CN115028717A - 一种识别小麦内源性dreb4蛋白的多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

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鲁琳
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Abstract

本发明属于农业生物学技术领域，涉及一种识别小麦内源性DREB4蛋白的多克隆抗体的制备方法，该方法通过对小麦中已有DREB4A、4B和4C进行序列分析，选取DREB4A进行原核表达纯化，并以此作为抗原首次制备出可识别小麦内源DREB4蛋白的多克隆抗体，为进一步研究DREB4在蛋白水平上的调控机理提供了方法学基础。

Description

一种识别小麦内源性DREB4蛋白的多克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明属于农业生物学技术领域，涉及一种识别小麦内源性DREB4蛋白的多克隆抗体的制备方法。
背景技术
小麦是全球最重要的粮食作物之一，2021年的数据表明全球小麦产量为775.8百万吨，我国是小麦最大的生产国和消费国，2021年我国的小麦产量达到了13695万吨；然而，干旱、盐碱、高温等各种非生物胁迫会严重影响小麦产量；所以，如何提高小麦应对非生物胁迫的能力对保障国家粮食安全具有重要意义。
DREB(dehydration-responsive element-binding)转录因子在小麦非生物胁迫中起着非常重要的作用。DREB蛋白含有一个保守的AP2结构域，可以和顺式作用元件DRE核心序列(A/GCCGAC)发生特异性结合，通过在转录水平上调控下游基因的表达，进而应对各种非生物胁迫。但是由于目前缺乏可识别小麦内源性DREB蛋白的抗体，导致其在蛋白水平上的研究进展缓慢，进而影响了小麦非生物胁迫的相关研究。
发明内容
针对现有技术中的上述情况，本发明的发明人提供了一种识别小麦内源性DREB4蛋白的多克隆抗体的制备方法，该方法通过对小麦中已有DREB4A、4B和4C进行序列分析，选取DREB4A进行原核表达纯化，并以此作为抗原首次制备出可识别小麦内源DREB4蛋白的多克隆抗体，为进一步研究DREB4在蛋白水平上的调控机理提供了方法学基础。
本发明的具体技术方案如下：
发明人首先通过对DREB4(A、B、C)的三种蛋白序列分析，最终选择将DREB4A(GenBank:AY781354.1)在大肠杆菌系统中进行表达；经纯化后的蛋白作为抗原免疫兔子,之后在国内外首次获得DREB4的多克隆抗体，Western blot结果显示该抗体可识别小麦内源性DREB4蛋白；
上述纯化后蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
更具体的技术方案如下：
本发明通过DNAMAN8软件对NCBI中提交的DREB4A(AY781354.1)、4B(AY781355.1)和4C(AY781356.1)序列进行分析；由北京擎科生物科技有限公司对DREB4A序列进行合成。
在获得上述DREB4A序列的的基础上，发明人对其进行了表达及纯化，具体步骤如下：
将上述合成的DREB4A序列与大肠杆菌表达载体PET30a通过同源重组的方法(
Figure BDA0003712107050000011
-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，CU201-02，北京全式金)连接；
将连接产物转入DH5α(北京擎科生物科技有限公司)感受态细胞中，冰上放置15min，42℃水浴热激90s，冰上放置2min，加入1mL无任何抗生素的LB液体培养基，37℃、210r水平摇1h，取100uL涂于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑取10个单克隆进行PCR检测，送阳性信号最强的2个单克隆到北京擎科生物科技有限公司进行测序；
对测序正确的单克隆进行摇菌、质粒提取(质粒小提试剂盒，DP103，北京天根)；将提取好的质粒转入BL21(DE3)感受态细胞(CD701-02，北京全式金)中，剩余步骤同DH5α感受态细胞转化。
挑单克隆置于5mL LB液体培养基中,37℃过夜培养，吸取1mL菌液加入到300mL LB液体培养基中进行扩大培养，待菌液OD值为0.6-08范围内，加入终浓度为50mM的IPTG(G5042-1G，武汉塞维尔生物科技有限公司)进行诱导表达，28℃过夜培养，6000r离心10min收集菌体沉淀，用1*PBS(Phosphate buffer saline)清洗1次，加入40mL 1*PBS重悬，超声破碎(开3s，关3s；共计30min)。
离心后，分别将沉淀、上清进行SDS电泳检测，上清通过His标签蛋白纯化试剂盒(P2226，上海碧云天生物技术有限公司)进行纯化。纯化后的蛋白置于透析袋中，4℃过夜透析，置于-20℃保存备用。
小麦DREB4多克隆抗体制备
饲养实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，待兔子长至1-2kg时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂(液体石蜡：羊毛脂＝2:1)和上述制备的0.3mg DREB4A融合蛋白，在每只兔子皮下注射第1针，标记为第1天；第12天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂(完全弗氏佐剂+终浓度20mg mL-1的卡介苗)和0.15mg融合蛋白在兔子皮下注射第2针；第26天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和0.15mg融合蛋白在兔子肌肉注射第3针；第40天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和0.15mg融合蛋白在兔子肌肉注射第4针；第53天，取兔子血清进行Western blot验证。
