CN113087788B - 一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物学技术领域，涉及一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，该方法首先合成人工多肽，并将该人工多肽偶联到血蓝蛋白KLH上，以此为抗原对实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔进行免疫，经过多次加强免疫后从兔子体内获得血清进行效价检测，效价达到预期目标后即可分离血清，提纯获得多克隆抗体；本发明获得的多克隆抗体特异性强，可用于免疫沉淀、免疫组化等分子生物学实验及相关研究，为深入研究植物细胞自噬相关机理提供了有力的工具。

Description

一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备 方法
技术领域
本发明属于农业生物学技术领域，涉及一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法。
背景技术
细胞自噬是一种进化上非常保守的溶酶体/液泡降解途径，对生物有机体适应各种生物或非生物胁迫，以及维持自身生长发育具有重要意义。在细胞自噬发生过程中，由于自噬相关基因8(autophagy related gene 8，ATG8)的蛋白始终标记在自噬泡的膜状结构上，所以被用作自噬检测的金标准。在所有植物中，目前只制备出了拟南芥抗内源性ATG8蛋白的多克隆抗体，但其特异性较差，同时拟南芥的抗原序列至今未对外公开，更加限制了其在检测植物ATG8基因表达中的广泛应用。由于缺乏特异性较好的ATG8抗体，致使小麦细胞自噬研究进展相对缓慢。
因此，能否提供一种具有较好特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8的多克隆抗体成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中的上述情况，本发明的发明人提供了一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8的多克隆抗体制备方法，该方法首先合成人工多肽，并将其偶联到血蓝蛋白KLH上，以此为抗原对实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔进行免疫，经过多次加强免疫后从兔子体内获得血清进行效价检测，效价达到预期目标后即可分离血清，提纯获得多克隆抗体；本发明获得的多克隆抗体特异性强，可以用于免疫沉淀、免疫组化等分子生物学实验及相关研究，为深入研究植物细胞自噬相关机理提供了有力的工具。
本发明的具体技术方案如下：
发明人首先利用小麦ATG8基因编码区N端第7-24位共18个氨基酸的人工合成多肽作为抗原，由于这18个氨基酸组成的多肽具有亲水性，免疫原性较好，故选其做抗原；
上述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；
在上述人工合成多肽的基础上，发明人提供了一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，具体操作步骤如下：
(1)将5mg人工合成多肽(KTEHPLERRQAESARIRE)偶联到1mg血蓝蛋白KLH(KeyholeLimpet Hemocyaninn)；
(2)饲养实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，待兔子长至1-2kg左右时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂(液体石蜡：羊毛脂＝2:1)和1mL浓度为0.7mg/mL的纯多肽在每只兔子皮下注射第1针，标记为第1天；
(3)第12天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂(完全弗氏佐剂+终浓度20mg/mL的卡介苗)和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子皮下注射第2针；
(4)第26天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第3针；
(5)第40天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第4针；
(6)第54天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第5针；
(7)第66天，取兔子血清进行Western blot验证。
其中，选择的两个种类的兔子都可以用来做抗体的，为了提高成功率，防止兔子在免疫过程中出现死亡，发明人选择了两只种类不同的兔子，本发明最终获得抗体的兔子选自新西兰大白兔，免疫前需待兔子长至1-2kg，同时生长状态良好的情况下方可免疫。
与现有技术相比，本发明的特点在于选取了免疫原性好的抗原多肽序列，最终获得的多克隆抗体特异性强。上述获得的抗血清用上述多肽作抗原亲和纯化后，可得到浓缩后的抗体；
利用上述兔子多抗进行Western blot验证，具体是对小麦根、叶和种子蛋白进行了Western blot检测，结果显示制备的小麦ATG8抗体均能识别各个组织中的目的蛋白ATG8，在上样1mg总蛋白的情况下，整张纤维素薄膜上只显示目的蛋白一条带，进一步证明本发明制备的抗体特异性强，可以用于免疫沉淀、免疫组化等分子生物学实验及相关研究，为深入研究植物细胞自噬相关机理提供了有力的工具，填补了本领域的空白。
附图说明
图1为小麦根部抗体特异性检测电泳图，
其中1为1mg总蛋白，2为0.4mg总蛋白，3为0.2mg总蛋白，4为marker；
图2为小麦叶部抗体特异性检测电泳图，
其中1为1mg总蛋白，2为0.4mg总蛋白，3为marker；
图3为小麦种子抗体特异性检测电泳图，
其中1为1mg济麦379总蛋白，2为1mg济麦70总蛋白，最右侧为marker；
