异性结合长牡蛎无粒细胞，与其他2类亚型血淋巴细胞无交叉反应；杂交瘤细胞株CgCD9-6-3D8可长期储存于液氮中，细胞经再次复苏、培养后可获得更多的抗体。
4.本发明获得的CD9单克隆抗体，是多克隆抗体所达不到的特异性，是对于亚型细胞分选所必须的。
5.本发明利用CgCD9-6-3D8单克隆抗体结合免疫磁珠法，对长牡蛎无粒细胞进行分离，CgCD9+无粒细胞占总的分离细胞的百分比代表其分离纯度，高达94.53±5.60％；且该抗体结合CgCD9胞外小环域，不影响分离细胞的活性，分离出的无粒细胞可体外培养至少一个月。本发明方式为有效分选长牡蛎无粒细胞提供了的分子工具，对深入研究无粒细胞的发生、发育及生物学功能具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施提供的CgCD9分子的序列特征：(A)CgCD9的核苷酸及其对应的氨基酸序列，红色线下划线表示用于体外合成肽段的氨基酸序列。(B)CgCD9蛋白四次跨膜结构示意图，红色线表示体外合成CD9肽段的位置，选择该序列作为免疫原制备单克隆抗体是因其位于胞外段，可用于分选有活力的细胞；(C)CgCD9蛋白包含一个Tetraspanin结构域；
图2为本发明实施提供的CgCD9 mRNA在长牡蛎三类亚型血淋巴细胞中的表达情况；
图3为本发明实施提供的CgCD9单克隆抗体的筛选及特异性验证：(A) ELISA法检测CgCD9抗体的特异性；(B)CgCD9-6-3D8杂交瘤细胞单一细胞团； (C)Western Blotting检测CgCD9抗体的特异性；
图4为本发明实施提供的CgCD9单克隆抗体在长牡蛎无粒细胞的亚细胞定位图；
图5为本发明实施提供的CgCD9单克隆抗体对长牡蛎无粒细胞的分离： (A)流式细胞仪分析CgCD9+无粒细胞的分离纯度，高达94.53±5.60％；(B)流式细胞仪显示CgCD9+无粒细胞的形态特征；(C)光学显微镜下观察CgCD9+无粒细胞的形态特征(Wright-Giemsa染色+光学显微镜)，bar＝20μm；
图6为本发明实施提供的CgCD9单克隆抗体对长牡蛎无粒细胞的分离所得CgCD9+无粒细胞的体外培养。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明首次在长牡蛎中克隆获得了CD9分子，命名为CgCD9，其包含典型的四次跨膜结构域，对其表达特征分析发现，CgCD9在长牡蛎无粒细胞的表达量显著高于半粒细胞和颗粒细胞，主要位于无粒细胞的细胞膜上。选取其胞外小环区的特征性序列，采用细胞融合和亚克隆技术，筛选获得了CD9的单克隆抗体(3D8)。该单克隆抗体特异性结合长牡蛎无粒细胞，与其他2类亚型细胞(半粒细胞和颗粒细胞)无交叉反应。本发明利用3D8 单克隆抗体(CgCD9-6-3D8)结合免疫磁珠法，对长牡蛎无粒细胞进行分离，分离纯度高达94.53±5.60％，该抗体不影响细胞的活性，分离出的无粒细胞可体外培养至少一个月。利用本发明制备的CgCD9单克隆抗体结合免疫磁珠法可高纯度地分离有活力的无粒细胞，为无粒细胞的体外培养及对无粒细胞的发育过程和免疫学功能的深入研究提供了有力的工具。
材料方法：
实验动物：
本发明以长牡蛎为研究对象，又称太平洋牡蛎。所用长牡蛎为2龄成体，壳长约10-15cm，购买于辽宁省大连市长兴海鲜市场。购买后对其进行清洗，暂养于充气的18-22℃的海水养殖环境中，每天更换海水并定时定量投喂商品化螺旋藻饵料，暂养一周后开始实验。
本发明所用SPF级Balb/C雌性小鼠购买于辽宁省大连市大连医科大学实验动物中心，购买后暂养于恒温(24℃)通风鼠房中，每天补加鼠粮和饮用水，每周更换一次垫料，暂养两周后开始实验。
实验细胞株：
本发明所用SP2/0杂交瘤细胞[6]受赠于大连海洋大学李强老师实验室，保存于本实验室液氮罐中。
实验例1：CgCD9分子克隆及免疫原肽段的体外合成
