CN1908007B - 一种植物总蛋白的提取方法及其专用提取液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物总蛋白的提取方法及其专用提取液。该植物总蛋白提取液是含有乙二胺四乙酸80-120mM，三羟甲基氨基甲烷80-120mM，四硼酸钠40-60mM，维生素C 40-60mM，质量体积浓度为0.8-1.2％的聚乙烯聚吡咯烷酮，体积百分浓度0.8-1.2％Triton-100，体积百分浓度1.5-2.5％2-巯基乙醇和质量体积浓度为28-32％蔗糖的水溶液，最终pH值为7.5-8.5。本发明的植物蛋白提取液及BPP法有效地解决了双向电泳蛋白质样品制备中的盐离子问题，可广泛应用于各种植物特别是盐生植物和嗜盐微生物的蛋白质组学研究中，应用前景广阔。

Description

一种植物总蛋白的提取方法及其专用提取液

技术领域

本发明涉及蛋白质组学研究领域中的植物总蛋白的提取方法及其专用提取液。

背景技术

在蛋白质组学研究中，目前最有效的方法是通过双向电泳技术(2-DE)分离蛋白质，然后对分离蛋白进行质谱鉴定(G

rg A，Weiss W，Dunn M J.Currenttwo-dimensional electrophoresis technology for proteomics.Proteomics，2004，4：3665-3685.)。由于各种用于双向电泳的蛋白质提取方法，往往因为植物种类和组织部位的不同而差别很大，因此，提取高质量的蛋白质，成为双向电泳以及后期质谱鉴定工作中最具挑战性的工作之一。植物组织通常含有大量顽拗性物质，如多糖、酯类和多酚等，会影响双向电泳分离蛋白的效果，进而干扰后期的质谱鉴定工作(Wang W，Scali M，Vignani R，Spadafora A，Sensi E，Mazzuca S，Cresti M.Proteinextraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf，a plant tissuecontaining high levels of interfering compounds.Electrophoresis，2003，24：2369-2375.)。

目前，已有多种蛋白质提取方法被应用于甜土植物的蛋白质组学研究中，并且也获得了理想的双向电泳结果。其中，应用最为广泛的是三氯乙酸-丙酮沉淀(TCA)法(Saravanan R S and Rose J C.A critical evaluation of sample extractiontechniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues.Proteomics，2004，4：2522-2532.)，此法在防止蛋白质降解和去除干扰性杂质方面具有很好的效果，但经三氯乙酸-丙酮沉淀的蛋白质很难完全溶解，因而常常造成蛋白质的丢失。另一种常用的方法是E-TCA法，该法与TCA提取法类似，但是在提取液中添加了EGTA，并且增加了匀浆步骤，获得了更好的蛋白提取效果(Shen SH，Jing Y X，Kuang T Y.Proteomics approach to identify wound-response related proteinsfrom rice leaf sheath.Proteomics，2003，3：527-535.)。此外，还有一种酚抽(Phe)法，该方法的基本原理是通过将蛋白质溶解在Tris饱和酚(Phenol)中，然后通过反复抽提除去各种杂质，最后利用醋酸铵饱和的甲醇溶液将酚相中的蛋白质沉淀下来(Carpentier S C，Witters E，Laukens K，Deckers P，Swennen R and Panis B.Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues：An evaluationof different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis.Proteomics，2005，5：2497-2507.)。在酚抽法中，利用蛋白质溶于Tris饱和酚的特性，通过加入提取液反复抽提，可以有效的去除不溶于有机溶剂的杂质，并且在抽提过程中，大多数盐离子被留在提取液中，从而起到一定程度的除盐作用(Li X F，HanH P，Wang X C，Fan P X and Li Y X.Extraction methods for two-dimensionalelectrophoresis analysis of shoot proteins in halophyte Salicornia europaeaL.Acta Ecologica Sinica，2006，26：1848-1853.)，但是在植物细胞中，多酚类物质会以氢键与蛋白质不可逆结合，导致双向电泳胶图像中出现成片状弥撒现象，一些难溶性碳化物还会堵塞IPG胶条的胶孔，从而延长聚焦时间，最终导致拖尾和部分蛋白质丢失。另外，植物细胞中广泛存在的萜类物质、色素、酯类和蜡脂类物质等，同样会造成胶上的弥散现象，因此在制备用于2-DE的蛋白质样品的时候，一定要尽可能地除尽上述杂质。

然而，双向电泳技术在盐生植物的蛋白质组研究中应用得还较少，其中最主要的原因是盐生植物组织中含有大量的盐分，而过多的盐离子会严重干扰双向电泳的等电聚焦过程，导致最终蛋白分离结果很难让人满意。盐角草(Salicornia europaea)是藜科的一种常见的真盐生植物(Davy A J，Bishop G F and Costa C B.SalicorniaL.(Salicornia pusilla J.Woods，S.ramosissima J.Woods，S.europaea L，S.obscura P.W.Ball&Tutin，S.nitens P.W.Ball&Tutin，S.fragilis P.W.Ball&Tutin and S.dolichostachya Moss).Journal of Ecology，2001，89：681-707.)，与其它盐生植物的不同之处是，盐角草拥有非常特殊的肉质化的茎，这种茎中含有大量的盐分，使用常规的蛋白质提取方法不能很好的去除其中的盐离子，因此，很难从盐角草中提取出可以满足双向电泳要求的总蛋白。

