CN1209840A

CN1209840A - 新型CREBa同型体

Info

Publication number: CN1209840A
Application number: CN97191785A
Authority: CN
Inventors: K·S·克甘
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 1999-03-03
Also published as: US5854016A; US5959079A; EP0876485A2; JP2000505652A; AU733874B2; AU4652497A; WO1998012910A2; US6248532B1; WO1998012910A3; US20020197712A1; CA2236154A1

Abstract

本发明一般涉及新型CREBa多肽同型体、编码该多肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达构建物、用该多核苷酸转化或转染的宿主细胞、生产该多肽的方法和CREBa和其它多肽或多核苷酸之间结合的抑制剂的鉴定方法。

Description

新型CREBa同型体

本发明的领域

本发明涉及新型的编码与cAMP调节DNA序列相结合的多肽的多核苷酸。

发明背景

导致特定基因表达的胞外信号传导通常是通过一系列的酶促反应进行的，这些酶促反应最终调节核转录因子的活性。在这样一个例子中，胞外信号改变3’,5’-单磷酸腺苷(cAMP)的胞质水平，cAMP再调节依赖于活性cAMP的蛋白激酶(PKA)的水平。PKA一旦被激活，就迁移到核内，使一些转录因子磷酸化，这些转录因子识别通过cAMP信号传递途径调节的基因所共用的DNA序列。允许cAMP调节基因表达的共同DNA序列被称为cAMP调节元件(CRE)，识别并与CRE结合的转录因子被称为CRE-结合(CREB)蛋白。已经提出，CREB蛋白一般是以与CRE DNA序列结合的形式被发现的，CREB的磷酸化状态决定该蛋白能够诱导相关基因转录的程度。CREB一旦磷酸化后，则能与CREB-结合蛋白(CBP)结合，这能允许该复合物与转录因子TFIIB相互作用。

因此，显而易见，CREB磷酸化状态的调节对由cAMP控制的特定基因的表达起关键作用。但是CREB磷酸化状态不是仅仅由PKA调节，相反，CREB的磷酸化程度在磷酸酶活性和非PKA激酶的活性之间平衡。因此，尽管CREB是协调cAMP基因表达的主要参与者，但CREB的活性受到另外的非cAMP相关途径的酶的并存性调节。

CREB家族中的蛋白成员包含行使与转录活化相关的专一性功能的保守区。在羧基末端，所有的CREB蛋白都有一亮氨酸拉链区，该区允许CREB与其它CREB蛋白或其它异源转录因子亚基二聚化。邻近亮氨酸拉链区，CREB蛋白的特征为一称为激酶诱导域(KID)的区域，KID被多个非PKA激酶磷酸化，这些激酶包括例如蛋白激酶C(PKC)、酪蛋白激酶Ⅰ(CKⅠ)和酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)、可能还有依赖钙-钙调蛋白的激酶Ⅰ和Ⅱ。在氨基末端，CREB蛋白每个包含一富含碱性氨基酸的DNA结合域，尽管该家族的蛋白质之间存在表面上的细微差异，但基因表达上的变异的报道启示这些蛋白质有独特的生理作用。

本发明简述

一方面，本发明提供了纯化的和分离的多核苷酸(如DNA序列、其RNA转录物和其反义寡核苷酸)，这些多核苷酸编码一种新型的小鼠cAMP调节元件结合物，称为mCREBa；本发明还提供多肽和多肽变异体(包括片段和缺失、置换、和插入类似物)，它们表现出一种或多种DNA或蛋白结合活性，一种或多种特定基因转录调节活性和/或对mCREBa专一的免疫活性。DNA结合性质包括识别特定DNA序列，通过这些序列mCREBa能够调节特定基因的表达，而蛋白结合性质包括与不同的mCREBa活性调节剂(包括任何一类蛋白激酶中的任一种)相互作用，以及与专一性和非专一性转录物的相互作用。本发明的推荐DNA序列包括基因组和cDNA序列，而且包括完全或部分化学合成的DNA序列。SEQ ID NO:1中提出了目前优选的多核苷酸。在大肠杆菌菌株DH5αF’中包含本发明优选cDNA的pBRmb3质粒，该菌种于1996年9月18日存放在美国类型培养物保藏中心，12301Parklawn Drive,Rockville，马里兰20852，指定登记号为98171。设想了本发明DNA序列的生物复制品(如在体内或体外制得的分离的DNA序列的复制品)。也提供自主复制型重组表达构建物，如加入mRCERa序列的质粒和病毒DNA载体，特别是其中编码mCREBa或mCREBa变异体的DNA与外源性或内源性表达控制DNA序列操作上相连的载体。

按照本发明的另一方面，宿主细胞，特别是单细胞宿主细胞如原核和真核细胞，以允许所需多核苷酸在其中表达的方式稳定地被本发明的DNA序列转化。本发明的宿主细胞在大规模地生产mCREBa和mCREBa变异体的方法中非常有用，其中细胞生长在合适的培养基中，从细胞或细胞生长的培养基中分离所需的多肽产物。

本发明的新型mCREBa多肽能从自然细胞来源分离得到，但是，和mCREBa变异体产物一起，最好用涉及本发明宿主细胞的重组方法来生产。SEQ ID NO:2中提出了目前推荐的mCREBa多肽的氨基酸序列。重组产物能以完全或部分磷酸化或脱磷酸化的形式获得，这取决于选择用于重组体表达和/或分离后加工的细胞。本发明的mCREBa变异体可以包含mCREBa片段，该片段包括一个或多个具有mCREBa生物学或免疫学性质的全部或部分区域，这些性质包括例如与mCREBa多肽或多核苷酸结合配体的结合能力和/或抑制mCREBa与天然结合配体结合的能力。本发明的mCREBa变异体也可以包含其中的一个或多个特定氨基酸缺失或置换的多肽类似物：(1)mCREBa特有的一种或多种生物活性或免疫学特征没有丧失，最好是有所提高；或(2)一个特定的多肽/多肽或多肽/多核苷酸结合功能的专一性失活。设想包括促进多聚体形成的插入氨基酸(如赖氨酸或胱氨酸)残基的类似多肽。变异mCREBa多肽还包括其中的全部或部分mCREBa与外源多肽序列一起表达的融合多肽，外源多肽序列包括但不局限于例如多组氨酸标记、生物素化标记、β-半乳糖苷酶嵌合体或包括一个或多个来源于不同转录因子的DNA结合域或反式激活域的嵌合多肽。

本发明也包括抗体物质(如单克隆抗体和多克隆抗体、抗体片段、单链抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体和类似物)和对mCREBa或mCREBa变异体专一性(即对以前鉴定的与mCREBa在结构上有关联的mCREBa同型体为非反应活性)的其它结合蛋白(如多肽和肽)。抗体物质能通过分离的天然或重组mCREBa或mCREBa变异体得到。本发明的结合蛋白另外还能用于DNA或多肽结合位点的特征记述(如抗原决定部位和/或mCREBa氨基酸序列中修饰的结合性质的敏感性)。

结合蛋白同样也用于免疫组合物以及用于纯化本发明的多肽和鉴定表达细胞表面多肽的细胞的组合物。它们也在调节(如阻断、抑制或刺激)DNA和/或多肽结合生物学活性上有显著的应用价值，结合生物学活性包括mCREBa，特别是那些参与专一性和非专一性基因表达的mCREBa效应物功能。也设想了抗-mCREBa抗体物质专一性的抗个体基因型抗体和这些抗个体基因型抗体物质在调节基因表达中的用途。体液(如血清或脑脊液)中的mCREBa的检测和定量分析可能涉及例如单个抗体物质或“三明治”分析形式的多种抗体物质。

通过公开本发明的DNA序列和氨基酸序列所带来的信息的科学价值是明显的。作为一系列的例子，mCREBa的cDNA序列的知识使得能够通过DNA/DNA杂交来分离编码nCREBa的基因组DNA序列和专一化的mCREBa表达控制调节序列，如启动子、操纵子和相似物。用本发明的DNA序列在严格条件下进行的DNA/RNA杂交方法同样预期允许分离编码mCREBa等位变异体的DNA、享有一个或多个mCREBa特有的生物学和/或免疫学性质的其它结构相关蛋白、来源于其它物种的mCREBa同源蛋白。本发明的DNA可用于检测细胞表达mCREba的能力的DNA/RNA杂交分析。本发明使得可利用与调节通常表达mCREBa的那些细胞表达mCREba的相关反义多核苷酸。作为另一系列的例子，mCREBa的DNA序列和氨基酸序列的知识使通过重组手段生产mCREBa变异体成为可能，这些变异体如：以与不同外源多肽序列相联系的mCREBa蛋白序列的存在为特征的杂种融合蛋白。