由图可知，本发明制备的小麦ATG8多克隆抗体能识别小麦各个组织中的目的蛋白ATG8，在上样1mg总蛋白的情况下，整张纤维素薄膜上只显示目的蛋白一条带，特异性强。
具体实施方式
实施例1
一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，
发明人首先利用小麦ATG8基因编码区N端第7-24位共18个氨基酸的人工合成多肽作为抗原，由于这18个氨基酸组成的多肽具有亲水性，免疫原性较好，故选其做抗原；
上述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
实施例2
一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，具体操作步骤如下：
(1)将5mg人工合成多肽偶联到1mg血蓝蛋白KLH；
(2)饲养实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，待兔子长至1-2kg时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.7mg/mL的纯多肽在每只兔子皮下注射第1针，标记为第1天；
(3)第12天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子皮下注射第2针；
(4)第26天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第3针；
(5)第40天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第4针；
(6)第54天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第5针；
(7)第66天，取兔子血清进行Western blot验证；
其中所述的完全弗氏佐剂为液体石蜡：羊毛脂的体积比为2:1的组合物；不完全弗氏佐剂为含有20mg/mL卡介苗的完全弗氏佐剂。
上述抗血清利用多肽KTEHPLERRQAESARIRE作为抗原亲和纯化获得纯化后的多抗，具体步骤可参考现有技术“多克隆抗体的制备,纯化及检测”，可参考如下公开文件：https://wenku.baidu.com/view/07200936eefdc8d376ee320d.html。
实施例3
利用上述纯化后的兔子多抗进行Western blot验证，具体是对小麦根、叶和种子蛋白进行了Western blot检测，其中所选的小麦为鲁麦21和济麦70；
在SDS胶浓度12.5％，电泳时间1.5h，电压100V，电流45mA；转膜时间2h，200V的实验条件下，结果如图1-3所示，在总蛋白为1mg情况下，能够检测到根、叶片和种子部位表达的ATG8蛋白，而且背景清晰，只显示目的条带，证明纯化的多抗具有非常强的特异性。
普通小麦中共有8个ATG8蛋白多肽类型，对该抗体识别到的蛋白进行质谱鉴定，结果显示该抗体可识别小麦所有ATG8蛋白多肽类型，证明对各小麦品种都有较好的特异性。
序列表
<110> 山东省农业科学院作物研究所
<120> 一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
Lys Thr Glu His Pro Leu Glu Arg Arg Gln Ala Glu Ser Ala Arg Ile
1 5 10 15
Arg Glu
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
aagaccgagc accccctgga aaggaggcaa gctgaatctg ctaggatccg tgag 54

Claims (4)

1.一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所采用的抗原为人工合成多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）将5 mg人工合成多肽偶联到1 mg血蓝蛋白KLH；
（2）饲养实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，待兔子长至1-2kg时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.7 mg/mL的步骤（1）偶联后的多肽在每只兔子皮下注射第1针，标记为第1天；
（3）第12天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35 mg/mL的步骤（1）偶联后的多肽在兔子皮下注射第2针；
（4）第26天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的步骤（1）偶联后的多肽在兔子肌肉注射第3针；
（5）第40天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35 mg/mL的步骤（1）偶联后的多肽在兔子肌肉注射第4针；
（6）第54天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35 mg/mL的步骤（1）偶联后的多肽在兔子肌肉注射第5针；
（7）第66天，取兔子血清进行Western blot验证。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的完全弗氏佐剂为液体石蜡：羊毛脂的体积比为2:1的组合物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的不完全弗氏佐剂为含有20mg/mL卡介苗的完全弗氏佐剂。
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小麦ATG8 的原核表达及其抗血清制备;吴洪波等;《华北农学报》;20131231;第28卷(第1期);全文 *

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