本发明首次在长牡蛎中鉴定出一个CD9分子(NCBI accession number:LOC105330365)，命名为CgCD9。利用PCR技术，按照ExTaq DNA聚合酶使用说明(TAKARA,Japan)，在PCR管中配置反应体系(2.5μL 10×Buffer,2μL dNTP, 1.5μL MgCl2,1μL 10μmol/L CgCD9 forward primer,1μL 10μmol/L CgCD9 reverse primer,1μL cDNAtemplate,0.15μL ExTaq,15.85μL DEPC H2O)，将PCR 管中反应物混合均匀后，置于PCR仪中进行扩增，反应条件设定为94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，35 个循环；72℃延伸10min，1个循环，PCR扩增完成后，进行1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，切取基因条带，使用DNA凝胶回收试剂盒(TAKARA,Japan) 进行DNA产物回收，并送至生工生物有限公司测序，得到CgCD9编码区全长为693bp，编码一段含有230个氨基酸的多肽(参见图1)。
CgCD9克隆引物序列：
CgCD9 forward primer：ATGGCTCTTGGAAGTTGTCA
CgCD9 reverse primer：TTACGCCTGGATGTCCCTGAT
SEQ ID NO:1
核苷酸序列：
ATGGCTCTTGGAAGTTGTCACACATGCATCAAATATTTGATGTTTGCCTTTAACTTTCTGTTTTGGCTGCTGGGATGTGCTATGTTAGGAGTCG GGATCTGGCTCCTCGTCAGCGATGACTTCACAAAGTATTCCGATGCCGATGATAGTTTGAGTTTCATCTACACTGGAGCCTACATCCTTGTGG CTATTGGCGGCCTAATAATGATAATCGGCTTCTTAGGATGTTGTGGCGCAATTAGGGAAAGCCAATGTATGCTGGGATGTTTCTTTTTCCTGTT ATTCATCATCTTTGCGGTCTTACTTGGGGCTGGAATCTGGGCAGTTATTTCGAAAGATGAAGTACGGTCAATAGTGAAAGAAGTATTAGATAA ACAGATTGAGCGAGCATGTGACCCTAAAGAACCCAACTCGAAGAGTTTGAACTTTCTTAACCACGTACAGGAACAGTTCCAATGCTGTGGG GTCAACGGTATAATTGATTACAAAGATTTTGACAAGTGTAATGCCTCCTCCTCAGAACCTTGCCGTGCGTTAAACATCAACAATGGTTGCTTA GACAAAGCTAGCGCTTGGTTCGAACAGAACATTCTCATTGTTGCTGGGGTAGCAATAGGAATTGCAGTGGTTTTGATTTTGGGAATGATCTT CTCAATAGTGCTGTGCTGTGCAATCAGGGACATCCAGGCGTAA
氨基酸序列
MALGSCHTCIKYLMFAFNFLFWLLGCAMLGVGIWLLVSDDFTKYSDADDSLSFIYTGAYILVAIGGLIMIIGFLGCCGAIRESQCMLGCFFFLLFIIFA VLLGAGIWAVISKDEVRSIVKEVLDKQIERACDPKEPNSKSLNFLNHVQEQFQCCGVNGIIDYKDFDKCNASSSEPCRALNINNGCLDKASAWFE QNILIVAGVAIGIAVVLILGMIFSIVLCCAIRDIQA
对所得序列进行SMART分析揭示CgCD9蛋白含有一个典型的Tetraspanin结构域。TMHMM-2.0网站分析显示CgCD9蛋白包括4个跨膜区， 2个胞外域，1个胞内域和一个“CCG”保守基序。根据ProtParam软件预测CgCD9蛋白分子质量为25.2kDa，等电点为4.84。
而后进一步利用上述获得CgCD9氨基酸序列委托生工生物工程(上海) 股份有限体外合成以CgCD9蛋白胞外小环的15个氨基酸，即SEQ ID NO:2 中记载的氨基酸序列，并委托该公司将SEQ ID NO:2中记载的氨基酸多肽段偶联至BSA载体上，即为CgCD9多肽-BSA复合物，用于免疫Balb/C小鼠。