本发明的DNA也使得能够用大量熟知技术中的任一种鉴定编码mCREBa结合配体多肽的新型基因，这些技术包括例双杂种筛选和凝胶覆盖分析。本发明提供的DNA和氨基酸序列信息也能使mCREBa的结构和功能的系统分析和与mCREBa互作的那些分子的鉴定成为可能。本发明的抗-mCREBa单克隆抗体的独特型代表这类分子，而且可以模拟天然结合蛋白(肽和多肽)，通过这些蛋白调节mCREBa的生物活性，或mCREBa通过这些蛋白调节细胞内事件。或者，它们可以代表几类新的mCREBa活性调节剂。抗-个体基因型抗体同样可以代表几类新的生物学活性的mCREba等价物。在鉴定抗体或调节mCREBa活性的其它化合物的体外分析中可能涉及例如固定mCREBa或与mCREBa结合的一天然结合多肽或多核苷酸，可检测地标记非固定化的结合配体，将结合配体一起保温并确定试验化合物对标记结合量的作用，其中与试验化合物不存在的情况下标记结合量相比，在试验的化合物存在情况下标记结合量的降低表明：该试验因子是一种mCREBa结合抑制剂。

在可采用的选择方法中，本发明的DNA允许通过(though)利用一种分裂杂种分析，鉴定mCREBa与其它天然结合配体结合的抑制剂，其中mCREBa或其蛋白结合域片段在宿主细胞中作为一种融合蛋白，与一种或多种转录因子的或一DNA结合域或一反式激活域相结合表达。mCREBa的一天然结合配体在同一宿主细胞中也作为融合蛋白，与一种或多种转录因子的一DNA结合域或反式激活域相结合(无论哪个区域都不加入mCREBa融合蛋白中)表达。两种融合蛋白的表达和随后的结合配体的联合，允许DNA结合域和反式激活域联合，形成一个导致阻遏蛋白表达的活性转录物。表达的阻遏蛋白同再阻碍报告基因的表达，因此显著降低宿主细胞的生存。然后，由此转化的宿主细胞可以与假定的mCREBa/结合配体相互作用的抑制剂和鉴定为阻止mCREBa与其配体蛋白结合的那些真正的抑制剂接触，因而能阻止不能阻断报告人基因表达的阻遏蛋白的表达。因此一个抑制剂间接地提供通过特定报告基因产物的表达和检测产生的正信号。至少有三种不同类型的文库用于小分子调节剂的鉴定。这些包括(1)化学文库，(2)天然产物文库和(3)包含随机肽、寡核苷酸或有机分子的联合文库。化学文库包括已知化合物的结构类似物或通过天然产物筛选鉴定为抑制剂的化合物。天然产物文库为微生物、动物、植物或海洋生物的集合，这些生物通过(1)土壤、植物或海洋微生物的液体培养基的发酵和提取或(2)植物或海洋微生物的提取，用于生产用于筛选的混合物。联合文库由大量作为混合物的肽、寡核苷酸、有机化合物组成。它们相对容易地用传统的自动合成方法、PCR克隆、或适当的合成方法制得。特别有意义的是肽和寡核苷酸的联合文库。其它有意义的文库包括肽、蛋白质、肽模拟物、多平行合成收集物、联合物、多肽文库。

本发明提供的DNA序列信息还使得用同源重组或“剔除”方法来生产[见如Kapecehi,Science,244:1288-1292(1989)]不能表达功能性mCREBa蛋白或表达变异mCREBa蛋白的啮齿动物或兔成为可能。这类啮齿动物可用作模型，用于体内mCREBa和mCREBa调节剂活性的研究。

本发明的详细概述

本发明通过以下实施例来说明。实施例1描述一种编码一新型蛋白质的部分cDNA的分离，该分离借助于该蛋白质与CKIδ相互作用而进行。实施例2提供该新型蛋白质和CKIδ之间相互作用的进一步特征记述。实施例3涉及检测新型mCREBa多肽的组织分布。实施例4论述了编码mCREBa的全长cDNA的分离。实施例5描述了mCREBa免疫专一性的抗体的生产。实施例6涉及mCREBa的重组表达。实施例7描述了mCREBa的DNA结合位点的鉴定。实施例8涉及用于鉴定mCREBa/DNA结合活性的调节剂的高通过量筛选分析的产生。实施例9论述了在分裂杂种分析中使用mCREBa鉴定mCREBa/蛋白质相互作用的抑制剂。

实施例1

分离编码一种与CKⅠδ相互作用的蛋白质的cDNA

为了分离编码与CKⅠδ相互作用的蛋白质的cDNAs，采用编码一LexA-CKIδ融合蛋白的表达载体作为诱饵，使用双杂种筛选方法。将编码CKIδ的DNA亚克隆到pBTM116的BamHⅠ位点上[Bartel等，Cellular Interactions in Development:a Pratical Approach.Hartlev(编辑)，IRL出版；牛津，第153-179页(1993)]。CKIδHU的编码区最初用引物EC 140(SEQ ID NO:3)和EC141(SEQ ID NO:4)，通过PCR法修饰加入BamHⅠ限制位点上，这产生一1.3kbp的DNA片段。CGCGGATCCTAATGGAGCTGAGAGTCGGG SEQ ID NO:3CGCGGATCCGCTCATCGGTGCACGACAGA SEQ ID NO:4

扩增反应包括300ng CKⅠδHU模板DNA、1×PCR缓冲液(PerkinElmer-Cetus)、1.5mM MgCl₂、200μM的每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP、每种引物10ng/ml和1单位的AmpliTag(Perkin Elmer-Cetus)。反应的进行最初是在94℃下保温4分钟，接着在94℃保温1分钟、50℃保温2分钟、72℃保温4分钟共30个循环，得到的PCR产物用BamHⅠ消化，再连接到pASl质粒中[Durfee等，Genes andDevelopment 7:555-567(1993)]，使得该编码的蛋白质被表达，该蛋白质包含一流感血凝素(HA)抗原决定基标记。产生的质粒用标准方法转化到大肠杆菌中，以针对HA抗原决定基免疫专一性的单克隆抗体12CA7(Boehringer Mannheim)，通过免疫印迹来确认CKⅠδ融合蛋白的表达。编码CKⅠδ的BamHⅠ片段随后亚克隆到pBTM116的BamHⅠ位点上，得到质粒pBTMCKⅠδ，将该质粒转化到一啤酒酵母菌株L40(MATa his3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade LYS2∷(lexAop)₄HIS3URA3∷(lexAop)₈-lacZ GAL4)中，产生菌株CKⅠδ/L40。用从第9.5和10.5天的鼠胚胎得到的cDNA文库来大规模地转化CKⅠδ/L40。按照Hollenberg等人的方法[Mol.Cell.Biol.,15:3813-3822(1995)]，在载体pVP16中制备cDNA文库。用在缺乏亮氨酸和色氨酸的培养基中生存的方法来确认，得到大约4千万个转化体。

通过平板接种到缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的选择性培养基上，分析8千8百万个转化体的蛋白质/蛋白质相互作用。酵母在无组氨酸情况下生长的能力启示，CKⅠδ和文库序列编码的蛋白质间存在相互作用。进一步用标准方法筛选能够在缺乏组氨酸的培养基中生长的菌落在在LexA操纵子转录控制下表达一基因编码的β-半乳糖苷酶的能力。100个最迅速变蓝的酵母菌落生长在缺乏亮氨酸和色氨酸的液体培养基中，用标准方法制备酵母总DNA。该酵母总DNA用来转化大肠杆菌菌株C600，该菌株没有在缺乏亮氨酸的培养基中生长的能力，除非存在一个表达亮氨酸的质粒。将细菌平板接种到含有羧苄青霉素(一种氨苄青霉素衍生物)、缺乏亮氨酸的琼脂上。培养在这种条件下生长的单个菌落，制备质粒DNA。

