CN110684094A

CN110684094A - 一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白及其应用

Info

Publication number: CN110684094A
Application number: CN201910818141.7A
Authority: CN
Inventors: 刘光明; 韩天娇; 杨阳; 胡梦君; 刘红; 李梦思
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2020-01-14

Abstract

本发明提供了一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白及其应用，该致敏蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。根据本发明的葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因，其克隆入原核表达载体，构建重组表达质粒，再转入宿主菌并诱导表达，可获得重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP，利用该重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP与贝类过敏患者血清进行IgE结合能力的测定，可为过敏症状的临床诊断及致敏原详细筛查提供参考依据，使得针对SCP的过敏性疾病的防控和治疗及时准确。

Description

一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白及其应用

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白及其应用。

背景技术

过敏性疾病一直是国内外面临的一个重要健康问题，食物过敏是一种典型的过敏性疾病，属于由免疫球蛋白IgE介导的I型过敏反应。甲壳类水产品是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一，所以对于海鲜产品过敏原的研究主要在指向于甲壳类动物过敏原，但海鲜水产品中软体动物也能引起过敏反应。据研究报道，甲壳类动物与软体动物具有交叉过敏原，但是关于软体动物过敏原的研究却远少于甲壳类动物的过敏原。

牡蛎，软体动物类中最受欢迎的食物。葡萄牙牡蛎主要分布在我国南方沿海，是我国重要的经济贝类；葡萄牙牡蛎的产量排在我国牡蛎产量的第一位。因此，随着贝类生产和消费的新兴趋势，以牡蛎为代表的贝类所引发的食物过敏也引起我们的重视。目前，针对牡蛎过敏原的报道主要是Cra g 1蛋白(属于一种原肌球蛋白)，其免疫学特性研究的也较为清楚。而肌质钙结合蛋白(SCP)主要参与无脊椎动物的肌肉收缩反应，其作为过敏原的相关报道主要集中在虾、蟹属中，因此牡蛎的SCP是一种新型过敏原，其信息还较为欠缺，这很大程度上阻碍了其致敏性的探究，使得针对牡蛎致敏蛋白SCP的过敏性疾病的防控和治疗有限。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明的第一个目的在于提出一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白，该蛋白经指纹图谱分析进行鉴定是为葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP，该致敏蛋白SCP与贝类过敏患者血清进行IgE结合能力的测定，可为过敏症状的临床诊断及致敏原详细筛查提供参考依据。

本发明的第二个目的是提出一种多克隆抗体。

本发明的第三个目的是提出一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因。

本发明的第四个目的是提出一种重组质粒。

本发明的第五个目的是提出一种制备重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白的方法。

本发明的第六个目的是提出一种重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白。

本发明的第七个目的是提出一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白的应用。

在本发明的第一个方面中，提供了一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示。根据本发明实施例，首次纯化出一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白，该致敏蛋白的相对分子量约为20kDa；该蛋白经指纹图谱分析进行鉴定是为葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP，该致敏蛋白SCP与贝类过敏患者血清进行IgE结合能力的测定，可为过敏症状的临床诊断及致敏原详细筛查提供参考依据。

在本发明的第二方面中，提供了一种多克隆抗体，其由上述的葡萄牙牡蛎致敏蛋白作为抗原免疫新西兰白兔后，对新西兰白兔颈动脉采血获得。

在本发明的第三个方面中，提供了一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。其中，该基因全长537bp。

在本发明的第四个方面中，提供了一种重组质粒，其包含上述葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因。

在本发明的第五方面中，根据本发明实施例，提供了一种制备重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白的方法，其包括下列步骤：

(1)从葡萄牙牡蛎肌肉组织中提取总RNA，反转录成cDNA；

(2)以cDNA为模板进行PCR扩增，获得上述的葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因；

(3)将步骤(2)获得的编码基因克隆入原核表达载体中，构建重组质粒；

(4)将所述重组质粒转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白；

(5)将步骤(4)获得的纯化蛋白经上述的多克隆抗体鉴定，即获得重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白。

