CN102116714B - 一种尿液样品的浓缩除盐方法 - Google Patents
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Abstract
本发明专利涉及一种在双向聚丙烯酰胺凝胶电泳之前对尿液样品进行浓缩除盐的方法，属于生物检测技术领域。本发明是在常规方法的基础上改进某些程序，先经过超速离心、有机溶剂萃取，然后再经过透析袋除盐、有机溶剂萃取。这样可以使盐浓度较原有的处理方式明显降低，且表现为在后续的等电聚焦中能达到60000vhr的聚焦量，有利于等电聚焦的成功完成，提高SDS-PAGE胶的出图质量。
Description
技术领域
本发明专利申请涉及一种在双向聚丙烯酰胺凝胶电泳之前对尿液样品进行浓缩除盐方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
凝胶电泳技术(gel electrophoresis)基于电场中带电蛋白质的迁移，是生物医学领域常用的用来分离、鉴定和纯化蛋白质的方法。其优点在于将蛋白质分离的同时将其纯化，使研究者可以快速鉴定混合物中不同蛋白质的数量或者特定蛋白制备品的纯度。而且，可以确定一个蛋白质的关键性质，如等电点和大概的分子质量。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)具有较高的分离能力，广泛的用于蛋白质的分离和鉴定。聚丙烯酰胺作为分子筛，大致按蛋白质的荷质比成比例的减慢其迁移速度，迁移也受蛋白质形状的影响。一种通常用来确定蛋白质纯度和分子质量的电泳方法用到了十二烷基硫酸钠SDS，SDS与大部分蛋白质结合的数量大致和蛋白质分子质量成比例，并且贡献了大量净负电荷，使蛋白质的本身电荷不再显著并使每个蛋白质都有相似的荷质比。另外，SDS的结合改变了蛋白质的原始构型，大部分蛋白质都呈现相似的形状，因此SDS-PAGE电泳几乎仅根据质量来分离蛋白质，小分子多肽迁移的更快，因此该方法可以很好的根据未鉴定蛋白质的位置确定其分子质量。
等电聚焦电泳通过将一些小分子有机酸碱混合并在凝胶上加上电场可以产生一个pH梯度，当蛋白质混合物加入进行电泳时，每个蛋白质因各自的等电点不同，都会迁移到与其等电点相同的pH处停下来，浓缩成狭窄的区带，最常用的载体两性电解质是Ampholine。
双向凝胶电泳(简称2-DE)技术又被称为二维凝胶电泳，第一向是以蛋白质电荷差异为分离机制的等电聚焦电泳，不同等电点的蛋白质因此会在凝胶中分布于不同位置；第二向是以蛋白质分子质量差异为分离机制的SDS-PAGE。结合等电聚焦和SDS-PAGE即成为双向凝胶电泳，它可以分辨复杂的蛋白质混合物，这种方法比两种电泳单独使用更灵敏，分离的结果不是条带而是斑点，是当前分辨率最高，信息量最大的电泳技术，是蛋白质组学研究的重要工具。
在多种疾病中尿液蛋白质含量都会发生变化，因此检测尿液样品中蛋白质的含量在疾病的诊断和治疗中都具有很重要的作用。对尿液样品中的蛋白质进行检测和分析的过程中，常常要用到双向凝胶电泳技术。尿液是盐含量相对较高的体液样品，对于一些蛋白含量较低的肾病患者或是健康人，常需要大量样品来浓缩提取蛋白，此时超常的盐含量成了尿液样品等电聚焦进行双向凝胶电泳的最大障碍，因为盐含量能严重影响聚丙烯酰胺双向凝胶电泳的等电聚焦结果。样品中如果含有大量的盐类，会影响检测的准确性，所以实验所得双向凝胶电泳图谱的质量和完整性直接与样品制备中去除盐类的质量有关。而且等电聚焦时电压常需达到5000V以上，如果盐含量过高，则聚焦时电流增大，常常超过50μA，这样不仅会损坏胶条而且有被电流击穿的危险。