SEQ ID NO:2
SDDFTKYSDADDSL
由图1可见CgCD9的分子特征，图1A为CgCD9的核苷酸及其对应氨基酸序列，其中红色横线显示为体外合成CgCD9肽段所用的氨基酸序列；图1B为CgCD9蛋白四次跨膜结构示意图，体外合成CgCD9多肽段所处的位置以红色线表示；图1C为CgCD9蛋白包含一个保守Tetraspanin结构域。
实验例2：荧光实时定量PCR(qRT-PCR)
利用qRT-PCR方法检测CgCD9在长牡蛎三类亚型血淋巴细胞中mRNA 表达量。利用SYBR绿色荧光染料结合双链DNA后会发出绿色荧光信号的特征，以此作为DNA含量指示剂，通过2-ΔΔCt法对CgCD9在三类亚型细胞中的表达水平进行分析，具体实验步骤如下：使用Primer 5软件对待检测目的基因设计特异性引物。长牡蛎管家基因Elongation Factor 1-α(命名为 CgEF1-α)被选用作为内参基因，配置荧光定量PCR反应体系(3.3μL 2×SYBRGreen Master Mix，0.1μL 10μmol/L forward primer，0.1μL 10μmol/L reverse primer,2μL cDNA template,4.4μL DEPC H2O，0.1μL 50×ROX Dye II)，启动 QuantStudioTM6Flex Real-Time PCR System(applied biosystems, ThermoFisher Scientific,USA)，并设定反应程序：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性5s后60℃退火和延伸31s，40个循环；60℃延伸步骤进行荧光信号采集；为验证PCR产物扩增特异性，PCR反应阶段结束后还需进行溶解曲线分析，设定反应程序如下：95℃15s，60℃30s，95℃15s，1 个循环；通过2-ΔΔCt法结合扩增后获取的Ct值对CgCD9 mRNA相对表达水平进行分析。本实验例中每组中每3管样品混为1管，均有3次实验重复，用平均数±标准差来表示。使用SPSS 26.0单因素方差分析法对3类亚型细胞组间统计学差异进行分析，p<0.05为显著性差异，在图表中用字母a和b标注。
由图2结果显示CgCD9在无粒细胞中的表达量显著高于其在半粒细胞和颗粒细胞中的表达，分别为半粒细胞和颗粒细胞表达量的3.68-fold(p> 0.05)和6.63-fold(p<0.05)，是长牡蛎无粒细胞的潜在膜标记分子。
CgCD9 RT-PCR引物序列：
CgCD9 RT forward primer：CACAAAGTATTCCGATGCCGA
CgCD9 RT reverse primer：CAGATTCCAGCCCCAAGTAAGA
CgEF1-αRT-PCR引物序列：
CgEF1-αRT forward primer：AGTCACCAAGGCTGCACAGAAAG
CgEF1-αRT reverse primer：TCCGACGTATTTCTTTGCGATGT
实验例3：CgCD9单克隆抗体制备及其特异性检测
1.CgCD9多肽-BSA复合物免疫Balb/C小鼠
免疫用小鼠为6周龄、雌性、SPF级Balb/C小鼠，共免疫3只，每只免疫5次。上述第1次免疫时，将实施例1获得CgCD9多肽-BSA复合物(蛋白量为300μg溶于300μL纯水)与完全弗氏佐剂按体积1:1比例混合，混合后使用超声波破碎机对其进行充分乳化，而后按200μL/只的量腹腔注射小鼠；第2次免疫时，将CgCD9多肽-BSA复合物(蛋白量为300μg溶于300 μL纯水)与不完全弗氏佐剂按体积1:1比例混合，混合后使用超声波破碎机对其进行充分乳化，而后按200μL/只的量腹腔注射小鼠；第3和第4次免疫时按照第2次免疫时进行。1周后，对3只小鼠进行断尾取血，间接 ELISA法检测免疫小鼠的血清中抗体的效价，选取效价最高的1只进行加强免疫。第5次加强免疫，将CgCD9多肽-BSA复合物(蛋白量为150μg溶于 300μL纯水)直接按100μL/只的剂量腹腔注射小鼠，3天后，取其脾细胞用于细胞融合。