蛋白质样品中较高的盐离子会导致IPG胶条的电导性大大增强，从而严重影响2-DE中的等电聚焦过程，使得最终的聚集电压很难达到设定的高压。通常，在盐离子还没有转移到胶条的两端之前，蛋白质并不能很好的聚焦；而盐离子转移过程，无疑会延长等电聚焦的时间，过长的聚焦时间则会由于水分蒸发等原因，使得最终聚焦效果不好(2-DE manual，Amersham Biosciences)。因此，在进行2-DE时，首要的也是最关键的一步，是如何制备总盐离子浓度低于10mM的蛋白质样品(2-DE manual，Amersham Biosciences)。有文献报道说，当采用胶条水化上样时，样品中的盐离子同样要求低于10mM(Bongani K N，Stephen C，William J S and Antoni R S.Identification of Arabidopsis salt and osmotic stress reaponsive proteinsusing two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry.Proteomics，2005，5：4185-4196)。虽然采用样杯上样时，样品中的盐离子浓度可以达到50mM，但是，当盐离子浓度高于100mM时，无论如何都应该先除盐(Grg A，Weiss W，Dunn MJ.Current two-dimensional electrophoresis technology forproteomics.Proteomics，2004，4：3665-3685.)。

盐角草是一种具有聚盐特征的真盐生植物，其组织中含有大量的盐分。因此，在进行盐角草2-DE蛋白样品制备的时候，必须通过除盐或者其它方法将盐离子降低到可以忍受的程度。常用的除盐方法主要有透析、沉淀、重悬等方法(2-DE manual，Amersham Biosciences)，当额外增加除盐步骤时，或多或少会造成蛋白质的部分丢失。另外，近来有文献报道了一种过柱子除盐的方法(Chang W C，So H L，Jiyeon C，Soo J P，Dong J H，Hyo J K and Chan W K.Improvement of the two-dimensionalgel electrophoresis analysis for the proteome study of Halobacterium salinarum.Proteomics，2003，3：2325-2329.)，据说在制备盐细菌蛋白时具有很好的效果。但这种柱子价格昂贵，并且在过柱子洗脱时，同样不可避免造成蛋白质、特别是低分子量的蛋白的丢失。

最近，Kirkland等人报道了利用Trizol试剂，同样可以从盐生真菌中提取适合于双向电泳的蛋白质(Kirkland P A，Busby J，Stevens J S and Julie A M.Trizol-basedmethod for sample preparation and isoelectric focusing of halophilic proteins.Anal Biochem，2006，351：254-259)。另外，Hossein等人也通过TCA法从盐生植物碱蓬(Suaeda aegyptiaca)中提取到能够用于双向电泳的总蛋白(Hossein A，Johan E，Mohsen H，Mohammad K and Ghasem H S.Effects of salinity levels on proteomeof Suaeda aegyptiaca leaves.Proteomics，2006，6：2542-2554)。但是，由于同样存在一定程度的盐离子干扰，使得等电聚焦不完全，他们的双向电泳图中均存在较为明显的横向和纵向拖尾。

TCA法是一种经典而有效适用于双向电泳的蛋白质样品制备方法，其最大的优越性在于能够快速有效的抑制各种蛋白酶的活性。但该法主要应用在动物及某些模式植物中；另外，该法的明显缺陷是经过TCA沉淀下来的蛋白质很难溶解，并且没有办法去除样品中的盐离子。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白质组学研究领域中的植物总蛋白的提取方法及其专用提取液。

本发明所提供的植物总蛋白提取液，是含有乙二胺四乙酸(EDTA)80-120mM，三羟甲基氨基甲烷(Tris)80-120mM，四硼酸钠(Borax)40-60mM，维生素C(VitaminC)40-60mM，质量体积浓度为0.8-1.2％的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，体积百分浓度0.8-1.2％Triton-100，体积百分浓度1.5-2.5％2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)和质量体积浓度为28-32％蔗糖的水溶液，最终pH值为7.5-8.5。

上述植物总蛋白提取液中，乙二胺四乙酸的浓度优选为100mM，三羟甲基氨基甲烷的浓度优选为100mM，四硼酸钠的浓度优选为50mM，维生素C的浓度优选为50mM，聚乙烯聚吡咯烷酮的浓度优选为1％，Triton-100的浓度优选为1％，2-巯基乙醇的浓度优选为2％，蔗糖的浓度优选为30％，最终pH值优选为8.0。

本发明的第二个目的是提供一种提取率较高的植物总蛋白的提取方法。

本发明所提供的植物总蛋白的提取方法，命名为BPP法(取提取过程中所需三种重要化学成分四硼酸钠(Borax)，聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)和酚(Phenol)英文名称的首写字母)，包括以下步骤：