因为可能产生许多假阳性，因此再测试阳性质粒与LexA-CKⅠδ融合蛋白的相互作用以及与作为阴性对照的LexA-核纤层蛋白融合蛋白的相互作用。简要地说，分离的cDNA文库质粒与一个或者编码LexA-CKⅠδ或者编码LexA-核纤层蛋白的质粒一起共转化到L40中，将从每种转化得到的三个酵母菌落挑选出来，并用标准β-半乳糖苷酶蓝/白分析法来检测。培养用LexA-CKⅠδ处理变蓝、用LexA-核纤层蛋白处理不变蓝的细胞，分离DNA质粒，用标准方法测定序列。国家生物技术信息数据库中心的研究说明：得到了三类cDNA。这些DNA所编码的蛋白质已集合性地被命名为CKⅠδ-δ-互作蛋白(CKⅠδ-delta-interacting proteins)或DIPS。

一类cDNA以命名为DIP25的克隆为典型，包含下述cDNA的一部分，该cDNA与果蝇转录因子dCREBa有关联，但不等同于它。因此该全长克隆被称为mCREBa，包含CREB蛋白特征性的两个独特的氨基酸基元。一个富含碱性氨基酸、推测为DNA结合区的区域位于氨基末端，而在羧基末端发现一个亮氨酸拉链区。第二类DNA几乎等同于一个EST克隆T81950，而第三类DNA显示与数据库中的任何序列都没有同源性。

实施例2

mCREBa DIP25克隆和CKⅠδ之间相互作用的特征记述

为了进一步找到CKⅠδ和mCREBa DIP25片段之间相互作用的特征，该小鼠类克隆在大肠杆菌中作为GST融合蛋白被表达，描述如下。

DIP25编码DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ消化，分离大约500 bp的片段，然后连接到先前用BamHⅠ和EcoRⅠ消化的质粒pGEX3T上(Pharmacia，城市，州)。将得到的质粒转化到大肠杆菌中，将0.2mM的IPTC加到培养基中来诱导蛋白质表达，表达大约45kda的GST-DIP25蛋白。通过吸附到谷胱甘肽琼脂糖(Pharmacia)来纯化蛋白质，并如下用来评价DIP25与CKⅠδ在体外的结合。

重组体CKⅠδ在大肠杆菌中作为一个组氨酸标记融合蛋白来生产，[Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley &Sons(1993)，第10.11.8-10.11.22页]。简要地说，将CKⅠδ克隆到表达载体pET15b(Novagen)中。通过定点诱变在CKⅠδ的5′末端产生一个NdeⅠ限制位点，并将一个NdeⅠ/BamHⅠCKⅠδ片段连接到已用相同的两种酶消化过的pET15b上。用一命名为KME18(SEQ ID NO:10)的寡核苷酸，采用Mutagene Phagemid体外诱变试剂盒2版(BioRad)，按照生产商建议的方案，进行定点诱变。GAATCGGGCCGCCGAGATCTCATATGGAGCTGAGAGTC

SEQ ID NO:10

将产生的质粒转化到细菌菌株BL21DE3中，当细胞生长到光密度为0.6时，细胞用1mM IPTG在25℃诱变18小时，收获细胞，将其重悬浮在一破裂缓冲液(break buffer)中(含20mM NaPO₄,pH8、300mMNaCl、1mM PMSF、1μM aprotein和1μM亮抑酶肽)，在弗氏压碎器中裂解。裂解液在100,000×g下离心60分钟，将上清液加到Ni-NAT-琼脂糖层析柱中(QIAGEN，德国)。层析柱用破裂缓冲液冲洗，蛋白质用0-200mM的咪唑梯度洗脱。用50-80mM的咪唑洗脱出与CKⅠδ相关的CKⅠ活性部分。组氨酸标记的融合蛋白在4℃下，和固定在谷胱甘肽琼脂糖珠粒上的DIP25-GST融合蛋白一起在结合缓冲液(50mM NaCl,10mM Tris pH 7.5,10％甘油，0.1％Triton)中进行保温，保温1个小时后，珠粒在结合缓冲液中清洗三次，通过在SDS样品缓冲液(含有2％SDS、20mM Tris,pH 6.8、20％甘油和0.001％溴酚蓝)煮沸来洗脱结合蛋白。DIP25-GST融合蛋白的最小部分与组氨酸标记的CKⅠδ相连，而CKⅠδ不与阴性对照固定化GST单独结合。无效结合可以或者反映出GST融合蛋白的不适当折叠，或者它可以表明需要一些大肠杆菌不能进行的DIP25的翻译后修饰。

实施例3

mCREBa的组织分布

为了测定mCREBa mRNA的组织表达形式，用含有从不同鼠组织和从妊赈期中第7、11、15和17天的整个鼠胚胎分离的polyA+RNA的市售膜(Clontech,Palo Alto,CA)来进行Northern印迹分析。按照生产商建议方案，用引物mCR-1(SEQ ID NO:5)和mCR-2(SEQ ID NO:6)，用从mCREBa克隆通过PCR法产生的DNA来探测该膜。

GGAATTCGCTCAAGGAGAGTCCTATTGG (SEQ ID NO:6)

CGGGATCCTCACAGCTCCACATAAGCTGC (SEQ ID NO:5)

PCR包括作为模板的50ng DIP25 DNA、1×PCR缓冲液(Perkin-Elmer Centus)、1.5mM MgCl₂、200μm dATP、200μMdGTP、200μM dTTP、1μMdCTP、50μCiα³²p-dCTP、每种引物10ng/ml和1单位的AmpliTaq(Perkin-Elmer Cetus)。反应在PerKin-Elmer Centus 480型热循环仪中如下进行：最初的变性周期是在94℃进行4分钟，接着经过下面的20次循环反应，即在94℃反应15秒、60℃反应15秒和72℃反应30秒。未加入的核苷酸用Nuc-trap Push层析柱(Stratagene)来除掉。

检测到两种mRNA，其中一种迁移到大约8kb处，另一种迁移到大约3.75kb处。通常同时检测到两种mRNA，启示为两种剪接变异体。在该组织RNA膜上，在肾脏、肺和心脏能观察到最高水平的表达，在骨骼肌、肝、脑和睾丸中能观察到较低水平的表达。在该特定印迹上，在脾脏RNA检测到非常低水平的表达。在鼠胚胎样本中，8kb和3.5kb mRNA的表达在第7天为最高，第11天为最低。11天后监测到表达逐渐增加，直到第15天和第17天。

进行鼠胚胎的原位杂交，以确定哪些胚胎组织表达mCREBamRNA。收获正常的Balb/c鼠胚胎并包埋在最适宜温度的化合物中(Tissus Tech,EIkhart,IN)，整个胚胎以6微米的厚度切片。将组织切片放在Superfrost Plus^(VWR Scientific,Seattle,WA)上，让其在室温下过夜风干。不立即使用的切片随后存储于-70℃下。干燥后，切片于室温下在含有4％多聚甲醛的PBS中固定20分钟，以递增浓度(70％、90％和最后100％)的乙醇来脱水，在4℃下每种浓度脱水1分钟，在室温下风干。切片在一含有70％甲酰胺的2×SSC溶液中于70℃下变性处理2分钟。切片在4℃下在2×SSC中漂洗，然后按前面描述的再进行脱水和风干处理。用从鼠DIP25 DNA用³⁵S-dUTP(Amersham)体外转录制得的³⁵S-标记的单链mRNA来进行杂交。将标记的探针和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水加入到杂交缓冲液中，该杂交缓冲液含有50％甲酰胺、0.3 M NaCl、20 mM Tris,pH 7.5、10％硫酸葡聚糖、1×Denhardt、100 mM的二硫苏糖醇(DTT)和5mM EDTA。在加入之前，该探针溶液在95℃下加热3分钟使探针变性，每个组织切片加入20μl缓冲液，随后用无菌的、无RNA酶的盖玻片盖上，在50℃下过夜杂交。

杂交后，切片在室温下用含有10mMDTT的4×SSC缓冲液清洗1小时，然后在60℃下在含有50％去离子的甲酰胺、2×SSC和10mMDTT的缓冲液中洗涤40分钟，再在室温下在0.1×SSC缓冲液中清洗30分钟。切片用前面描述的方法进行脱水和风干处理，再在45℃下浸入用0.6M乙酸铵1∶1稀释的KodaK(Rochester，纽约)NTB2核乳胶中。玻片在暗处风干1-2小时，在4℃有干燥剂存在的情况下，在暗处曝光。曝光10天后，玻片在室温下在Kodak Dektol显影液中来显影，用去离子水冲洗然后浸没在Kodak固定液中4分钟。切片再用苏木精和曙红(Sigma,St.Louis,MO)复染色，该分析的结果见表1。