根据本发明的实施例，通过提取葡萄牙牡蛎肌肉组织RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，获得葡萄牙牡蛎致敏原蛋白的编码基因片段；将致敏原基因片段克隆至原核表达载体中，构建重组表达质粒pET-22b，再转入宿主菌大肠杆菌BL21，用IPTG诱导其表达，采用亲和层析方法纯化，从而获得重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP；该蛋白可与贝类过敏患者血清的特异性IgE结合，从而可代替天然的葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP用于临床诊断及致敏原组分筛查。

根据本发明的进一步实施例，在步骤(2)中，PCR扩增的引物为：

SCP-F：5’-ATGGATTACCTGAATAAGAAATGGA-3’；

SCP-R：5’-AAATCCCTCCTTGAAAGCTTCCATG-3’。

在本发明的第六方面中，根据本发明实施例，本发明还提出了一种重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白，其采用上述制备重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白的方法制得。

在本发明的第七方面中，根据本发明实施例，本发明还提出了上述葡萄牙牡蛎致敏蛋白在致敏原组分SCP筛查中的应用。

根据本发明的实施例，所述葡萄牙牡蛎致敏蛋白用于临床的免疫印迹检测、ELISA检测或皮肤点刺试验检测。

根据本发明的实施例，通过上述的葡萄牙牡蛎致敏蛋白应用于致敏原组分SCP筛查中，可诊断筛查出使患者引发过敏症状的致敏原组分为SCP，有利于使患者针对SCP的过敏性疾病的防控和治疗。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP的SDS-PAGE分析；

图2为葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP的质谱鉴定；

图3为阳性克隆子的菌落PCR验证；

图4为重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP多克隆抗体的SDS-PAGE、Western-blot分析；

图5为葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP、rSCP各与5名贝类过敏患者血清Dot-blot分析。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实施例1葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP的纯化、质谱鉴定及抗体制备

1.取新鲜葡萄牙牡蛎去除内脏、性腺等，留肌肉部分，加入10倍体积的Buffer A(10mM PBS，0.15M NaCl，pH 7.5)缓冲液，用组织捣碎机进行组织捣碎，采用冷冻离心机进行离心(12000g，10min，4℃)；离心上清过绢布，缓慢加入70％硫酸铵进行盐析，冰浴搅拌30min，4℃静置2h，离心(12000g，10min，4℃)；离心上清过绢布，缓慢加入90％硫酸铵进行盐析，冰浴搅拌30min，4℃静置2h，离心(12000g，10min，4℃)；将离心上清透析于20mM TrisHCl(pH 7.5)，4℃透析过夜，所得样品置于3kDa超滤管浓缩，后上样于Buffer B(20mM TrisHCl，pH 7.5)平衡好的Q-Sepharose柱；进而用Buffer B(20mM Tris HCl，pH 7.5)进行流洗，用含0-0.15mol/L NaCl、0.15mol/L NaCl、0.15-0.3mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl的Buffer B(20mM Tris HCl，pH 7.5)缓冲液以0.5mL/min流速进行线性梯度洗脱，洗脱至无蛋白流出，收集纯化部分得到在梯度洗脱区间0-0.15mol/L NaCl Buffer B(20mM TrisHCl，pH 7.5)缓冲液洗脱后期，至0.15mol/L NaCl缓冲液恒定洗脱前期的阶段有目的蛋白单一条带洗脱出，通过SDS-PAGE分析，将目的蛋白含量较高部分收集，即为葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP。

2.葡萄牙牡蛎致敏蛋白的质谱鉴定：切取图1中SCP泳道对应SCP蛋白的胶条，分子量约为20kDa，送往微纳菲生物技术有限公司(中国，广东，深圳)进行质谱分析。利用MALDI-TOF/TOF蛋白鉴定技术对蛋白进行蛋白鉴定；结果如图2，由图2可知，经鉴定得到的有效肽段匹配到太平洋牡蛎SCP蛋白完整氨基酸序列的88％，即确定该致敏蛋白是葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP。