现有的“尿液除盐方式”技术主要是有2种：第1种方式为先使用透析袋除盐，然后以有机溶剂(包括用丙酮、乙醇、三氯乙酸或乙腈等)萃取，但存在不能有效浓缩原始样品、除盐效果差、且费时较长易导致样品中的蛋白降解等的缺点。第2种方式为使用进口除盐试剂盒(或透析卡)除盐，由于尿液不同于一般体液标本，原始样品量很大，一般为20-200ml左右，用第2种方式成本很高。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种有效降低尿液样品中含盐量的方法，以便能更好的进行双向凝胶电泳，使得所得结果更准确可靠，并且还能够节约成本。
本发明是在上述第1种方式的基础上改进某些程序，先经过超速离心、有机溶剂萃取，然后再经过透析除盐、有机溶剂萃取。这样可以快速改变原始样品量，节约时间，提高蛋白浓缩效果，使盐浓度较原有的处理方式明显降低，且表现为在后续的等电聚焦中能达到60000vhr的聚焦量，有利于等电聚焦的成功完成，提高SDS-PAGE胶的出图质量。
下面是本发明的步骤流程：
尿液→低温高速离心→丙酮、乙腈或TCA等有机溶剂萃取→透析除盐→聚乙二醇等浓缩→丙酮等有机溶剂萃取
具体来讲，本发明包括以下步骤：
(1)收集患者中段尿液，冻存备用；
(2)在尿液中加入蛋白水解酶抑制剂防蛋白裂解；
(3)将上述混合尿液进行高速离心；
(4)收集上清液，过滤除去细胞碎片及细菌；
(5)过滤后的尿液经有机溶剂浓缩和除盐，高速离心后，取沉淀物，空气中干燥5-10分钟；
(6)用适量的蛋白裂解液复溶；
(7)取上述处理后尿液，经透析除盐、浓缩、有机溶剂萃取后用适量的蛋白裂解液复溶蛋白。
其中步骤(3)高速离心是在2℃-4℃条件下15000g离心5-10分钟；其步骤(5)高速离心是在2℃-4℃条件下3000g离心10-30分钟；所述的蛋白裂解液的组成可以是40Mm Tris，7M urea，2M thiourea，4％CHAPS，1.5％DTT和1.5％IPG buffer；所用的有机溶剂包括丙酮、乙醇、乙腈和三氯乙酸等常用的有机溶剂。
与现行技术相比的有益效果主要体现在以下几个方面：
1、可以降低盐浓度有利于等电聚焦的顺利进行：在原有超速离心和乙腈等有机溶剂萃取的基础上再进行尿液透析除盐。这样可以使盐浓度较原有的处理方式明显降低，简化程序，避免因操作程序复杂导致蛋白降解等因素，且表现为在后续的等电聚焦中能达到60000vhr的聚焦量，有利于聚焦的成功完成。
2、可以降低盐浓度有利于第二向SDS-PAGE的顺利完成。
3、经双向凝胶电泳后所得的蛋白图谱显示，采用本发明的方法所得的尿液样品经染色显影后斑点清晰。
4、节约成本：因为以往方式大部分需使用除盐试剂盒才能达到有效降低盐浓度的目的，而试剂盒常包括10个除盐柱，一个只能处理200μl样品，一般需处理的尿液液样至少有1ml左右，这样处理一份样品约需要5个除盐柱，故一个试剂盒大约可以处理2份1ml左右的样品，价格为2000人民币左右。即可以理解为：处理10份样品花在除盐试剂盒上的资金可能会高达10000元人民币左右。且使用试剂盒工序增加，使蛋白损失更多。
附图说明
附图为两种不同处理方式的双向电泳图谱质量比较：
图1为采用本方法处理后的IgA肾病尿液样品进行双向凝胶电泳后的图谱；
图2为常规方法处理后的IgA肾病尿液样品进行双向凝胶电泳后的图谱(来自proteomics，2006)。