表1

鼠胚胎中mCREBa mRNA的表达

第15天第16天第17天第18天脊神经根 + + + +外周神经 + + + +后脑 +鼻区 + +视觉区 + + +脑的未鉴定区 + + +舌 +膀胱 + +肾脏 +肺 +

实施例4分离编码全长mCREBa的cDNA

为了得到编码mCREBa的全长cDNA，如上所述，用寡聚mCR-1和mCR-2，通过PCR从mCREBa DIP25克隆产生探针，用该探针通过杂交来筛选来源于鼠脑UniZAP XR cDNA文库(Strategene)的5.4×10⁶克隆。在下面的条件下进行杂交：其中将硝酸纤维素滤膜在65℃下在3×SSC、5X Denhart、0.1％sarkosyl、20mM NaPO₄,pH 6.8、100μg/ml的单链鲑精DNA中保温18小时。一克隆与该探针杂交。该cDNA称为pBSmb3，按照生产商建议的方案通过体内切割将其分离并经过微量测序。该cDNA的序列分析揭示了一个含有起始于304核苷酸、终止于1866核苷酸的开放读框的3190bp的克隆，预计其分子量大约为57 kda.。在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中分别提出该克隆的核苷酸序列和氨基酸序列。DIP25克隆相当于全长mCREBa克隆pBSmb3的核苷酸1010-1514，它编码代表该蛋白质的碱性DNA结合区和亮氨酸拉链区的237-405的氨基酸。将dCREBa亮氨酸拉链区的406-508氨基酸与mCREBa相应区域的260-361氨基酸进行比较，结果表明78％相同；这些区域核苷酸水平的比较表明：dCREBa的2202-2511核苷酸与mCREBa的1081-1386核苷酸的同源性为68％。用TNT试剂盒(Promega,Madison,Wiscosm)在体外转录和翻译该克隆，产生一种蛋白产物，该蛋白质比预计的分子量(大约75 kda)迁移稍慢，可能是高电荷的碱性DNA结合域或在亮氨酸拉链域中形成的二级结构所造成的。另外，用EcoRⅠ和XhoⅠ消化该质粒，产生1.8kb的片段，将其连接到已用同样的两种酶消化的pBluescript sk^-上，产生pBSmb3的亚克隆。得到的质粒命名为pBSmb3E/X。在体外该编码基因的转录和翻译导致一个大约75 kD多肽的产生，这提示了这种蛋白质的整个编码序列包含在该1.8kb的片段上。另外，氨基酸序列分析表明：与其它的CREB同型体相似，mCREBa可能潜在地被非CKⅠδ的激酶磷酸化，这些激酶包括但不局限于其它CKⅠ同型体、CKⅡ、cdc2、MAP激酶和S6激酶。

实施例5mCREBa抗体的生产和特征记述

用前面描述的质粒pGEX3T-DIP25的DIP25-GST表达产物，产生mCREBa专一性的多克隆抗体。简要地说，用质粒转化的C600细菌生长到在600nm处的吸收值为1.8时，在这时通过加入0.1mM作用于内源性tac启动子的IPTG来诱导DIP25-GST的表达，作用5个小时。诱导后，离心收获细菌，将其重悬浮于含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。细胞在弗氏压碎器中溶胞，并在12,000×g下离心20分钟。该上清液与3ml 50％谷胱苷肽-Sepharose 4B(Pharmacia)的浆液保温1小时，之后沉淀树脂，将其在PBS中清洗三次。用含50mM谷胱苷肽的10mM Tris,pH 8.0，将蛋白质从树脂上洗脱下来。

用200μg混有弗氏完全佐剂的DIP25-GST抗原，用多位点皮下注射的方法来初次免疫雌性新西兰白兔。随后用经过以下处理得到的蛋白质来进行加强，即蛋白质先在SDS样品缓冲液中煮沸，再加入到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再从凝胶切片上电洗脱下来。加强抗原制剂与弗氏不完全佐剂混合，在第一次免疫后以大约21天的间隔用药。在第3、4和5次免疫后放血取样。

免疫反应产生两个命名为6179和6144的多克隆抗血清。为了确定抗血清是否识别mCREBa，在体外有35S-蛋氨酸的情况下，用一TNT试剂盒(Promega)进行PBSmb3的体外转录和翻译。翻译提取物用NP40IBP(含1％Nonidet P40、50mM Tris,pH 7.5、100mM NaCl、1mMEDTA)稀释到0.5ml，于5μl兔抗血清在冰上保持小时。保持后，加入20μl 50％的A蛋白琼脂糖(Repligen)浆液，继续在冰上保持另外的20分钟。离心收集免疫复合物，并在NP40 IPB中清洗三次。通过在SDS样品缓冲液中煮沸，将蛋白质从复合物中洗脱下来，然后将蛋白质加到SDS聚丙烯酰胺凝胶中。分离后，该凝胶在乙酸和甲醇中固定，用荧光放大剂(Amersham)处理，干燥，对X胶片曝光。放射自显影的结果表明：两种抗血清都与前述pBSmb3E/X的79kDa表达产物反应。

为了确定抗血清是否与在哺乳动物细胞中表达的mCREBa反应，如下构建一个编码哺乳动物CREBa的表达质粒。用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ来消化亲代质粒pcDNA 3(Invitrogen)，再与上述pBSmb3/X的编码完整mCREBa蛋白的1.8kbp EcoRⅠ/XhoⅠ片段相连。得到的质粒用Chen和Okayama的方法[Biotechniques 6:632-638(1988)]用来瞬时转化一人类胚性肾细胞系293T。在含有1％Triton X-100、10mM Tris pH 7.6、5mM EDTA、50mM NaCl、30mM Na₄P₂O₇、50mM NaF、100μM Na₃VO₄、100mM PMSF、1μg/ml aprotein和1μg/ml亮抑酶肽的缓冲液中转化48小时后，得到细胞裂解液，在10,000×g下离心该裂解液。将100μg的澄清裂解液加到10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上，用标准技术产生免疫印迹。1∶1000稀释的两种抗血清都与用包含mCREBa序列的pcDNA3转化的细胞的裂解液中大约79kda的蛋白质反应。

实施例6

重组mCREBa的表达

当宿主细胞在有生物素的情况下生长时，一种修饰的Pinpoint表达载体(promega)允许生物素化蛋白质的表达，用这种载体在大肠杆菌中作为于一种蛋白的融合蛋白表达重组体mCREBa。简要地说，从pBSmb3中切下一个1.8kb的NcoⅠ/XhoⅠ片段，将其亚克隆到已用NcoⅠ和XhoⅠ消化过的表达质粒araBC中。产生的中间质粒包含在阿拉伯糖启动子的控制下的mCREBa编码序列。为了将一生物素标记融合到mCREBa上，将来自表达质粒arabiolb的EcoRⅠ/XhoⅠ启动子片段插入到中间质粒上，使得mCREBa编码序列在生物素标记的框内，并在阿拉伯糖操纵子的控制下。得到的质粒命名为arabiomCREBa。用标准技术，以arabiomCREBa来转化细菌，并在含有2μM生物素的Luria液体培养基中生长到对数中期。用1％的阿拉伯糖诱导生物素-mCREBa的表达，离心收获细菌，将片状沉淀物重悬浮在50mM Tris pH 8.0、100mM NaCl、1mMEDTA、5mMEGTA和1mMDTT中。在弗氏压碎器中裂解细胞，通过离心去除不溶物质，将上清液调整到150mMNaCl、5％甘油、0.1％吐温20、4mM DTT。加入链霉抗生物素蛋白-琼脂糖(Promega)，纯化生物素化mCREBa，并于4℃震荡保温4小时。用包含50mM Tris pH 8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、50mM EGTA和1mM DTT的缓冲液清洗结合蛋白三次。加入甘油使其最终浓度为10％，将结合到链霉抗生物素蛋白-琼脂糖上的生物素-mCREBa蛋白于-70℃贮存。

实施例7

确定mCREBa的DNA结合位点

按照Pollock和Treisman描述的[Nucleic Acid Res.18:6197-6204(1990)]允许快速地从随机寡核苷酸中鉴定蛋白质的DNA结合位点的结合位点选择法，确定mCREBa对DNA序列的结合专一性。为了进行mCREBa位点的结合位点选择法，将按上述描述制备的生物素-mCREBa蛋白和一个26个核苷酸的随机寡聚物一起进行保温，这种随机寡聚物的两侧是在PCR反应中，退火连接到寡核苷酸引物上的同源性核苷酸。随机寡核苷酸 SEQ ID NO:7