Western blot分析
利用植物组织蛋白裂解液(植物蛋白提取试剂盒，CW0885，康为世纪)，提取济麦379根、叶部的总蛋白。
配制15％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；通过湿法转膜，将胶中的蛋白转移到硝酸纤维素薄膜上；然后将膜放入含有2％脱脂奶粉的TBS(25mmol L-1Tris-HCl，137mmol L- 1NaCl)中，封闭1h；封闭结束后，加入DREB4多克隆抗体(上述兔子血清以1:1000的体积比稀释于2％脱脂奶粉溶液中)，4℃过夜；用TBST(TBS+20％吐温-20)洗涤3次；洗涤结束后，向封闭液中加入碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)标记的二抗，缓慢摇动24h，TBST洗涤3次，每次10min；最后用发色液(10mL TBS，45μL 5％NBT，35μL 5％BCIP)进行发色；
发色结果显示制备的小麦DREB4多克隆抗体能识别目的蛋白DREB4，在上样1mg总蛋白的情况下，整张纤维素薄膜上只显示目的蛋白一条带，进一步证明本发明制备的抗体特异性强，可以用于免疫沉淀、免疫组化等分子生物学实验及相关研究，为深入研究DREB4参与非生物胁迫调控机理提供了有力的工具，填补了本领域的空白。
附图说明
图1为普通小麦DREB4A、4B和4C的序列分析图，
其中深色区域为保守区域；
图2为实施例2中上清进行SDS-PAGE检测的电泳图，
图3为实施例3中DREB4多克隆抗体Western blot结果示意图，
图4为实施例4中DREB4多克隆抗体对小麦内源性DREB4蛋白的识别及特异性检测Western blot结果示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不局限于下面的实施例。
实施例1
小麦DREB4序列分析
在普通小麦中DREB4存在DREB4A、4B和4C三种转录本；其中，DREB4A编码394个氨基酸，分子量为42.8kDa；DREB4B编码346个氨基酸，分子量为37.7kDa；DREB4C编码68个氨基酸，分子量为7.1kDa(如图1所示)。三个序列的保守性达到61.28％，其中，DREB4B除26-73位置氨基酸缺失外，其它位置与DREB4A完全一致；三个序列在1-25位置氨基酸完全一致。DREB4A、4B和4C间序列的差异可能是应对不同非生物胁迫产生的可变剪切产生的，最终发明人选择DREB4A作为目标蛋白，DREB4A的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2
DREB4A的表达及纯化
由北京擎科生物科技有限公司对DREB4A序列进行合成，合成后的表达及纯化，具体步骤如下：
将上述合成的DREB4A序列与大肠杆菌表达载体PET30a通过同源重组的方法(
Figure BDA0003712107050000031
-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，CU201-02，北京全式金)连接；
将连接产物转入DH5α(北京擎科生物科技有限公司)感受态细胞中，冰上放置15min，42℃水浴热激90s，冰上放置2min，加入1mL无任何抗生素的LB液体培养基，37℃、210r水平摇1h，取100uL涂于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑取10个单克隆进行PCR检测，送阳性信号最强的2个单克隆到北京擎科生物科技有限公司进行测序；
对测序正确的单克隆进行摇菌、质粒提取(质粒小提试剂盒，DP103，北京天根)；将提取好的质粒转入BL21(DE3)感受态细胞(CD701-02，北京全式金)中，剩余步骤同DH5α感受态细胞转化。
挑单克隆置于5mL LB液体培养基中,37℃过夜培养，吸取1mL菌液加入到300mL LB液体培养基中进行扩大培养，待菌液OD值为0.6-08范围内，加入终浓度为50mM的IPTG(G5042-1G，武汉塞维尔生物科技有限公司)进行诱导表达，28℃过夜培养，6000r离心10min收集菌体沉淀，用1*PBS(Phosphate buffer saline)清洗1次，加入40mL 1*PBS重悬，超声破碎(开3s，关3s；共计30min)。
离心后，分别将沉淀、上清进行SDS电泳检测，结果显示，在大约50kDa位置处出现清晰的蛋白条带(图2)，与预期分子量相符；因此可判断DREB4A表达成功；上清通过His标签蛋白纯化试剂盒(P2226，上海碧云天生物技术有限公司)进行纯化。纯化后的蛋白置于透析袋中，4℃过夜透析，置于-20℃保存备用。
实施例3
小麦DREB4多克隆抗体制备
饲养实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，待兔子长至1-2kg时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂(液体石蜡：羊毛脂＝2:1)和上述制备的0.3mg DREB4A融合蛋白，在每只兔子皮下注射第1针，标记为第1天；第12天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂(完全弗氏佐剂+终浓度20mg mL-1的卡介苗)和0.15mg融合蛋白在兔子皮下注射第2针；第26天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和0.15mg融合蛋白在兔子肌肉注射第3针；第40天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和0.15mg融合蛋白在兔子肌肉注射第4针；第53天，取兔子血清进行Western blot验证；