2.细胞融合
2.1骨髓瘤细胞的准备
融合前两周，从液氮中取出冻存的SP2/0骨髓瘤细胞，立即放入37℃水浴锅中快速溶化，1000rpm离心5min，于超净台中弃上清，重悬于1mL 含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，加入12孔细胞培养板中，置于 37℃，5％CO2的培养箱中培养。每天更换新鲜的培养基。当长满16孔细胞时，每四孔转至一个细胞培养瓶(4×25cm2)中进行扩大培养，待细胞处于对数生长期时，此时细胞生长状态好、细胞浑圆透亮、大小均一，可准备细胞融合。
2.2饲养层细胞的准备
在进行融合实验之前，取4周龄、雌性Balb/C小鼠进行颈脱位处死，浸泡于75％酒精中进行体表消毒后，将小鼠移入超净工作台内解剖容器上，用灭菌消毒后的镊子和剪刀沿小鼠腹部将皮肤和腹膜剪开，使胸腺充分暴露。用镊子将其两片胸腺小心剥离，在200目筛娟上，充分研磨，收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清，重悬于40mL HAT培养液(RPMI-1640 培养液中添加20％胎牛血清和2％HAT)中，置于37℃，5％CO2培养箱中备用。
2.3免疫脾细胞的制备
取上述步骤1记载加强免疫3天后的小鼠，颈脱位处死，浸泡于75％酒精中进行体表消毒，将小鼠移入至超净工作台内解剖容器上，同2.2方法一样，获得免疫脾细胞，重悬于10mL PRMI-1640基础培养基中，细胞计数，备用。
2.4细胞融合
(1)经计数后，以免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞数为5:1的比例混匀于50mL离心管中，1200rpm离心8min；
(2)弃上清，充分松弛细胞团，将离心管置于37℃水浴中预热；
(3)90s的时间缓慢加入1mL质量百分比为50％的PEG 2000溶液促进细胞融合，在水浴中静置作用90s后，缓慢加入PRMI-1640基础培养基终止反应，边滴边轻轻搅拌(第1min加1mL，第2min加1mL，第3min加 1.5mL，第4min加1.5mL，第5min加5mL)，800rpm离心6min；
(4)弃上清，用40mL HAT培养基(含107胸腺细胞)重悬，混匀后铺于96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。直至培养的第5天，每孔补加一滴新鲜HAT培养基。每天用倒置显微镜观察细胞生长的情况(参见图3B)。
如图3B，待培养板孔底生长出细胞团，且细胞团占培养板孔底面积的 1/4-1/3时，抽取其上清液，用间接ELSA法筛选阳性杂交瘤细胞株。
2.5有限稀释法克隆3代
将上述步骤2.4获得10mL HAT培养液转至24孔培养板上扩大培养，通过有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆，共克隆3代，进而获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株，具体步骤如下：
(1)按上述步骤2.3，取小鼠胸腺饲养层细胞，用10mL HAT培养液重悬配制为胸腺细胞悬液；
(2)经扩大培养后的杂交瘤细胞，经血球计数板计数后，取约100个杂交瘤细胞加入上述获得的胸腺细胞悬液中；
(3)将细胞悬液混合均匀，滴加至96孔培养板中，每孔100μL，理论上每孔含有1个杂交瘤细胞；
(4)置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，培养的第5天，补加一滴新鲜HAT培养基，至第10天，用倒置显微镜观察单一细胞团。
同上述图3B，待培养板孔底生长出细胞团，且细胞团占培养板孔底面积的1/4-1/3时，抽取其上清液，用间接ELSA法筛选阳性杂交瘤细胞株。
2.6腹水单克隆抗体的制备
取10周龄雌性Balb/C小鼠，腹腔注射500μL液体石蜡，一周后，腹腔注射106个杂交瘤细胞，诱生腹水，7-10天后小鼠腹部明显膨胀，抽取腹水，2000rpm，离心5min，收集上清，即为腹水单克隆抗体。