1)对植物材料进行研磨，然后加入上述蛋白提取液2-4mL/克植物材料，室温下涡混4-10分钟；

2)加入pH 7.5-8.5的Tris饱和酚，室温下涡混5-15分钟；所述Tris饱和酚的添加量为步骤1)中含植物材料的提取液总体积的1.5-2.5倍；

3)离心，吸取上层酚相，将其与上述蛋白提取液混合，室温下涡混4-10分钟；所述蛋白提取液的添加量为酚相体积的0.8-1.2倍；

4)离心，吸取上层酚相，将其与硫酸铵过饱和的体积百分浓度约为0.1-0.5％的甲醇溶液，在-25℃至-15℃下沉淀至少6小时；所述硫酸铵饱和的甲醇溶液的添加量为酚相体积的4-6倍；

5)离心，弃上清，将沉淀先用预冷的体积百分浓度为100％的甲醇进行洗涤1-2次，再用预冷的含体积百分浓度为0.05-0.09％β-巯基乙醇的丙酮洗涤2-3次，室温干燥，得到植物总蛋白干粉。

在上述提取方法中，步骤1)中蛋白提取液的添加量优选为3mL/克植物材料，涡混时间优选为5分钟。

步骤2)中Tris饱和酚的pH值优选为8.0，其添加量优选为步骤1)中含植物材料的提取液总体积的2倍，涡混时间优选为10分钟。

步骤3)中蛋白提取液的添加量优选为酚相体积的1倍，涡混时间优选为5分钟。

步骤4)中的沉淀温度优选为-20℃，沉淀时间优选为8-12小时，硫酸铵过饱和的甲醇溶液的添加量优选为酚相体积的5倍。

步骤5)中甲醇的预冷温度优选为-20℃，用甲醇对沉淀洗涤的次数优选为1次；丙酮的预冷温度优选为-20℃，丙酮中β-巯基乙醇的体积百分浓度优选为0.07％，用丙酮对沉淀洗涤的次数优选为2次。

步骤3)-5)中的离心条件均优选为在4℃、15000g下离心10分钟。

上述植物总蛋白的提取方法适用于多种植物，特别是盐生植物。

本发明提供了一种植物总蛋白的提取方法(BPP法)及其专用提取液。在本发明的植物总蛋白提取液中，四硼酸钠的作用是通过共沉淀的方式有效的去除顽拗性植物组织中大部分难溶性的大分子杂质(如多糖、多酚等)；PVPP、2-巯基乙醇和维生素C等还原剂的作用是提供一个强的还原环境，从而可有效地防止多酚氧化成多醌，抑制多种蛋白酶的活性。与酚抽法相同，本发明的提取方法中也有用Tris饱和酚进行抽提的步骤，通过反复抽提，可以有效的去除不溶于有机溶剂的杂质，并且在抽提过程中，大多数盐离子被留在提取液中，起到了一定程度的除盐作用；此外，用硫酸铵过饱和的甲醇溶液作蛋白沉淀剂可以进一步去除样品中的干扰性杂质和盐离子。利用本发明的提取液与酚的反复抽提过程，可除去萜类、色素、酯类和蜡脂类等多种杂质，最终获得高质量的蛋白质。用TCA法、E-TCA法、酚抽法和本发明的BPP法提取经不同浓度NaCl处理的盐角草总蛋白，通过双向电泳检测提取效果，结果用BPP法提取的蛋白聚焦效果最好，能够获得更多的蛋白点。用BPP法从高盐(800mM NaCl)处理的盐角草根中提取总蛋白，进行单向和双向电泳检测，同样获得了很好的结果，说明用BPP法可以从根等顽拗的植物组织中提取高质量的总蛋白。同时，用BPP法提取包括银杏、柳树、水杉和山核桃等木本植物在内的十六种常见植物不同组织的蛋白质，结果均获得了较高蛋白提取率，且单向SDS-PAGE检测结果非常理想，表明该BPP法具有广谱性，可用于多种植物的蛋白质组研究中。本发明的植物蛋白提取液及BPP法有效地解决了双向电泳蛋白质样品制备中的盐离子问题，可广泛应用于各种植物，特别是盐生植物和嗜盐微生物的蛋白质组学研究中，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为经过0、200和800mM NaCl处理一个月的盐角草的生长情况及用TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法提取盐角草不同组织的蛋白的SDS-PAGE检测结果

图2为用BPP法提取不同植物不同组织的总蛋白的SDS-PAGE检测结果

图3为用TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法提取的经200mM NaCl处理的盐角草地上部分总蛋白的双向电泳检测结果

图4为用TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法提取的经200mM NaCl处理的盐角草地上部分总蛋白在2-DE胶上具有代表性的区域比较结果

图5为用本发明BPP法及不同蛋白沉淀剂提取经200mM NaCl处理的盐角草地上部分总蛋白的蛋白沉淀效果的双向电泳比较结果

图6为用本发明BPP法从经800mM NaCl处理的盐角草不同组织提取总蛋白的双向电泳检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