3.葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP的多克隆抗体制备：将得到的100μg葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP免疫新西兰大白兔(体重约2kg)；免疫时抗原SCP按免疫剂量稀释至300μL，并混合300μL弗氏佐剂(初次免疫用弗氏完全佐剂，第二、三次免疫用弗氏不完全佐剂)，乳化，用注射器多点注射在兔子的颈背部皮下；初次免疫后隔两周进行二次免疫，一周后进行三次免疫；一周后耳缘静脉取血，测定抗血清效价；若效价未达到要求，继续免疫；若效价达到要求，耳静脉注射SCP，冲击免疫1次，5天后颈动脉采血；血浆于37℃水浴处理1h，4℃放置过夜，让血浆凝固析出血清，离心，上清即为多克隆抗体。

实施例2重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP的克隆表达、纯化及鉴定

1.提取总RNA：葡萄牙牡蛎总RNA的提取按

Super总RNA提取试剂盒说明书方法，提取的RNA在检测其浓度和纯度后贮存于-70℃备用。

2.合成cDNA：第一链cDNA的合成按照PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA合成试剂盒说明书方法：调整RNA至适宜浓度后，按表1体系配制mix-1后混匀，于65℃加热5min，加热结束后立即冰浴。在mix-1加热时，配制mix-2，将加热好的mix-1与mix-2温和混匀后，按照表2反应条件合成第一链cDNA。合成的第一链cDNA贮存于-20℃备用。

表1 mix-1和mix-2配制表

表2 cDNA合成反应条件

3.引物设计：在美国国立生物技术信息中心数据库(National Center forBiotechnology Information,NCBI)的GenBank中检索SCP的相关基因序列设计引物。利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物并进行合成，用于扩增葡萄牙牡蛎SCP核酸链。

表3 基因克隆所用引物

4.目的基因的获得：以上述获得的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如表4，PCR扩增条件如表5，获得葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因片段(SEQ ID NO：2)；

表4 PCR反应体系

表5 PCR扩增条件

5.载体构建

a.目的基因(上述的葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因片段)与克隆载体连接：回收产物(目的基因)与pEASY-T1克隆载体的连接采用5μL体系：回收产物4μL，pEASY-T1 1μL。充分混匀后将样品置于25℃下连接40min，得到连接产物。

b.重组子的转化：待大肠杆菌trans T1宿主于冰上融化后，向其中加入上述连接产物，冰浴30min。用42℃水浴热激trans T1宿主120s并迅速放入冰浴中静置2min。将冰浴后的宿主加入250μL LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养1h，涂布于含氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体培养基，于37℃倒置培养过夜。

c.阳性克隆子的筛选及测序：在过夜培养的平板上挑取单菌落进行菌落PCR验证，PCR反应体系如表5，结果如图3所示，选取PCR产物分子量正确、条带单一、明亮的克隆子进行测序。

d.质粒提取：将测序正确的克隆子接种于含有1mmol/L Amp的LB液体培养基，大肠杆菌表达载体(pET-22b)宿主接种于另一个含有1mM Amp的LB液体培养基，将两者同时置于37℃，200rpm下摇床培养至OD₆₀₀≈0.8，离心(10000g，1min)回收菌体，按照天根质粒小提试剂盒说明书提取质粒。

e.质粒双酶切：阳性克隆子和pET-22b宿主质粒双酶(Nde I、Sal I)切采用20μL体系(表6)，于37℃下进行，选取的酶切时间为45min，酶切结束后利用Universal DNA纯化回收试剂盒回收载体和目的基因片段。

酶切位点引物为：

SCP-F：5’-CATATGATGGATTACCTGAATAAGA-3’(SEQ ID NO：5)；

SCP-R：5’-GTCGACAAATCCCTCCTTGAAAGCT-3’(SEQ ID NO：6)。

表6 双酶切反应体系

f.表达载体与目的基因的连接及转化：目的基因与pET-22b载体的连接体系5μL：pET-22b 1μL，目的基因2μL，T4 1μL，buffer 1μL置于16℃连接过夜。连接产物按照步骤b的方法转化大肠杆菌表达宿主BL21，并进行菌落PCR验证和测序。

g.rScy p 9蛋白诱导表达：将测序正确的阳性质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞后，接种至20mL含1mmol/L Amp的LB培养液中，37℃震荡培养过夜。次日1∶100比例将5mL上述培养液转接于500mL含1mmol/LAmp的LB培养液中，于37℃培养至对数生长期(OD₆₀₀＝0.6～0.8)，加入终浓度为1mmol/L IPTG，37℃诱导4h后离心(12000g，20min)，收集细菌；经Tris-HCl洗涤、离心、重悬于30mL冰预冷的裂解缓冲液(200mmol/L Tris-HCl、200mmol/LNaCl，pH 8.0)、超声破菌，离心(12000g，30min)，收集上清，进行SDS-PAGE分析，并用多克隆抗体进行验证。