3.阳性杂交瘤细胞的筛选
待步骤2.5(4)观察所得杂交瘤细胞团形态可观后，且细胞培养液变黄时开始筛选，以三类亚型血淋巴细胞为包被物进行间接ELISA检测阳性细胞株，具体步骤如下：
(1)包被细胞：用碳酸盐缓冲液将4％多聚甲醛固定后的无粒细胞，半粒细胞和颗粒细胞包被在酶标板中，4℃静置过夜；
(2)弃包被液，PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗涤3次(5min/次)；
(3)每孔加100μL含3％脱脂奶粉的PBST溶液，37℃封闭1h；
(4)弃封闭液，PBST洗涤3次(5min/次)，加入待检杂交瘤细胞上清，同时将PBS孔设为空白对照，每孔100μL，37℃孵育1h；
(5)弃上清，PBST洗涤3次(5min/次)，加入1:2000的碱性磷酸酯酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)(AP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L))，每孔100 μL，37℃孵育1h；
(6)PBST洗涤3次(5min/次)，每孔加入100μL含有0.01％PNPP-Na 的显色液，避光显色15min，测定OD405值，以待测孔OD值(P)大于或等于阴性对照孔(N)，即P/N≥2.1倍的判定为阳性(参见图3A)。
即获得特异性较高的阳性杂交瘤细胞株，命名为3D8。由图3A可知，该单克隆抗体与无粒细胞发生较强的阳性反应，其阳性值P/N为17.35；与半粒细胞的阳性值P/N较低为4.48，与颗粒细胞无阳性反应，P/N为1.55。
实验例4：Western Blotting检测
抽取长牡蛎血淋巴液，600g离心10min，收集血淋巴细胞，加入含有蛋白酶抑制剂混合物的SDS裂解液冰上裂解30min，4℃12000rpm，离心 10min，取上清，即为血淋巴细胞的天然蛋白；取40μL裂解蛋白液与10μL 蛋白loading buffer(5×，含5％β-巯基乙醇)混匀，100℃煮沸10min；将血淋巴细胞的天然蛋白加入12％的SDS-PAGE胶孔中(20μL/孔)，进行电泳分离；根据凝胶大小剪裁滤纸和硝酸纤维素印迹膜(NC膜)，并提前放入预冷的电转液(25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，20％甲醇)中浸泡10min后，利用半干式电转仪将分离胶中蛋白转移至NC膜上；电转完成后，取下NC膜，用5％的封闭液(5g脱脂奶粉溶于100mLTBST缓冲液)室温封闭3h后；加入上述实施例中获得的CgCD9-6-3D8单克隆抗体(1:1000稀释于5％封闭液)37℃振荡孵育2h；TBST洗涤3次(5min/次)，加入HRP标记的山羊抗鼠二抗(1:2000稀释于5％封闭液)37℃，振荡孵育2h；TBST振荡洗涤3次 (5min/次)。在膜上滴加显影底物，ECL显影，并于Amersham Imager 600(GE) 成像系统中拍照并保存图像(参见图3C)。
由图3C结果显示，NC膜上呈现出一条与CgCD9蛋白分子量相一致的单一条带，表明制备的CgCD9单克隆抗体3D8具有较强特异性，能够结合长牡蛎血淋巴细胞天然蛋白中CgCD9蛋白。
实验例5：免疫荧光细胞实验
离心并收集长牡蛎血淋巴细胞，300目筛绢过滤后，平铺于多聚赖氨酸包被的载玻片上，室温静置2h待其充分贴壁；弃掉上清，4％多聚甲醛固定细胞30min，TBST清洗三次，加入200μL 3％封闭液(3g BSA溶于100mL TBST缓冲液)中室温孵育3h，封闭其非特异性结合位点。弃上清，TBST清洗三次，依次加入CgCD9-6-3D8单克隆抗体(1:1000稀释于3％封闭液)和 Alexa Fluor 488绿色荧光标记的山羊抗鼠二抗(1:2000稀释于3％封闭液)， 37℃条件下各孵育3h，PBST清洗三次后依次加入DiI(细胞膜染料)和DAPI (细胞核染料)分别于常温孵育5min，PBST清洗三次(5min/次)后，置于荧光共聚焦显微镜下观察拍照(参见图4)。