5’CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCG-

(A/G/C/T)26GAGGCGAATTCAGTGCAACTGCAGC-3’

在低离子强度的条件下进行结合反应，以避免破坏盐敏感性结合反应。含Dignam缓冲液D[Digman等，Nucl.Acids Res.11:1475-1489(1993)]和蛋白酶抑制剂、0.1％Nonidet P-40、1mg/ml的乙酰化牛血清白蛋白(Promega)的结合缓冲液与200ng的多聚(dIdC)-多聚(dIdC)(Pharmacia)、1pg生物素-mCREBa和0.4ng随机寡核苷酸一起在冰上保持30分钟，以允许蛋白质/DNA复合物形成。将链霉抗生物素蛋白琼脂糖加入到结合反应中，接下来在4℃震荡保温一整夜，离心收集形成的mCREBa/DNA复合物。用上面的结合缓冲液将复合物洗涤两次，通过在45℃下、含有200μl 5mM EDTA、0.5％SDS、100mM乙酸钠、50mM Tris,pH 8.0的缓冲溶液中保温，将DNA从复合物中洗脱下来。DNA用酚抽提，与作为载体的10μg的兔肌糖元(BoehringerMannheim)混合，用乙醇沉淀。用Cerenkov计数法来定量测定DNA的回收率。

回收的DNA在10μl PCR反应液中扩增，PCR反应液含有150μg每种引物F和R(分别是SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9),5μCi³²P-dCTP,20μM dCTP，各50μM的dATP、dGTP、dTTP,1mg/ml的牛血清白蛋白、1×PCR缓冲液(Perkin-Elmer Centus)、1.5mMMgCl₂和一单位的AmpliTaq(Perkin-Elmer Centus)。引物F SEQ ID NO:8

5’-CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCG-3’引物R SEQ ID NO:9

5’-GCTGCAGTTGCACTGAATTCGCCTC-3’

扩增反应的初次变性保温在94℃下进行4分钟，接着进行94℃1分钟、62℃1分钟、72℃1分钟的15次循环反应。PCR反应的产物通过在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳进行纯化，用来(代替随机寡核苷酸)按上述方法再次选择DNA结合序列。该过程可以重复3-4次。将DNA的最终产物用两侧有特定DNA结合位点的BamHⅠ和EcoRⅠ来消化处理，并将其克隆到载体pGL2-启动子(Promega)的多接头中的BamHⅠ和EcoRⅠ位点上。质粒pGL2启动子是一种在SV40早期启动子的控制下，表达萤火虫荧光素的载体，该载体具有SV40早期启动子上游多接头区，允许插入潜在的调节序列。产生的质粒经过DNA序列分析，以确定mCREBa的DNA结合位点的共有核苷酸序列。

用凝胶迁移率变化分析来确认mCREBa与特定序列的DNA结合。简要地说，纯化的生物素-mCREBa在23℃下，与含有上述鉴定的DNA结合位点的0.1pmol/μl³²p-标记的寡核苷酸一起在缓冲液中保温15分钟，该缓冲液含有50mM Tris pH8、50mM NaCl、50μMDDT、1mM EDTA、10％甘油、5mM MgCl₂、5mM亚精胺、0.05％Nondet p-40、3μg牛血清白蛋白和1μg多聚(dIdC)-多聚(dIdC)(Pharmacia)。经适当的保温后，将结合混合物加到一4％非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，通过与在没有mCREBa蛋白存在的情况下的对照DNA相比较，该DNA较高的分子量变化来证实mCREBa与一放射标记的DNA序列结合。

作为mCREBa与与前面鉴定的DNA序列结合的进一步特征，将含有mCREBa DNA结合位点的pGL2构建物与pcDNA3-mCREBa一起共转染到293T细胞中，确认被表达的mCREBa或激活或抑制报道构建物转录的能力。用Chen和Okyama的方法[见上述]转染细胞，48小时后收获细胞，按照生产商建议的方案用荧光素酶分析试剂盒(Promega)来测定荧光素酶活性。

实施例8

高通过量地筛选mCREBa结合活性的调节剂

小分子抑制剂(联合文库、天然产物文库，和/或化学文库)的高通过量筛选分析建立在上述确定的mCREBa的特定DNA结合位点的基础上。设计一个滤膜结合分析，在该分析中通过定量测定结合到固定在硝基纤维素滤膜上的蛋白质的放射性活性，监测重组mCREBa结合³²P-标记的DNA序列的能力。将³²p-标记的DNA设计得足够小，为了使其在没有已固定化的mCREBa的情况下不与硝酸纤维素结合。将假定调节剂与固定化蛋白质一起保温，DNA结合活性的调节剂鉴定为对于该DNA结合该蛋白的能力具有增强或降低作用的那些分子。

建立一个可供选择的分析，其中将重组生物素化mCREBa结合到涂有链霉抗生物素蛋白的平板(Pierce)上，与候补小分子调节剂和加入的³²p-标记的DNA序列一起保温。调节剂定义为能够增加或降低mCREBa与该标记DNA序列结合的那些分子。

二次分析包括用特定的调节剂处理用pGL2-启动子/DNA结合位点构建物转染的细胞，接着分析该报告基因产物的活性。

实施例9

鉴定与其它蛋白质结合的mCREBa调节剂

共同未决美国专利申请序列号____(代理律师档案号为27866/33487，与本申请同时申请)详细描述了用于鉴定破坏特定蛋白质/蛋白相互作用的分子的“分裂杂种分析(split hybrid assay)”技术。该申请的说明书通过引用结合到本文中。

为了分离编码与CKⅠδ相互作用的蛋白质的cDNA，使用一LexA-CKⅠδ融合蛋白作为诱饵来进行两个杂种分析。将CKⅠδ的编码区亚克隆到pBTM116的一个BamBH位点上，再转化到一命名为CKⅠδ/L40(MAT a His3 Δ200 trp1-901 Leu2-3 112 ade2 LYS∷(lexAop)4HIS3 URA3∷(lexAop)₈-lacZ GAL 4)的酵母菌株中。用由第9.5天和第10.5天阶段的鼠胚胎制备的cDNA文库来大规模地转化CKⅠδ/L40。得到大约4千万个转化体。将8千8百万平板接种到缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的选择性培养基上。酵母转化体在没有组氨酸的环境中生长的能力表明：在CKⅠδ和一些文库蛋白质间存在相互作用。

在第二次筛选中，用激活β-半乳糖苷酶转录的相互作用能力来分析两种蛋白质的相互作用。将在X-gal存在下变蓝的克隆划线接种到缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的培养基中，在液体培养物中生长并收集，以用于总DNA的分离。分离的DNA用来转化在缺乏亮氨酸的培养基中没有生长能力的大肠杆菌菌株600。生长的菌落用来制备质粒，鉴定出三种类型的cDNA。一类与果蝇转录因子dCREBa有密切联系。

当在分裂杂种分析中检测CKⅠδ/CREB相互作用时，表明细胞在含组氨酸的培养基中生长，但在没有组氨酸时生长受到抑制。将少量四环素加到细胞培养物中恢复细胞的生长能力，这说明：CKⅠδ和CREBa之间的相互作用是非常弱的。

为了鉴定能够破坏mCREBa和CKⅠδHU之间结合互作的分子，在有假定的抑制剂存在的情况下，使用分裂杂种分析，这些假定抑制剂选自例如化学文库、天然产物文库和联合文库中。同样，用相同技术还鉴定了mCREBa和其它互作激酶以及其它蛋白质之间相互作用的抑制剂。用类似于构建CKⅠδHU表达质粒的技术，构建其它mCREBa-互作蛋白质的表达质粒。然后在有不同假定结合抑制剂存在的情况下，进行分裂杂种分析，其中用该宿主细胞在缺乏营养要求的培养基中生长的能力来确定抑制剂。