试剂：

尿素(电泳级)和碘乙酰胺购自GE Healthcare(Piscataway，NJ，USA)；Acr，Bis，SDS，DTT(dithiothreitol)购自Merck(Darmstadt，Germany)；PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)，CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylamonio]-1-propanesulfonate)，CBB G-250和甘氨酸购自Amresco(Solon，OH，USA)；β-巯基乙醇购自Fluka(Buchs，Switzerland)；PVPP购自Sigma(St.Louis，MO，USA)；Tris，EDTA(ethylene diaminetetracetieacid)和Tris饱和酚购自鼎国公司(北京)；Triton X-100，过硫酸铵和TEMED购自赛百盛公司(北京)；三氯乙酸，丙酮，蔗糖，氯化钠，氯化钾，硼砂，乙酸铵，甲醇，乙醇，磷酸，甘油，硫酸铵和乙酸均为分析纯，购自北京化工厂。下述实施例中所用到的其它试剂均购自Amersham公司(Amersham Biosciences，Sweden)。双向电泳中所用到的水为超纯水。

实施例1、TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法提取盐角草(Salicorniaeuropaea)总蛋白提取效果的单向电泳比较

目前常用的植物蛋白质提取方法主要有TCA、E-TCA和酚抽法，现以经不同浓度NaCl处理的真盐生植物盐角草(Salicornia europaea)为材料，利用SDS-PAGE单向电泳比较TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法的提取效果，具体方法包括以下步骤：

1、盐角草的培养及盐处理

盐角草具有显著的聚盐特性，并且需要在一定的盐分条件下，长势才能达到最佳状态(Davy A J，Bi shop G F and Costa C B.Salicornia L.(Salicornia pusillaJ.Woods，S.ramosissima J.Woods，S.europaea L.，S.obscura P.W.Ball & Tutin，S.nitens P.W.Ball & Tutin，S.fragilis P.W.Ball & Tutin and S.dolichostachyaMoss).Journal of Ecology，2001，89：681-707.)，具体培养方法如下：

1)播种：将盐角草种子用蒸馏水洗净后，置于装满跖石的9cm×9cm塑料花盆中，再撒上一层细砂覆盖，用蒸馏水浇灌，让跖石充分吸水。

2)待种子萌发一周后，改用1/2 Hoagland营养液浇灌，每3天1次，浇透。将盐角草种植于植物温室中，日间温度设为25-30℃，夜间温度设为18-20℃，相对湿度设为60-80％，每天光照16h。

3)盐处理：播种60天后，当幼苗株高约为5-7cm时，分别用含有0mM(对照)、200mM和800mM NaCl的1/2 Hoagland营养液对幼苗进行盐处理，每周浇灌一次。

一个月后，经不同盐浓度处理植株的生长情况见图1中的图A，经200mM NaCl处理的盐角草明显比未经盐处理(对照)和经800mM高盐处理的植株生长得好，株高和生物量都显著增加，在800mM NaCl高盐处理条件下，盐角草的生长反而受到抑制。同时用火焰光度法测量经不同盐浓度处理的盐角草地上部分的钠离子含量，结果经0mM、200mM和800mM NaCl处理的盐角草的地上部分每克干物质中，Na⁺含量分别约为8、10和13mg，表明经NaCl处理的盐角草具有较高的盐分，进行电泳样品制备时会面临如何脱盐的棘手问题。

2、用TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法提取盐角草不同组织的蛋白

植物总蛋白提取液：EDTA 100mM，Tris 100mM，Borax 50mM，Vitamin C 50mM，质量体积浓度为1％的PVPP，体积百分浓度1％Triton-100，体积百分浓度2％2-巯基乙醇和质量体积浓度为30％蔗糖的水溶液，最终pH值为8.0。

现用TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法提取步骤1经800mM NaCl处理的盐角草不同组织的蛋白。用TCA法和E-TCA法提取幼茎和老茎的蛋白，用酚抽法和本发明的BPP法提取幼茎、老茎和根部的蛋白，同时以用BPP法提取的未经NaCl处理植株幼茎的蛋白为对照，其中本发明的BPP法包括以下步骤：

1)对植物材料进行研磨，然后加入上述蛋白提取液3mL/克植物材料，室温下涡混5分钟；

2)加入pH 8.0的Tris饱和酚，室温下涡混5分钟；所述Tris饱和酚的添加量为步骤1)中含植物材料的提取液总体积的2倍；

3)在4℃、15000g下离心10分钟，吸取上层酚相，将其与上述蛋白提取液混合，室温下涡混5分钟；所述蛋白提取液的添加量为酚相体积的1.0倍；

4)在4℃、15000g下离心10分钟，吸取上层酚相，将其与硫酸铵过饱和的甲醇溶液(体积百分浓度约为0.1-0.5％)，在-20℃下沉淀6-12小时；所述硫酸铵过饱和的甲醇溶液的添加量为酚相体积的4-6倍；

5)在4℃、15000g下离心10分钟，弃上清，将沉淀先用预冷的体积百分浓度为100％的甲醇进行洗涤1次，再用预冷的含体积百分浓度为0.07％β-巯基乙醇的丙酮洗涤2次，室温干燥，得到蛋白干粉。