由图4结果可见，CgCD9蛋白在长牡蛎无粒细胞中特异性分布。CgCD9 蛋白在细胞膜上的阳性信号标记为绿色，与细胞膜染料DiI(标记为红色) 存在共定位，结果表明CgCD9蛋白主要在长牡蛎无粒细胞的细胞膜上分布，在半粒细胞和颗粒细胞上没有检测到CgCD9蛋白的绿色荧光信号。
实验例6：免疫磁珠法分离CD9+无粒细胞及其形态特征观察
用抗凝剂预装20mL注射器，按体积1:1比例抽取长牡蛎血淋巴液，600 g，离心10min，缓慢弃掉上清收集血淋巴细胞，用分离buffer(L-15培养基 +2mM EDTA+0.5％BSA)重悬，室温封闭1h，600g离心5min，弃掉上清；用分离buffer重悬血淋巴细胞，依次加入CgCD9-6-3D8单克隆抗体(1:1000 稀释于分离buffer)和goat-anti-mouse IgG magneticbeads(20μL per 107cells, ThermoFisher Scientific,USA)，分别室温孵育1h；在外磁场吸附作用下，抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，阴性细胞由于不能与相连着磁珠的特异性抗体结合而没有磁性，不能在磁场中停留，从而使阳性和阴性细胞得以分离；用分离buffer洗涤3次(5min/次)，300目筛绢过滤后，总血淋巴细胞和CD9+阳性细胞上样，流式细胞仪检测(Amnis ImageStreamX MarkⅡ,Luminex,USA)(参见图5)。
将分离出的CgCD9+无粒细胞，用4％多聚甲醛固定30min后，用 Wright-Giemsa染色液染色3min；用蒸馏水洗涤直至无色后，光镜下观察 CgCD9+无粒细胞的形态结构特征(参见图5C)。
图5中可知：图5A运用流式细胞术对CgCD9+无粒细胞的分离纯度进行鉴定分析。根据流式细胞术参数：面积(Area)和颗粒度(Gradient)，流式细胞仪散点图中显示出总的血淋巴细胞(蓝色)和CgCD9+无粒细胞(绿色)的分布情况，从图中可知CgCD9+无粒细胞位于血淋巴细胞的左侧，代表了具有较小的面积和无胞质颗粒度，这与无粒细胞的形态结构特征相一致。图5B结合形态学分析显示CgCD9+无粒细胞是一类直径较小，无胞质颗粒。图5C中细胞Wright-Giemsa染色可知，CgCD9+无粒细胞直径较小(5.9-8μm)，核质比较大，细胞核几乎充满整个细胞，无胞质颗粒。推测CgCD9+无粒细胞可能是一类前体细胞。
实验例7：CD9+无粒细胞的体外培养
免疫磁珠分离出的CgCD9+无粒细胞用4mL改良的L15培养基(L15培养液(ThermoFisher Scientific,USA)补加L15盐以提高渗透压，补加1％庆大霉素和1％链霉素以防止培养基污染；L15盐：20.2g/L NaCl,0.54g/L KCl,0.6g/L CaCl2,1g/L MgSO4,3.9g/LMgCl2)吹打成细胞悬液接种于6孔培养板中，置于 20℃，5％CO2培养箱中静置培养；每隔两天更换1/4等量的新鲜预热过的 L15培养基。使用倒置显微镜(Zeiss,Germany)，每天观察CgCD9+无粒细胞的生长状态。
由图6结果显示，每天在倒置显微镜下观察，通过观察细胞形态评价细胞活力。体外培养1个月，光学显微镜下观察发现CgCD9+无粒细胞呈圆形，细胞结构完整，细胞表面结合的免疫磁珠也没有出现脱落的现象，结果表明分离后的细胞在体外培养一个月的时间仍维持活性；表明其可体外培养至少一个月的时间。
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序列表
<110> 大连海洋大学
<120> 一种长牡蛎分化抗原蛋白CD9及其单克隆抗体的制备和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctcttg gaagttgtca cacatgcatc aaatatttga tgtttgcctt taactttctg 60