在分裂杂种分析中，mCREBa或其蛋白结合区片段在宿主细胞中作为一个融合蛋白，与一个或多个转录子的DNA结合域或反式激活域相结合表达。mCREBa结合配体的例子包括cdc2[见Hall和Peters的综述，Adv.Cancer Res.68:67-108(1996)]、CKⅠ和CKⅡ同型体[见Ahmed综述，Cell Mol.Biol.Res.40:1-11(1994)],MAP激酶[见Marshall综述，Ann.Oncol.6:Suppl.1:63-67(1995)]和S6激酶[见Chou和Blenis的综述，Curr.Opin.Cell.Biol.7:806-814(1995)]。mCREBa的天然结合配体也在同一宿主细胞中作为一融合蛋白，与一转录因子的DNA的或一结合区域或一反式激活区域相结合(无论哪个都不加入mCREBa融合蛋白中)表达。这两种融合蛋白的表达和随后的与结合配体的结合允许DNA结合域和反式激活域相结合，形成一个具有导致一阻遏蛋白表达的活性转录子。该表达的阻遏蛋白再阻止了报告基因的表达，这样显著地降低宿主细胞的生存率。然后由此转化的宿主细胞可以与mCREBa/结合配体相互作用的假定抑制剂接触，实际的抑制剂鉴定为阻止mCREBa与其配体蛋白结合的那些分子，因此阻止那些不能阻断报告基因表达的阻遏蛋白的表达。因此一种抑制剂间接地提供一个正信号，该正信号由特定的报告基因产物的表达和检测产生。经得起这种检验的有潜力的抑制剂来源可以在化学化合物文库、从微生物、动物、植物和/或海洋生物中分离的天然产物文库、多平行合成收集物和/或组合、重组合、肽模拟物、肽、多肽或蛋白质文库中发现。

序列表(1)一般资料：

(ⅰ)申请人：

(ⅱ)发明题目：新型CREBa同型体

(ⅲ)顺序数：9

(ⅳ)通讯地址：

(A)地址：Marshall,OToole,Gerstein,Murray & Borun

(B)街：233 South Wacker Drvie,6300 Sears Tower

(C)城市：芝加哥

(D)州：依里诺

(E)国家：美国

(F)邮政编码：60606

(ⅰ)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30

(ⅰ)当前申请日期：

(A)申请号：

(B)填写日期：

(C)分类：

(ⅷ)专利律师/代理人资料：

(A)姓名：Williams Jr.,Joseph A.

(B)登记号：38,659

(C)参考/档案号：27866/33487

(ⅸ)电讯信号

(A)电话：312-474-6300

(B)电传：312-474-0448(2)有关SEQ ID NO:1的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：3190碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线状

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：304..1866

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:GGCACGAGGG ACTTTCTTGG GATGAGCGCT GCCTTTTTGG CTTCCTTTTG GATGCACAGC 60CCGATTTAAC CCCTGCACCT TCCGCCCGAT CCCAGCAGGC TTGTCCTCCC CGGGGAGTCA 120CAGATTTCCG AGGACAAGGG TCGCGTAGCC TTCGGCAGGG CTCTCCCGAG TTCCTGCTCC 180AGTGCATAAG TTCCACGCGC GCACACGCCA AGTACACGGG GAGAAGCGTC TCACCGGCCC 240GCGGCGGCTC TGCGCGGTCC CCTCCTGCCT CAGCATCCTC GGGCCTGCGC GGCGCCCACC 300GCC ATG GAG GTG CTG GAG AGC GGG GAG CAG AGC GTC CTG CAG TGG GAC 348

Met Glu Val Leu Glu Ser Gly Glu Gln Ser Val Leu Gln Trp Asp

1 5 10 15CGC AAG CTG AGC GAG CTG TCA GAG CCC GGA GAG ACT GAG GCC CTC ATG 396Arg Lys Leu Ser Glu Leu Ser Glu Pro Gly Glu Thr Glu Ala Leu Met

20 25 30TAC CAC ACG CAC TTC TCG GAG CTC CTA GAC GAG TTT TCC CAG AAC GTC 444Tyr His Thr His Phe Ser Glu Leu Leu Asp Glu Phe Ser Gln Asn Val

35 40 45CTG GGT CAG CTC CTG AGT GAC CCT TTC CTC TCA GAG AAG AGC GAG TCA 492Leu Gly Gln Leu Leu Ser Asp Pro Phe Leu Ser Glu Lys Ser Glu Ser

50 55 60ATG GAG GTG GAG CCA TCT CCA ACA TCA CCA GCG CCT CTC ATC CAG GCT 540Met Glu Val Glu Pro Ser Pro Thr Ser Pro Ala Pro Leu Ile Gln Ala

65 70 75GAA CAC AGC TAC TCT CTG AGC GAG GAG CCC CGG ACT CAG TCA CCA TTT 588Glu His Ser Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Pro Arg Thr Gln Ser Pro Phe80 85 90 95ACC CAT GCG GCT ACC AGC GAC AGC TTC AAT GAC GAG GAG GTG GAG AGT 636Thr His Ala Ala Thr Ser Asp Ser Phe Asn Asp Glu Glu Val Glu Ser

100 105 110GAA AAA TGG TAC CTG TCT ACA GAG TTT CCT TCA GCT ACC ATC AAG AAA 684Glu Lys Trp Tyr Leu Ser Thr Glu Phe Pro Ser Ala Thr Ile Lys Lys

115 120 125GAG CCA ATC ACA GAG GAG CAG CCC CCG GGA CTT GTC CCT TCT GTC ACT 732Glu Pro Ile Thr Glu Glu Gln Pro Pro Gly Leu Val Pro Ser Val Thr

130 135 140CTG ACC ATC ACA GCC ATT TCC ACT CCT TTT GAA AAA GAA GAG TCC CCT 780Leu Thr Ile Thr Ala Ile Ser Thr Pro Phe Glu Lys Glu Glu Ser Pro

145 150 155CTG GAT ATG AAT GCT GGG GGG GAC TCC TCA TGC CAG ACG CTT ATT CCT 828Leu Asp Met Asn Ala Gly Gly Asp Ser Ser Cys Gln Thr Leu Ile Pro160 165 170 175AAG ATT AAG CTG GAG CCC CAC GAA GTG GAT CAG TTC TTA AAC TTC TCC 876Lys Ile Lys Leu Glu Pro His Glu Val Asp Gln Phe Leu Asn Phe Ser

180 185 190CCG AAA GAA GCC TCC GTG GAT CAA CTG CAC TTA CCA CCA ACA CCA CCC 924Pro Lys Glu Ala Ser Val Asp Gln Leu His Leu Pro Pro Thr Pro Pro

195 200 205AGT AGT CAC AGC AGT GAC TCT GAG GGC AGC TTG AGC CCC AAC CCA CGC 972Ser Ser His Ser Ser Asp Ser Glu Gly Ser Leu Ser Pro Asn Pro Arg

210 215 220CTG CAT CCC TTC AGC CTG TCT CAG GCC CAC AGC CCT GTC AGA GCC ATG 1020Leu His Pro Phe Ser Leu Ser Gln Ala His Ser Pro Val Arg Ala Met

225 230 235CCC CGG GGC CCC TCT GCC TTG TCC ACA TCT CCT CTC CTC ACA GCT CCA 1068Pro Arg Gly Pro Ser Ala Leu Ser Thr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Pro240 245 250 255CAT AAG CTG CAG GGA TCG GGC CCC CTG GTC CTG ACA GAA GAG GAG AAG 1116His Lys Leu Gln Gly Ser Gly Pro Leu Val Leu Thr Glu Glu Glu Lys

260 265 270AGG ACC CTG GTT GCC GAG GGC TAT CCC ATT CCC ACC AAG CTG CCT CTG 1164Arg Thr Leu Val Ala Glu Gly Tyr Pro Ile Pro Thr Lys Leu Pro Leu

275 280 285ACA AAA TCT GAG GAG AAG GCC CTG AAG AAA ATC CGG AGA AAG ATC AAG 1212Thr Lys Ser Glu Glu Lys Ala Leu Lys Lys Ile Arg Arg Lys Ile Lys

290 295 300AAT AAG ATT TCT GCC CAA GAA AGC AGG AGA AAG AAG AAA GAA TAC ATG 1260Asn Lys Ile Ser Ala Gln Glu Ser Arg Arg Lys Lys Lys Glu Tyr Met

305 310 315GAC AGC CTG GAG AAA AAA GTG GAG TCT TGT TCA ACT GAG AAC TTG GAG 1308Asp Ser Leu Glu Lys Lys Val Glu Ser Cys Ser Thr Glu Asn Leu Glu320 325 330 335CTT CGG AAG AAG GTG GAG GTG CTG GAG AAC ACC AAT AGG ACT CTC CTT 1356Leu Arg Lys Lys Val Glu Val Leu Glu ASn Thr Asn Arg Thr Leu Leu