3、用TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法提取的盐角草不同组织的蛋白的SDS-PAGE单向电泳检测

现对步骤2用TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法提取经800mM NaCl处理的盐角草不同组织的蛋白进行SDS-PAGE单向电泳检测，比较提取效果。检测结果见图1中的图B(泳道1-4为用BPP法提取的蛋白样品：泳道1(根部)、泳道2(幼茎)、泳道3(老茎)、泳道4(对照植株的幼茎)；泳道5-7用酚抽法提取的蛋白样品：泳道5(幼茎)、泳道6(老茎)、泳道7(根部)；泳道8-9用TCA法提取的蛋白样品：泳道8(幼茎)、泳道9(老茎)；泳道10-11用E-TCA法提取的蛋白样品：泳道10(幼茎)、泳道11(老茎)；泳道M为Marker)，蛋白的SDS-PAGE单向分离效果不错，用这四种方法提取的经800mM NaCl处理的盐角草不同组织的蛋白条带均比较清晰，并且分布范围几乎覆盖了大于94kDa和小于14kDa分子量的区域。通常判断单向SDS-PAGE胶质量好坏的标准有三条，即染色背景的深浅、是否发生弥散现象以及蛋白条带是否变型(Saravanan R S and Rose J C.A critical evaluation of sampleextraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant planttissues.Proteomics，2004，4：2522-2532.)。由图1中的图B可以看出，与BPP法及酚抽法相比，用TCA法和E-TCA法提取的样品的胶具有更深的染色背景(泳道8-11)，说明蛋白样品中含有较多的不可溶性杂质。值得注意的是，利用TCA法和E-TCA法提取的个别样品(见图1中图B的泳道9泳道10)中，蛋白条带发生了一定程度的扭曲。虽然所有蛋白样品在高分子量和低分子量区域均没有发生明显的弥散现象，同时在上样孔附近也没有发现明显的污染物质，但用酚抽法和BPP法提取的盐角草根部(泳道1和泳道7)、幼茎(泳道2和泳道5)和老茎(见图1中图B的泳道3和泳道6)的蛋白样品与用TCA法和E-TCA法提取的蛋白样品相比，用酚抽法和BPP法可获得更多的清晰蛋白条带，背景也要浅得多，表明用酚抽法和BPP法提取盐角草蛋白比用TCA法和E-TCA法的提取效果佳。此外，与酚抽法相比，在用本发明BPP法提取的蛋白的单向胶上，特别是在低分子量区域，可以得到更多的蛋白带。上述检测结果表明四种提取方法中，本发明BPP法的植物蛋白提取质量最高。

实施例2、用BPP法提取不同植物不同组织蛋白提取效果的SDS-PAGE单向电泳检测

现用本发明的BPP法提取十四种植物不同组织的总蛋白，其中包括四种非常难提取的木本植物(松树(Pinus bungeana Zucc.)、加拿大杨树(Populus canadensisMoench.)、山核桃(Carya illinoinensis K.)和碧桃(Prunus persica Rehd.)，对提取效果进行SDS-PAGE检测，检测结果如图2所示(泳道1-3分别为从松树(Pinusbungeana Zucc.)的针叶(泳道1)、枝条韧皮部(泳道2)和木质部(泳道3)中提取的总蛋白；泳道4-6分别为从加拿大杨树(Populus canadensis Moench.)的叶(泳道4)、枝条韧皮部(泳道5)和木质部(泳道6)中提取的总蛋白；泳道7-16分别为从山核桃(Carya illinoinensis K.，泳道7)、碧桃(Prunus persica Rehd.，泳道8)、芭蕉(Musa nana Lour，泳道9)、棉花(Gossypium hirsutum L.，泳道10)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.，泳道11)、烟草(Nicontiana tabacum L.，泳道12)、水稻(Oryza sativa L.，泳道13)、番茄(Lycopersicon esculentum Mill.，泳道14)、番杏(Tetragonia tetragonioides 0.，泳道15)和蒲公英(Taraxacum officinaleWeber.，泳道16)的成熟叶片中提取的总蛋白；泳道M：标准蛋白分子量；星号指示的为杨树32kDa营养贮藏蛋白质；箭头所指条带分别为Rubisco大亚基(RLU)和小亚基(RSU))，结果非常理想，各蛋白条带均很清晰，没有弥散现象，说明本发明的BPP法可以从多种植物和组织中提取高质量的总蛋白。从图2还可以看出，不同植物样品中，大多数蛋白质主带都在相同的位置上，说明不同植物中存在许多保守的蛋白；但在低分子量区域，不同植物蛋白质条带的位置差别较大，体现了不同植物之间蛋白质表达谱的差异性。值得注意的是，不同植物的Rubisco大亚基(RLU)均在相同的位置，而小亚基(RSU)的位置则不尽相同，说明不同植物的Rubisco小亚基的分子量会有所不同。