6.重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP的多克隆抗体免疫印迹

免疫印迹所使用标准蛋白为Prestained Maker，采用半干转转膜的方式进行免疫印迹实验，其主要步骤如下：

a.上述SDS-PAGE电泳结束后，拆下胶板，取出凝胶，根据目的蛋白对凝胶进行切割，浸泡在蛋白质转移液中；

b.根据要转膜的凝胶大小，剪好与同等大小的硝酸纤维素膜、滤纸(8张)；硝酸纤维素膜、滤纸用蛋白质转移液浸湿，从下往上分别为四层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶和四层滤纸，并赶走气泡，使其保持平滑；装好电转移装置，接通电流，根据分子量的大小，确定转膜的时间27min；

c.电转移时间结束，断开电流，取出硝酸纤维素膜；

d.硝酸纤维素膜出现标准蛋白条带，说明转膜成功，将硝酸纤维素膜置于5％脱脂奶并于脱色摇床上封闭1.5h。

e.倒掉封闭液，TBST洗3次，每次5min，加一抗(上述实施例1获得的SCP多克隆抗体)室温孵育1-2h；

f.TBST洗5次，每次5min，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗室温孵育1-2h；

g.TBST洗7次，每次7min后，显色；

h.ECL显色：将显色A液和B液混合均匀，加入适当量过氧化氢催化反应，与硝酸纤维素膜反应2min，进行化学发光显色。

结果如图4所示，该重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP与天然纯化的葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP处于同一条带位置。

实施例3葡萄牙牡蛎致敏蛋白在临床诊断中的应用

硝酸纤维素膜裁剪：将硝酸纤维素膜裁剪为长7.7cm，宽4.2cm的长方形，并在膜上画每格0.7×0.7cm大小的方格，共66格。

致敏蛋白点样：将实施例1纯化的葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP和实施例2的致敏蛋白rSCP均调整至蛋白浓度为1mg/mL，每格取2μL直接点样于硝酸纤维素膜，并静置晾干。

硝酸纤维素膜封闭：将晾干后的硝酸纤维素膜浸泡于5％的脱脂奶中，置于摇床上室温孵育1.5h。

血清孵育：封闭后硝酸纤维素膜用TBST洗3次，每次5min，将膜中血清对应的方格剪下分别用血清与TBST以1:4稀释的对应的5名贝类过敏患者血清，置于摇床上室温孵育1.5-2h。

二抗孵育：将浸泡于血清溶液中的硝酸纤维素膜取出，用TBST洗5次，每次5min，再用TBST以1:20000稀释的HRP标记的羊抗人IgE二抗，在摇床上室温孵育1.5-2h。

化学发光显色：二抗孵育结束后硝酸纤维素膜用TBST洗7次，每次7min，将膜放置于配好的显色液中室温避光孵育2min后取出，用化学发光荧光凝胶成像仪拍照；结果如图5，BSA为阴性对照组，NS为未致敏血清。

由图5可知，纯化的葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP与rSCP与5名贝类过敏患者血清均存在特异性IgE结合，则诊断筛查出使这些患者引发过敏症状的致敏原组分为SCP。

综上所述，根据本发明的葡萄牙牡蛎致敏蛋白的分离纯化方法，可获得葡萄牙牡蛎致敏蛋白SCP；根据本发明的葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因克隆入原核表达载体，构建重组表达质粒，再转入宿主菌并诱导其表达，可获得重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP，该致敏蛋白可与贝类过敏患者血清的特异性IgE结合，从而可代替天然SCP用于临床诊断及致敏原组分筛查。可为过敏症状的临床诊断及致敏原详细筛查提供依据，使得针对SCP的过敏性疾病的防控和治疗及时。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 集美大学