340 345 350CAG CAA CTT CAG AAG CTT CAG ACT TTG GTG ATG GGG AAG GTC TCT CGA 1404Gln Gln Leu Gln Lys Leu Gln Thr Leu Val Met Gly Lys Val Ser Arg

355 360 365ACC TGC AAG TTA GCT GGC ACA CAG ACT GGC ACC TGC CTC ATG GTC GTT 1452Thr Cys Lys Leu Ala Gly Thr Gln Thr Gly Thr Cys Leu Met Val Val

370 375 380GTG CTT TGC TTT GCT GTT GCA TTT GGA AGC TTC TTT CAA GGC TAT GGG 1500Val Leu Cys Phe Ala Val Ala Phe Gly Ser Phe Phe Gln Gly Tyr Gly

385 390 395CCT TAT CCT TCT GCC ACC AAG ATG GCT CTG CCC AGC CAG CAT CCT CTG 1548Pro Tyr Pro Ser Ala Thr Lys Met Ala Leu Pro Ser Gln His Pro Leu400 405 410 415TCA GAG CCA TAC ACA GCC TCC GTG GTG AGA TCC AGG AAC CTG CTA ATC 1596Ser Glu Pro Tyr Thr Ala Ser Val Val Arg Ser Arg ASn Leu Leu Ile

420 425 430TAT GAG GAA CAC GCT CCC CTG GAA GAG TCG TCG AGC CCA GCC TCA ACC 1644Tyr Glu Glu His Ala Pro Leu Glu Glu Ser Ser Ser Pro Ala Ser Thr

435 440 445GGG GAG CTG GGG GGC TGG GAC AGA GGC TCC TCT CTG CTC AGG GCA TCG 1692Gly Glu Leu Gly Gly Trp Asp Arg Gly Ser Ser Leu Leu Arg Ala Ser

450 455 460TCG GGG CTT GAG GCC CTG CCA GAG GTG GAT CTT CCC CAT TTC CTT ATC 1740Ser Gly Leu Glu Ala Leu Pro Glu Val Asp Leu Pro His Phe Leu Ile

465 470 475TCC AAT GAG ACG AGC TTG GAG AAG TCA GTA CTG TTG GAG CTT CAG CAG 1788Ser Asn Glu Thr Ser Leu Glu Lys Ser Val Leu Leu Glu Leu Gln Gln480 485 490 495CAC CTG GTC AGC AGC AAA CTG GAA GGG AAC GAA ACA CTC AAG GTT GTA 1836His Leu Val Ser Ser Lys Leu Glu Gly Asn Glu Thr Leu Lys Val Val

500 505 510GAG CTG GAG AGG AGA GTG AAC GCC ACC TTC TGAGGAGAGC TCCACCCTCC 1886Glu Leu Glu Arg Arg Val Asn Ala Thr Phe

515 520TCTTCTCCTA ACTCCATCTG ATCGTCCTTT CAGTTTCCCC TTCACCACTG GATCTCGAGG 1946AGGAGATGGC TAGTGTTACG GCTCGAGACA GGAGGCCAGC CCAGGGGGTT CTGCTTATGT 2006GTCCCCGTGG CTCTCCACAA AAGGGAGCTA GCACCTCTCC ATCCCTTTCT CTTACTGCCA 2066TTGGAAATTA TTTTAGGGCT GAGATAGGGG TGGAACGAGC AGGCTTGTTT CCACCAATAG 2126TGCCAAGAAG ACACTGCCTG ATTCTTCCCC GGGAGGAGTG ACTCCTCTGA AGAAGACATG 2186ACTCATGTTC AGTTGAGACC CCAGACTCTA GCCACACACA TGCCACAGAC ATGCCAGGGA 2246GTGGCAAAGC ACTGACTCCT GAGCTCCCTT CCTCACTAGG ACTCCAGTGT GACCCTGCAC 2306TGAGAGGACC AAAGCGTCAT TGCAGTCTTC TCTCCACCCT GTACCCCGGA GTCCTGATTG 2366GATGTCTGCA GAGGCAGATG GGGCTCCCAC CATATTTTCA GGCCGCAAGT GCAATTCCTG 2426AAGGCATCAG GCTCTTCTCT CCCAGGCTCT CCTGCCCACT GTGTTGTTTG TAGGACACCC 2486CCACACCCAC TCATACACAG CCTGCATCTC CACAGGACAA TAGCTCTGTC TCCCTGGCCT 2546CCCCTCCCCA TTTGTAAATA GTATTTATTA GCTTGCTCAA GCTCCCAGCT GGCCATAGTG 2606AAAAGATTTC CCCTTTCAAC CAGCAAAGTC TTCTGTTGGC CTTTGGAACA GGAGAGTCCC 2666CGGAATCTAG GACCCTAGTC TTTGTACTTG ATGCCTTGTT TCCCCCCTTT TCTTCTTTAA 2726AATTGGGGAC CTATAACATC ATCGCTGTTG CGGAATCCAC TTAGGCATGT GTCCCCTGAT 2786GGATGAATAC ATGGGAATGG TGGATACTGT CTTCTGACTC AGGCTCTAGG CTCCATGGCT 2846TCCTCTCTCT GGTCCTGCCA CACAGAAGGA AAGCCCTGTC CAGGATAATG AGCGTTGCTG 2906ACACCCTTGC TAGCTTGTCC TGCCTACCTG CTTACCCCAC TCCCTCACCT TCCTCCTTCC 2966CTTCTGCCCT CCATCCACCT GCCTTAACTA ATTGGGGCTG GAGTTGGTCA TTTTTTGTAC 3026ACCCACAGTG GTACCTTTTA CAGTCAGGTT TGGATACTTT GCAGCTCATC CAAAGAGACA 3086TAACTAAACC CTAAACTCTT TTTTTGTTGT TGTTGTTGTT GTTTTTTTTT TTTATGATTA 3146AAAAGTAAAA ATTGTAGTTT AAAAAAAAAA AAAAAAAACT CGAG 3190(2)关于SEQ ID NO:2的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：521氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑结构：线状

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Glu Val Leu Glu Ser Gly Glu Gln Ser Val Leu Gln Trp Asp Arg1 5 10 15Lys Leu Ser Glu Leu Ser Glu Pro Gly Glu Thr Glu Ala Leu Met Tyr

20 25 30His Thr His Phe Ser Glu Leu Leu Asp Glu Phe Ser Gln Asn Val Leu

35 40 45Gly Gln Leu Leu Ser Asp Pro Phe Leu Ser Glu Lys Ser Glu Ser Met

50 55 60Glu Val Glu Pro Ser Pro Thr Ser Pro Ala Pro Leu Ile Gln Ala Glu65 70 75 80His Ser Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Pro Arg Thr Gln Ser Pro Phe Thr

85 90 95His Ala Ala Thr Ser Asp Ser Phe Asn Asp Glu Glu Val Glu Ser Glu

100 105 110Lys Trp Tyr Leu Ser Thr Glu Phe Pro Ser Ala Thr Ile Lys Lys Glu

115 120 125Pro Ile Thr Glu Glu Gln Pro Pro Gly Leu Val Pro Ser Val Thr Leu

130 135 140Thr Ile Thr Ala Ile Ser Thr Pro Phe Glu Lys Glu Glu Ser Pro Leu145 150 155 160Asp Met Asn Ala Gly Gly Asp Ser Ser Cys Gln Thr Leu Ile Pro Lys

165 170 175Ile Lys Leu Glu Pro His Glu Val Asp Gln Phe Leu Asn Phe Ser Pro

180 185 190Lys Glu Ala Ser Val Asp Gln Leu His Leu Pro Pro Thr Pro Pro Ser

195 200 205Ser His Ser Ser Asp Ser Glu Gly Ser Leu Ser Pro Asn Pro Arg Leu

210 215 220His Pro Phe Ser Leu Ser Gln Ala His Ser Pro Val Arg Ala Met Pro225 230 235 240Arg Gly Pro Ser Ala Leu Ser Thr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Pro His

245 250 255Lys Leu Gln Gly Ser Gly Pro Leu Val Leu Thr Glu Glu Glu Lys Arg

260 265 270Thr Leu Val Ala Glu Gly Tyr Pro Ile Pro Thr Lys Leu Pro Leu Thr

275 280 285Lys Ser Glu Glu Lys Ala Leu Lys Lys Ile Arg Arg Lys Ile Lys Asn

290 295 300Lys Ile Ser Ala Gln Glu Ser Arg Arg Lys Lys Lys Glu Tyr Met Asp305 310 315 320Ser Leu Glu Lys Lys Val Glu Ser Cys Ser Thr Glu Asn Leu Glu Leu