实施例3、用BPP法提取不同植物不同组织蛋白的产率

用BPP法提取十六种常见植物(植物名称见表1)不同部位和不同组织的总蛋白，并测定蛋白含量，计算蛋白提取率，方法为：先用Bradford法对蛋白质进行定量(Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.AnalBiochem，1976，72：248-254.)，利用紫外分光光度计(Shimadzu UV-160，Kyoto，Japan)，然后测定OD₅₉₅值，计算蛋白质提取产率，以牛血清蛋白(BSA)作为标样进行校正。蛋白产率检测结果如表1所示，用BPP法可以从每克新鲜植物材料中平均提取到2.0毫克蛋白。从叶片中提取的蛋白质产率要比其它组织高一些，叶中平均蛋白产率为每克新鲜材料提取2.2毫克蛋白，而从其它组织中提取的蛋白平均产率为每克新鲜材料提取1.8毫克蛋白。

其中，从盐角草肉质化的地上部分提取的蛋白质产率要比从其它植物组织中提取的蛋白产率稍低，可能与其肉质化茎中含有较多水分和其它渗透调节物质有关。同时还统计了用TCA法、E-TCA法和酚抽法提取的盐角草地上部分所得的蛋白产率，分别可从每克鲜材料中平均提取到1.6、1.5和2.1毫克蛋白。上述统计结果表明，用BPP法和酚抽法可以比用TCA和E-TCA法得到更高的蛋白产率，原因可能是由于BPP法和酚抽法中，都用到了酚。酚是一种很强的变性剂，可以有效地裂解细胞，破坏生物大分子的高级结构；同时，酚又是一种很好的蛋白质有机溶剂，可以有效的溶解蛋白。

表1  用BPP法提取不同植物和不同组织的蛋白质的产率

植物种类中文名/拉丁名	组织部位	蛋白产率(μg/g)	备注
				盐角草Salicornia europaea L.拟南芥Arabidopsis thaliana L.烟草Mcontiana tabacum L.水稻Oryza sativa L.棉花Gossypium hirsutum L.番茄Lycopersicon esculentum L.蒲公英Taraxacum officinale Weber番杏Tetragonia tetragonioides，银杏Ginkgo biloba L.柳树Salix arbuscula L.水杉Metasequoia glyptostroboides山核桃Carya pecan Graebn芭蕉Musa nana Lour.松树Pinus bungeana L.杨树Populus canadensis Moench碧桃Prunus persica Rehd	幼茎老茎根叶片叶片叶片叶片叶片叶片叶片叶片叶片叶片叶片叶片针叶韧皮部木质部叶片韧皮部木质部叶片韧皮部木质部	1820±3341980±2832289±2032250±3212480±3342260±3121880±2722242±3022250±3721900±2752120±4422408±4782174±3241969±2122120±3011960±3521550±1691250±892024±2321850±1992012±3052176±2881769±2651808±179	真盐生植物顽拗组织模式植物模式植物模式植物木本植物木本植物木本植物木本植物木本植物顽拗性组织木本植物木本植物

实施例4、TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法提取经200mM NaCl处理的盐角草地上部分总蛋白的提取效果的双向电泳比较

用TCA法、E-TCA法、酚抽法及本发明BPP法提取实施例1获得的经200mM NaCl处理的盐角草地上部分的总蛋白，用双向电泳检测提取效果，双向电泳方法包括以下步骤：

1)等电聚焦

将蛋白干粉溶于蛋白裂解液(9M urea，2％CHAPS，13mM DTT，1％IPG缓冲液，pH3-10或4-7)中，混匀后室温下放置约2小时，然后在21℃下20000g离心30分钟，吸取上清，上清即为蛋白提取产物。采用24cm、pH3-10的线性IPG胶条(GE Healthcare)，采用胶内水化方式上样，用Ettan IPGphor电泳仪(Ettan IPGphor II IEF Unit，GEHealthcare)并参照Amersham公司的双向电泳说明书进行等电聚焦，上样量为700μg总蛋白，其中水化时间延长为24小时，在8000V高压下的聚焦时间：pH 3-10的IPG胶条为100kVh。

2)第二向SDS-PAGE电泳

聚焦完成后，立即进行第二向SDS-PAGE，采用12.5％分离胶，用Ettan Daltsix电泳仪(GE Healthcare)并参照Amersham公司的双向电泳说明书进行SDS-PAGE。

3)染色和凝胶图像分析

第二向SDS-PAGE电泳完成后，将凝胶用改进的考马斯亮蓝法(Neuhoff V，AroldN，Taube D，Ehrhardt W.Improved staining of proteins in polyacrylamide gelsincluding isoelectric focusing gels with clear background at nanogramsensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.Electrophoresis，1988，9：255-262.；Canadiano G，Bruschi M，Musante L，Santucci L，GhiggeriG M，Carnemolla B，Orecchia P，Zardi L and Righetti P G.Blue silver：A verysensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.Electrophoresis，2004，25：1327-1333.)进行染色，然后用ImageScanner labscan扫描仪(GE Healthcare)进行图像扫描，用ImageMasterTM 2D Platinum Software(Version 5.0，GE Healthcare)软件进行图像分析。