结果如图3所示，在血清中检测到了DREB4多克隆抗体。
实施例4
Western blot分析
利用植物组织蛋白裂解液(植物蛋白提取试剂盒，CW0885，康为世纪)，提取济麦379根、叶部的总蛋白。
配制15％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；通过湿法转膜，将胶中的蛋白转移到硝酸纤维素薄膜上；然后将膜放入含有2％脱脂奶粉的TBS(25mmol L-1Tris-HCl，137mmol L- 1NaCl)中，封闭1h；封闭结束后，加入DREB4多克隆抗体(上述兔子血清以1:1000的体积比稀释于2％脱脂奶粉溶液中)，4℃过夜；用TBST(TBS+20％吐温-20)洗涤3次；洗涤结束后，向封闭液中加入碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)标记的二抗，缓慢摇动24h，TBST洗涤3次，每次10min；最后用发色液(10mL TBS，45μL 5％NBT，35μL 5％BCIP)进行发色；
Western blot结果显示，只有在大约37kDa位置处可清晰的检测到蛋白条带；这与预测的DREB4B蛋白分子量一致的(图4所示)。上述研究表明该抗体可以识别小麦内源性DREB4B蛋白；而且特异性好，可以用于后续的实验。
可见本申请获得的DREB4多克隆抗体可以检测DREB4(A、B、C)的三种蛋白，且特异性良好。
序列表
<110> 山东省农业科学院作物研究所
<120> 一种识别小麦内源性DREB4蛋白的多克隆抗体的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
Met Thr Val Asp Arg Lys Asp Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr
1 5 10 15
Pro Phe Glu Ile Pro Ala Leu Gln Pro Gly Arg Thr Cys Gly Ala Glu
20 25 30
Glu Ser Thr Arg Ser His Val Leu Val Lys Pro Ile Ala Gly Ser Ser
35 40 45
Asn Leu Pro Cys Asn Glu Tyr Ala Phe Leu Ala Arg Gln Asn Pro Lys
50 55 60
Gly Asp Ala Leu Pro Val Ala Ser Ile Leu Arg Lys Lys Arg Pro Arg
65 70 75 80
Arg Ser Arg Asp Gly Pro Asn Ser Val Ser Glu Thr Ile Arg Arg Trp
85 90 95
Lys Glu Val Asn Gln Gln Leu Glu His Asp Pro Gln Gly Ala Lys Arg
100 105 110
Ala Arg Lys Pro Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Gln Gly
115 120 125
Lys Gly Gly Pro Glu Asn Thr Gln Cys Gly Phe Arg Gly Val Arg Gln
130 135 140
Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Val
145 150 155 160
Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Asp Ala Ala Arg
165 170 175
Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Ala Leu Ala Arg Thr
180 185 190
Asn Phe Pro Ala His Pro Ala Gln Ala Pro Ala Val Ala Leu Pro Ala
195 200 205
Ala Ile Glu Gly Val Val Arg Gly Ala Ser Ala Ser Cys Glu Ser Thr
210 215 220
Thr Thr Ser Ala Asn His Ser Asp Val Ala Ser Asn Leu Pro Arg Gln
225 230 235 240
Ala Gln Ala Leu Glu Ile Tyr Ser Gln Pro Asp Val Leu Glu Ser Thr
245 250 255
Glu Ser Val Val Leu Glu Ser Val Glu His Tyr Ser His Lys Asp Thr
260 265 270
Val Pro Asp Ala Gly Ser Ser Ile Ala Arg Ser Thr Ser Glu Glu Asp
275 280 285
Val Phe Glu Pro Leu Glu Pro Ile Ser Ser Leu Pro Asp Gly Glu Ala
290 295 300