<120> 一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白及其应用

<130> 2019

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Tyr Leu Asn Lys Lys Trp Lys Ile Trp Tyr Asn Ser Leu Asp

1 5 10 15

Val Asn His Asp Gly Lys Ile Ser Ile Glu Asp Val Glu Glu Ser Arg

20 25 30

Asn Lys Phe Thr Asn Leu His Glu Leu Val Gly Asp Lys Ala Lys Gly

35 40 45

Val Gln Val Asn Phe Glu Asp Trp Trp Asn Lys Tyr Ile Phe Arg Thr

50 55 60

Gly Ala Gly Lys Glu Ile Ser Glu Ser Glu Phe Val Gln Gln Leu Thr

65 70 75 80

Glu Ala Tyr Lys Lys Asp Lys Val Gly Phe Ile Lys Glu Met Gln Ala

85 90 95

Cys Phe Asp Cys Ile Phe Asp Val Ile Asp Thr Asn Lys Asp Arg Thr

100 105 110

Ile Asp Glu Asp Glu Phe Val Tyr Ala Phe Lys Ala Phe Gly His Glu

115 120 125

Asn Glu Ala Leu Val Arg Lys Ala Phe Ser Leu Tyr Asn Lys Glu Asn

130 135 140

Lys His Val Pro Leu Lys Asp Ile Val Ser Glu Trp Val Lys Phe Val

145 150 155 160

Thr Glu Glu Asp Thr Gly Lys Lys Asp Ile Ile Met Glu Ala Phe Lys

165 170 175

Glu Gly Phe

<210> 2

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggattacc tgaataagaa atggaaaatc tggtacaact ctctggacgt caaccatgat 60

ggcaaaatct ccattgagga cgtcgaggag tccaggaaca aattcaccaa ccttcacgag 120

ctggttggag acaaagccaa aggtgtccag gtcaattttg aagactggtg gaacaaatac 180

atctttagaa ctggggctgg aaaggaaatc tcggagagcg agttcgtcca gcagttaacg 240

gaagcttaca agaaagacaa agtcggcttt atcaaggaaa tgcaagcatg ctttgattgc 300

atcttcgacg tcattgatac aaacaaggat cgcaccattg acgaggatga gtttgtctac 360

gcattcaaag cttttggaca cgaaaacgag gctctggtta gaaaagcgtt ttctctttac 420

aacaaagaaa acaaacacgt ccctttaaaa gacattgtca gcgaatgggt taagtttgtc 480

actgaggaag acaccggcaa aaaagacatc atcatggaag ctttcaagga gggattt 537

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggattacc tgaataagaa atgga 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaatccctcc ttgaaagctt ccatg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catatgatgg attacctgaa taaga 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcgacaaat ccctccttga aagct 25

Claims

1.一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种多克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1所述的葡萄牙牡蛎致敏蛋白作为抗原免疫新西兰白兔后，对新西兰白兔颈动脉采血获得。

3.一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的葡萄牙牡蛎致敏蛋白。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸系列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种重组质粒，其特征在于，包含如权利要求4所述的编码基因。

6.一种制备重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从葡萄牙牡蛎肌肉组织中提取总RNA，反转录成cDNA；

(2)以cDNA为模板进行PCR扩增，获得如权利要求4所述的葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因；

(4)将所述重组质粒转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白；

(5)将步骤(4)获得的纯化蛋白经权利要求2所述的多克隆抗体鉴定，即获得重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，PCR扩增的引物为：

SCP-F：5’-ATGGATTACCTGAATAAGAAATGGA-3’；

SCP-R：5’-AAATCCCTCCTTGAAAGCTTCCATG-3’。

8.一种重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白，其特征在于，采用如权利要求6或7所述的制备重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白的方法制得。

9.如权利要求1所述的葡萄牙牡蛎致敏蛋白在致敏原组分SCP筛查中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述葡萄牙牡蛎致敏蛋白用于临床的免疫印迹检测、ELISA检测或皮肤点刺试验检测。