双向电泳检测结果如图3所示(A：TCA法，B：E-TCA法，C：酚抽法，D：BPP法。A-F方框区域为具有代表性的蛋白区域)，从用上述四种不同方法提取的经200mM NaCl处理的盐角草地上部分的总蛋白的2-DE胶上，均可检测到至少几百个蛋白点。总体来讲，利用酚抽法和BPP法提取的蛋白样品要比用TCA法和E-TCA法提取的蛋白样品得到更多的蛋白点，并且横向和纵向拖尾都要少得多。其中，用TCA法可以得到约420个蛋白点，而且胶的背景很深，在靠近阴极的胶上具有非常严重的纵向拖尾(见图3中的图A)。在E-TCA法中，通过加入1/4体积的50％TCA沉淀蛋白，可以去除一部分盐离子，因而结果稍好，可以检测到约630个蛋白点，但在整张胶、特别是在分子量约为60kDa的Rubisco大亚基区域附近，具有明显的横向条文(见图3中的图B)。相对来讲，酚抽法的提取效果较好，可以得到约1150个蛋白点，但也存在一定程度的横向拖尾(见图3中的图C)。与其它三种方法相比，用本发明BPP法提取蛋白的2-DE胶，背景非常干净，几乎见不到拖尾和弥散现象，可以检测到约1560个蛋白点(见图3中的图D)，蛋白点形状为圆形或者椭圆形(见图3中图D的A-F方框区域)，说明聚焦充分，值得注意的是，在2-DE胶靠近两极、甚至在RLU区域(见图3中图D的A方框区域)，均没有明显的拖尾，进一步说明用本发明BPP法提取的蛋白质样品质量很高，进行双向电泳时能获得较好的检测结果。

由图3可以看出，用上数四种不同方法提取的蛋白样品在2-DE胶上存在显著差异，现从中选取6个具有代表性的区域进行放大，对其做进一步分析。放大图如图4所示(A-F分别为从四张胶上所选择的六个具有代表性的相对应的区域)，在所选择的六个区域中，用TCA法和E-TCA法提取样品的蛋白点数要比用酚抽法和BPP法提取样品的蛋白点数少许多；此外，用本发明BPP法可以得到和酚抽法一样形状的蛋白点(圆形或者椭圆形)，说明两者聚焦都很充分，但是，在许多区域，用酚抽法得到的蛋白点要比BPP法少，特别是在酸性端和低分子量区域，这种差异更加突出(见图4中相应的C、E和F区域)。

实施例5、不同蛋白质沉淀试剂沉淀效果的比较

在提取植物蛋白的过程中，用醋酸铵饱和的甲醇溶液(约0.1M醋酸铵)在低温下沉淀蛋白最先在酚抽法中得到应用，由于效果不错，后来被广泛应用于甜土植物蛋白质的提取中(Hurkman W J and Tanaka C K.Solubilization of Plant MembraneProteins for Analysis by Two-Dimensional Gel Electrophoresis.Plant Physiol，1986，81：802-806.；Mijnsbrugge K V，Meyermans H，Montagu M V，Bauw G，BoerjanW.Wood formation in poplar：identification，characterization，and seasonalvariation of xylem proteins.Planta，2000，210：589-598.)。现分别以醋酸铵饱和的甲醇溶液和用硫酸铵饱和的甲醇溶液为蛋白沉淀剂，用本发明的BPP法提取实施例1获得的经200mM NaCl处理的盐角草地上部分的总蛋白，除蛋白沉淀剂不同外，其它操作均一致，在沉淀蛋白前，先将样品分成两等份，分别用5倍体积的硫酸铵或醋酸饱和的甲醇溶液作为沉淀剂沉淀蛋白质，然后用双向电泳(上样量为700微克)检测蛋白沉淀效果，考染染色。

双向电泳检测结果如图5所示(A：以硫酸铵饱和的甲醇溶液作为沉淀剂提取的蛋白；B：以醋酸铵饱和的甲醇溶液作为沉淀剂提取的蛋白。a-d方框内区域为具有代表性的蛋白区域)，虽然用两种不同沉淀剂均能得到一千多个蛋白点，但用硫酸铵饱和的甲醇溶液沉淀时获得的蛋白点数更多；而以醋酸铵饱和的甲醇溶液作为沉淀剂时，许多蛋白质都丢失了，如一些低分子量蛋白(见图5中的区域c和d)，一些位于阴极附近区域(见图5中的区域b和d)的蛋白丢失现象则更为严重。另外，在RLU位置附近的蛋白丢失也很严重(见图5中的区域a)，原因可能是硫酸铵在甲醇中的溶解度很低，而醋酸铵则相对较高，因此，采用硫酸铵饱和的甲醇溶液沉淀时，蛋白质样品中盐离子含量更低，有利于等电聚焦地进行，最终得到更多的蛋白点数。上述检测结果表明在从含有很高盐离子浓度的植物材料中提取蛋白时，用醋酸铵饱和的甲醇溶液作沉淀剂的除盐效果不佳，用2-DE电泳分离蛋白的效果没有用硫酸铵饱和的甲醇溶液作为沉淀剂的分离效果理想。