Asp Gly Phe Asp Ile Glu Glu Leu Leu Arg Leu Met Glu Ala Asp Pro
305 310 315 320
Ile Glu Val Glu Pro Val Thr Gly Gly Ser Trp Asn Cys Gly Thr Asn
325 330 335
Thr Gly Val Glu Met Gly Leu Gln Glu Pro Leu Tyr Leu Asp Gly Leu
340 345 350
Asp Gln Gly Met Leu Glu Gly Met Leu Gln Ala Asp Tyr Pro Tyr Pro
355 360 365
Met Trp Ile Ser Glu Asp Arg Ala Met Arg Asn Pro Ala Phe His Asp
370 375 380
Ala Glu Met Ser Glu Phe Phe Glu Gly Leu
385 390
<210> 2
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
atgacggtag atcggaagga cgccgaggcg gcggcggcgg cggcgacgcc cttcgagatc 60
ccggcgctcc agcctggaag aacttgtgga gcagaggaaa gtacccggag tcatgttctc 120
gtcaaaccaa tagcaggaag cagtaatctt ccctgtaatg aatatgcatt cttggcgcgg 180
caaaacccca agggagatgc gctgccagtg gcatctattc tgcggaaaaa gcgacctcgg 240
agatcacgtg atgggcctaa ttcagtctct gaaacgatca ggcgatggaa agaagtgaac 300
caacaactgg agcatgatcc acagggtgca aagagggcga ggaagccacc tgcaaagggt 360
tcaaagaagg gctgtatgca ggggaaagga ggacctgaga atacacaatg tggattccgt 420
ggtgtaaggc aacgtacttg ggggaagtgg gttgctgaaa ttcgggagcc aaatcgggtg 480
agcaggctct ggttgggaac gttccccact gctgaggatg ctgcccgtgc ttatgacgag 540
gcagcaagag caatgtatgg cgccctggct cgtaccaact tccctgcgca tcctgcacaa 600
gctcctgctg tggctctacc agcggcaatt gaaggtgttg tacgtggtgc ttcagcatca 660
tgcgagtcta ctacaacatc agccaaccac tcagatgttg cttctaactt gccgcgacaa 720
gctcaagctc ttgagattta ctcccagcca gatgtgcttg agtccaccga atcagttgtg 780
ctggagtctg tcgagcatta cagccataaa gacactgttc ctgatgctgg ctcaagcatt 840
gcaaggagca catccgaaga ggatgtgttc gagccattgg agcctatttc cagtttgccg 900
gatggggaag cagacggttt tgatatagaa gaattactga gattgatgga agccgaccca 960
attgaagttg agccggtcac tgggggctcc tggaattgtg gaaccaacac tggcgtggag 1020
atgggcctgc aggaacctct ctacctggat ggcttggacc aaggcatgct ggagggcatg 1080
ctgcaagctg attatcctta cccaatgtgg atatcagagg atcgggccat gcgcaaccct 1140
gccttccatg atgctgagat gagcgagttc ttcgaagggt tgtga 1185

Claims (5)

1.一种识别小麦内源性DREB4蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所选用的蛋白为DREB4A，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述识别小麦内源性DREB4蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤包含DREB4A的原核表达及纯化：
对DREB4A序列进行合成，将合成的DREB4A序列与大肠杆菌表达载体PET30a通过同源重组的方法连接；
将连接产物转入DH5α感受态细胞中，冰上放置15min，42℃水浴热激90s，冰上放置2min，加入1mL无任何抗生素的LB液体培养基，37℃、210r水平摇1h，取100uL涂于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑取10个单克隆进行PCR检测，送阳性信号最强的2个单克隆到北京擎科生物科技有限公司进行测序；
对测序正确的单克隆进行摇菌、质粒提取；将提取好的质粒转入BL21感受态细胞中，剩余步骤同DH5α感受态细胞转化；