图1是以本发明方法除盐后进行双向电泳得到的图谱，而图2是以常规使用的除盐方法进行双向电泳得到的图谱，摘自2006年国外蛋白组学杂志。两者相比有以下优点：1、前者出现的点比后者明显清晰且数量多，特别是20KD以下的蛋白点更是明显；2、前者分布的蛋白点比后者圆，这是聚焦好的表现。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。
以IgA肾病患者的尿液样品的处理为例来说明本发明：
1、收集20ml患者中段尿液，冻存于-80℃备用；
2、每10ml尿液中加入3uL 200mM苯甲基磺酰氟(PMSF)防蛋白裂解；
3、上述20ml混合尿液分两管在2℃-4℃条件下15000g离心5-10分钟；
4、收集上清液，通过0.45u尼龙滤器过滤，除去细胞核碎片及细菌；
5、过滤后的尿液通过冷丙酮或三氯乙酸(TCA)进一步浓缩和除盐，在2℃-4℃条件下3000g离心10-30分钟后，取沉淀物，空气中干燥5-10分钟；
6、用适量的蛋白裂解液(成分：40Mm Tris(三羟甲基氨基甲烷)，7M urea(尿素)，2M thiourea(硫脲)，4％CHAPS(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸)，1.5％DTT(二硫苏糖醇)，1.5％IPG buffer(固相胶条缓冲液)复溶；
7、取上述处理后尿液，置4℃2000ml以上的DI(双蒸水)透析除盐8小时左右，然后以聚乙二醇浓缩，再使用有机溶剂萃取最后用一定量的蛋白裂解液复溶蛋白；
8、将上述处理的蛋白定量，上样，进行双向凝胶电泳(2-D)实验；
9、双向凝胶电泳：包括第一向等电聚焦电泳，采用IPG预制胶条，经胶条平衡后进行第二向SDS-PAGE凝胶电泳；
10、将电泳凝胶进行考马斯蓝染色，然后进行凝胶扫描及图像分析；
11、得到如图1所示的结果，由图1可知，对比由采取常规方法得到的结果(如图2所示)，本方法所得的凝胶扫描图像清楚、明晰、干扰少，达到了有效除盐的效果。
Claims (4)
1.一种降低人体尿液样品中含盐量的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)收集患者中段尿液，冻存备用；
(2)在尿液中加入蛋白水解酶抑制剂防蛋白裂解；
(3)将上述混合尿液在2℃-4℃条件下，15000g离心5-10分钟；
(4)收集上清液，过滤除去细胞碎片及细菌；
(5)过滤后的尿液经有机溶剂浓缩和除盐，在2℃-4℃条件下，3000g离心10-30分钟后，取沉淀物，空气中干燥5-10分钟；
(6)用适量的蛋白裂解液复溶，所述的蛋白裂解液的组成为40MmTris，7M urea，2M thiourea，4％CHAPS，1.5％DTT和1.5％IPG buffer；
(7)取上述处理后尿液，经透析除盐、浓缩、有机溶剂萃取后用适量的蛋白裂解液复溶蛋白。
2.根据权利要求1所述的降低人体尿液样品中含盐量的方法，其特征在于：所用的有机溶剂包括丙酮、乙醇、乙腈和三氯乙酸。
3.根据权利要求1所述的降低人体尿液样品中含盐量的方法在双向凝胶电泳检测技术中的应用。
4.根据权利要求1所述的降低人体尿液样品中含盐量的方法在分析和检测尿液样品中蛋白质分布中的应用。
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| 王玲等.基于荧光差异二维电泳技术的临床尿液蛋白质组学研究方法探讨.《中国血液净化》.2009,第8卷(第7期),第383页第1节. * |
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