ttttggctgc tgggatgtgc tatgttagga gtcgggatct ggctcctcgt cagcgatgac 120
ttcacaaagt attccgatgc cgatgatagt ttgagtttca tctacactgg agcctacatc 180
cttgtggcta ttggcggcct aataatgata atcggcttct taggatgttg tggcgcaatt 240
agggaaagcc aatgtatgct gggatgtttc tttttcctgt tattcatcat ctttgcggtc 300
ttacttgggg ctggaatctg ggcagttatt tcgaaagatg aagtacggtc aatagtgaaa 360
gaagtattag ataaacagat tgagcgagca tgtgacccta aagaacccaa ctcgaagagt 420
ttgaactttc ttaaccacgt acaggaacag ttccaatgct gtggggtcaa cggtataatt 480
gattacaaag attttgacaa gtgtaatgcc tcctcctcag aaccttgccg tgcgttaaac 540
atcaacaatg gttgcttaga caaagctagc gcttggttcg aacagaacat tctcattgtt 600
gctggggtag caataggaat tgcagtggtt ttgattttgg gaatgatctt ctcaatagtg 660
ctgtgctgtg caatcaggga catccaggcg taa 693
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Asp Asp Phe Thr Lys Tyr Ser Asp Ala Asp Asp Ser Leu
1 5 10

Claims (7)

1.一种长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9，其特征在于：长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.按权利要求1所述的长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9的应用，其特征在于：所述长牡蛎分化抗原蛋白CgCD9在作为长牡蛎无粒细胞膜表面标记分子中的应用。
3.一种长牡蛎无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的特异性序列，其特征在于：特异性序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种权利要求3所述的长牡蛎无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的特异性序列的应用，其特征在于：所述特异性序列在制备无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的单克隆抗体中的应用。
5.按权利要求3所述的长牡蛎无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的特异性序列的应用，其特征在于：所述特异性序列位于蛋白胞外区域，在用于对活性细胞分离中的应用，为活性细胞的体外培养、组学测序，免疫功能的研究提供了必备条件。
6.一种无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的单克隆抗体，其特征在于：单克隆抗体中含权利要求3所述的SEQ ID NO:2所示的特异性序列。
7.一种权利要求6所述的无粒细胞膜表面标记分子CgCD9的单克隆抗体的应用，其特征在于：所述CgCD9单克隆抗体在用于对长牡蛎无粒细胞的特异性识别、活性细胞的分离、对分离细胞的形态结构鉴定及体外培养中的应用。
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