挑单克隆置于5mL LB液体培养基中,37℃过夜培养，吸取1mL菌液加入到300mL LB液体培养基中进行扩大培养，待菌液OD值为0.6-08范围内，加入终浓度为50mM的IPTG进行诱导表达，28℃过夜培养，6000r离心10min收集菌体沉淀，用1*PBS清洗1次，加入40mL 1*PBS重悬，超声破碎；离心后，分别将沉淀、上清进行SDS电泳检测，上清通过His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。纯化后的蛋白置于透析袋中，4℃过夜透析，置于-20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述识别小麦内源性DREB4蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤还包含小麦DREB4多克隆抗体制备：
(1)饲养实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，待兔子长至1-2kg时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂和0.3mg的DREB4A融合蛋白在每只兔子皮下注射第1针，标记为第1天；
(2)第12天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和0.15mg的DREB4A融合蛋白在兔子皮下注射第2针；
(3)第26天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和0.15mg的DREB4A融合蛋白在兔子肌肉注射第3针；
(4)第40天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和0.15mg的DREB4A融合蛋白在兔子肌肉注射第4针；
(5)第53天，取兔子血清进行Western blot验证。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的完全弗氏佐剂为液体石蜡：羊毛脂的体积比为2:1的组合物。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的不完全弗氏佐剂为含有20mg/mL卡介苗的完全弗氏佐剂。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6670528B1 (en) * 1998-10-14 2003-12-30 Independent Administrative Institute, Japan International Research Center For Agricultural Sciences Environmental stress-tolerant plants
CN101605902A (zh) * 2007-01-31 2009-12-16 巴斯福植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状和/或提高的非生物胁迫抗性的植物和制备该植物的方法
CN104447991A (zh) * 2014-11-26 2015-03-25 遵义医学院附属医院 白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用
CN113087788A (zh) * 2021-03-22 2021-07-09 山东省农业科学院作物研究所 一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6670528B1 (en) * 1998-10-14 2003-12-30 Independent Administrative Institute, Japan International Research Center For Agricultural Sciences Environmental stress-tolerant plants
CN101605902A (zh) * 2007-01-31 2009-12-16 巴斯福植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状和/或提高的非生物胁迫抗性的植物和制备该植物的方法
CN104447991A (zh) * 2014-11-26 2015-03-25 遵义医学院附属医院 白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用
CN113087788A (zh) * 2021-03-22 2021-07-09 山东省农业科学院作物研究所 一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACCESSION NO.: AY781354.1: "Triticum aestivum DREB transcription factor 4A (DREB4) Mrna, complete cds, alternatively spliced", GENBANK, 12 December 2005 (2005-12-12) *
范玉清;刘恒;任伟;夏光敏;: "拟南芥DREB 1A转录因子的原核表达和多克隆抗体制备", 植物生理学通讯, no. 03, 20 June 2007 (2007-06-20), pages 147 - 151 *
范玉清等: "拟南芥转录因子DREB1A的原核表达和多克隆抗体制备", 植物生理学通讯, vol. 43, no. 3, 20 June 2007 (2007-06-20), pages 147 - 151 *

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