实施例6、用本发明BPP法从经800mM NaCl处理的盐角草不同组织提取总蛋白的双向电泳检测

上述实施例的检测结果表明BPP法能够有效地除盐，并且能够尽可能地减少蛋白质的丢失，同时，从pH 3-10的2-DE图(见图5中的图A)可以看出，盐角草的绝大部分蛋白质均分布在酸性区域，现进一步用本发明BPP法提取实施例1获得的经800mMNaCl处理的盐角草根部和地上部分的总蛋白，然后用pH4-7、24cm长的IPG胶条进行双向电泳(聚焦时间：120kVh)，以检测提取效果，上样量为700微克总蛋白。检测结果如图6所示(A：根；B：地上部位；M：蛋白标准分子量)，从根部和地上部分提取的蛋白经2-DE电泳后，分别获得了约1200(见图6中的图A)和1850多个蛋白点(见图6中的图B)，用pH4-7的胶条可以比用pH3-10的IPG胶条(见图5中的图A)分离，可得到至少多于300个蛋白点，表明本发明的BPP法不但可以有效克服盐离子的问题，而且可以用来提取根等顽拗组织的总蛋白。

蛋白质双向电泳中等电聚焦效果的好坏与植物样品中盐离子强度的大小直接相关，后者取决于离子浓度和电荷数，而与离子的种类无关。盐生植物细胞汁液中富集盐的类型包括氯化物，硫酸盐和碱性盐等，都不影响本方法的适用效果。上述检测结果表明本发明的植物蛋白提取液及BPP法有效地解决了双向电泳蛋白质样品制备中的盐离子问题，对其它盐生植物和嗜盐微生物蛋白质的提取都有重要的借鉴意义，可广泛应用于各种植物特别是盐生植物和嗜盐微生物的蛋白质组学研究中，应用前景广阔。

Claims (10)

1.植物总蛋白提取液，是最终pH值为7.5-8.5、由下述成分组成的水溶液：乙二胺四乙酸80-120mM，三羟甲基氨基甲烷80-120mM，四硼酸钠40-60mM，维生素C40-60mM，质量体积百分浓度为0.8-1.2％的聚乙烯聚吡咯烷酮，体积百分浓度为0.8-1.2％的Triton-100，体积百分浓度为1.5-2.5％的2-巯基乙醇和质量体积百分浓度为28-32％的蔗糖。

2.根据权利要求1所述的植物总蛋白提取液，其特征在于：所述乙二胺四乙酸的浓度为100mM，三羟甲基氨基甲烷的浓度为100mM，四硼酸钠的浓度为50mM，维生素C的浓度为50mM，聚乙烯聚吡咯烷酮的质量体积百分浓度为1％，Triton-100的体积百分浓度为1％，2-巯基乙醇的体积百分浓度为2％，蔗糖的质量体积百分浓度为30％，最终pH值为8.0。

3.一种植物总蛋白的提取方法，包括以下步骤：

1)对植物材料进行研磨，然后加入权利要求1或2所述的蛋白提取液2-4mL/克植物材料，室温下涡混4-10分钟；

2)加入pH 7.5-8.5的Tris饱和酚，室温下涡混5-15分钟；所述Tris饱和酚的添加量为步骤1)中含植物材料的提取液总体积的1.5-2.5倍；

3)离心，吸取上层酚相，将其与权利要求1或2所述的蛋白提取液混合，室温下涡混4-10分钟；所述蛋白提取液的添加量为酚相体积的0.8-1.2倍；

4)离心，吸取上层酚相，将其与硫酸铵过饱和的体积百分浓度为0.1-0.5％的甲醇溶液，在-25至-15℃下沉淀至少6小时；所述硫酸铵过饱和的甲醇溶液的添加量为酚相体积的4-6倍；

5)离心，弃上清，将沉淀先用预冷的体积百分浓度为100％的甲醇进行洗涤1-2次，再用预冷的含体积百分浓度为0.05-0.09％β-巯基乙醇的丙酮洗涤2-3次，室温干燥，得到植物总蛋白干粉。

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述步骤1)中蛋白提取液的添加量为3mL/克植物材料，涡混时间为5分钟。

5.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述步骤2)中Tris饱和酚的pH值为8.0，其添加量为步骤1)中含植物材料的提取液总体积的2倍，涡混时间为10分钟。

6.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述步骤3)中蛋白提取液的添加量为酚相体积的1倍，涡混时间为5分钟。

7.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述步骤4)中的沉淀温度为-20℃，沉淀时间为8-12小时，硫酸铵过饱和甲醇溶液的添加量为酚相体积的5倍。

8.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述步骤5)中甲醇的预冷温度为-20℃，用甲醇对沉淀洗涤的次数为1次；丙酮的预冷温度为-20℃，丙酮中β-巯基乙醇的体积百分浓度为0.07％，用丙酮对沉淀洗涤的次数为2次。

9.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述步骤3)-5)中的离心条件均为在4℃、15000g下离心10分钟。

10.权利要求3-9任一项所述方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。

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