325 330 335Arg Lys Lys Val Glu Val Leu Glu Asn Thr Asn Arg Thr Leu Leu Gln

340 345 350Gln Leu Gln Lys Leu Gln Thr Leu Val Met Gly Lys Val Ser Arg Thr

355 360 365Cys Lys Leu Ala Gly Thr Gln Thr Gly Thr Cys Leu Met Val Val Val

370 375 380Leu Cys Phe Ala Val Ala Phe Gly Ser Phe Phe Gln Gly Tyr Gly Pro385 390 395 400Tyr Pro Ser Ala Thr Lys Met Ala Leu Pro Ser Gln His Pro Leu Ser

405 410 415Glu Pro Tyr Thr Ala Ser Val Val Arg Ser Arg Asn Leu Leu Ile Tyr

420 425 430Glu Glu His Ala Pro Leu Glu Glu Ser Ser Ser Pro Ala Ser Thr Gly

435 440 445Glu Leu Gly Gly Trp Asp Arg Gly Ser Ser Leu Leu Arg Ala Ser Ser

450 455 460Gly Leu Glu Ala Leu Pro Glu Val Asp Leu Pro His Phe Leu Ile Ser465 470 475 480Asn Glu Thr Ser Leu Glu Lys Ser Val Leu Leu Glu Leu Gln Gln His

485 490 495Leu Val Ser Ser Lys Leu Glu Gly Asn Glu Thr Leu Lys Val Val Glu

500 505 510Leu Glu Arg Arg Val Asn Ala Thr Phe

515 520(2)有关SEQ ID NO:3的信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线状

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO3:CGCGGATCCT AATGGAGCTG AGAGTCGGG 29(2)有关SEQ ID NO:4的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线状

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:CGCGGATCCG CTCATCGGTG CACGACAG 29(2)有关SEQ ID NO:5的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线状

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:CGGGATCCTC ACAGCTCCAG ATAAGCTGC 29(2)有关SEQ ID NO:6的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：28碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线状

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:GGAATTCGCT CAAGGAGAGT CCTATTGG 28(2)有关SEQ ID NO:7的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：154碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线状

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:CAGGTCAGTT CAGCGGATCC TGTCGNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 120NNNNNNNNNG AGGCGAATTC AGTGCAACTG CAGC 154(2)有关SEQ ID NO:8的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线状

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:CAGGTCAGTT CAGCGGATCC TGTCG 25(2)有关SEQ ID NO:9的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型

(D)拓扑结构：线状

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:GCTGCAGTTG CACTGAATTC GCCTC 25(2)有关SEQ ID NO:10的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：38碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线状

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:GAATCGGGCC GCCGAGATCT CATATGGAGC TGAGAGTC 38

Claims

1．一种多肽，包含SEQ ID NO:2中提出的mCREBa氨基酸序列。

2．编码按照权利要求1的多肽的多核苷酸。

3．按照权利要求2的多核苷酸，包含SEQ ID NO:1中提出的序列。

4．权利要求2或3的多核苷酸，它为DNA分子。

5．权利要求4的DNA，它为cDNA分子。

6．权利要求4的DNA，它为基因组DNA分子。

7．权利要求4的DNA，它为全部或部分化学合成的DNA分子。

8．一种反义多核苷酸，它专一性地与权利要求2的多核苷酸杂交。

9．一种构建物，包含按照权利要求2的多核苷酸。

10．用按照权利要求2或9的多肽转化的宿主细胞。

11．生产mCREBa多肽的方法，包括以下步骤：

a)在适于mCREBa多肽表达的条件下培养按照权利要求5的宿主细胞以及

b)从宿主细胞的生长培养基中分离mCREBa多肽。

12．一种抗体，专一性地与按照权利要求1的多肽发生免疫反应。

13．按照权利要求12的抗体，它为单克隆抗体。

14．分泌按照权利要求13的抗体的杂交瘤。

15．一种抗个体基因型抗体，它专一性地与按照权利要求12的抗体发生免疫反应。

16．鉴定mCREBa与DNA结合的调节剂的方法，包括以下步骤：

a)将mCREBa与已知的专一性与mCREBa结合的DNA序列一起保温；

b)测定mCREBa和该DNA序列的结合程度；

c)在有一假定mCREBa与DNA序列结合的调节剂的情况下，重复步骤(a)；以及

d)将在有假定调节剂存在的情况下，将mCREBa和DNA序列的结合与步骤(b)中确定的相互作用相比较，其中在有假定调节剂存在的情况下增加结合是结合增强子的象征，而在有假定调节剂存在的情况下降低结合是结合阻遏子的象征。

17．mCREBa或其结合片段与mCREBa结合蛋白或其结合片段之间结合的抑制剂的鉴定方法，包括以下步骤：

a)生产用DNA转化或转染的宿主细胞，该DNA包括：

一个编码阻遏蛋白质的阻遏基因，所述阻遏基因在一个启动子的转录控制之下；

一个编码选择性标记蛋白的选择性标记基因；所述选择性标记基因在一个操纵子的转录控制之下；所述操纵子通过与所述阻遏蛋白相互作用而调节；

第一重组融合蛋白质基因，在具有或者一种转录激活蛋白的DNA结合域或者一种转录激活蛋白的反式激活域的读框中编码mCREBa或其结合片段；以及

第二重组融合蛋白质基因，在具有或者一种转录激活蛋白的DNA结合域或者一种转录激活蛋白的反式激活域的读框中编码mCREBa结合蛋白或其结合片段，任何一个区域都不由第一个融合蛋白质基因编码，所述第二结合蛋白或其结合片段能够与所述第一结合蛋白或其结合片段相互作用，使得所述第二结合蛋白或其结合片段和所述第一结合蛋白或其结合片段之间的相互作用，导致DNA结合域和反式激活域相接近，形成一个功能性转录激活蛋白质；所述功能性转录激活蛋白质作用于所述启动子，增加所述阻遏基因的表达。

b)在没有试验化合物的情况下，在允许所述mCREBa或其结合片段和所述mCREBa-结合蛋白或其结合片段表达的条件下，培养宿主细胞，使得所述mCREBa或其结合片段和所述mCREBa-结合蛋白或其结合片段相互作用，导致所述DNA结合域和所述反式激活域相接近，形成所述功能性转录激活蛋白；所述转录激活蛋白作用于所述启动子，增加所述阻遏蛋白质的表达；所述阻遏蛋白质与所述操纵子相互作用，使得所述选择性标记蛋白不被表达；

c) 在所述宿主中确认缺乏所述选择性标记蛋白的表达；

d) 在有试验化合物的条件下培养所述宿主细胞；以及

e) 比较在有或无所述试验化合物存在的情况下，所述选择性标记蛋白的表达，其中所述选择性标记蛋白的增强表达表示该试验化合物是一种结合抑制剂，这种结合是指所述第一结合蛋白或其结合片段和所述第二结合蛋白或其结合片段之间的结合。

18．权利要求17的方法，其中所述DNA结合域和所述反式激活域是从普通的转录激活蛋白衍生而来。

19．权利要求17的方法，其中在不同的DNA表达构建物上编码一个或多个阻遏蛋白基因、选择性标记基因、第一重组融合蛋白质基因和第二重组融合蛋白质基因。

20．权利要求17的方法，其中所述选择性标记蛋白是所述宿主细胞营养需求物合成途径中的一种酶，使得所述宿主细胞在缺乏所述营养需求物的培养基上生长需要所述选择性标记蛋白质的表达。

21．权利要求17的方法，其中所述的宿主细胞是酵母细胞或哺乳动物细胞。

22．权利要求18的方法，其中所述选择性标记基因编码HIS3。

23．权利要求18的方法，其中所述阻遏蛋白基因编码一四环素抗性蛋白。

24、权利要求18的方法，其中所述操纵子是tet操纵子。

25．权利要求18的方法，其中所述启动子是选自LexA启动子、乙醇脱氢激酶启动子、Gal4启动子。

26．权利要求18的方法，其中所述DNA结合域是从选自LexA和Gal4的蛋白质衍生而来的。

27．权利要求18的方法，其中所述反式激活域是由从选自VP16和Gal14的蛋白质衍生来的。

28．权利要求18的方法，其中该mCREBa-结合蛋白选自CKⅠ、CKⅡ、cdc2、MAP激酶和S6激酶。