JP2003531362A - 試料の電気泳動性分離および処理 - Google Patents
試料の電気泳動性分離および処理Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は２つの電気泳動システムを含む小さなマクロ分子を分離する電気泳動システムであって、各々のシステムが陽極バッファーおよび陰極バッファーチャンバーを含み、その中に陽極および陰極；陽極と陰極バッファーチャンバーの間に位置するイオン透過性分離膜；第１および第２間隙容量を定めるための、イオン透過性分離膜のいずれかの側に位置するイオン透過性制限膜；バッファーチャンバーの間に用いられる電場を含み、ここに２つの電気泳動システムは互いに流体連絡されている、電気泳動システムに関する。
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は化合物、特に組み換え微生物により産生された組換え蛋白の形態であ
る生体分子を処理または分離する装置および方法、および溶液から低分子量マク
ロ分子を取り出す方法に関する。
る生体分子を処理または分離する装置および方法、および溶液から低分子量マク
ロ分子を取り出す方法に関する。
【０００２】
（従来技術）
生体分子の溶液の処理は種々のバッファーの使用を含むことが多い。例えば、
生体分子の工業的処理の間、大量のバッファーが必要とされ、これは高価であり
、処分に対する問題が生じうる。用尽されたバッファーはマクロ分子廃棄物を含
むことが多く、バッファーのさらなる使用を妨げるだけでなく、安全に処分する
必要がある。 過去において、マイクロ分子を分離するために、ポリアクリルアミド膜を横切
るように荷電させ、その膜を横切る接線流を利用してマクロ分子を分離して分取
する電気泳動法が使用された。その初期のシステムの一般的な設計は、自然に近
い条件下で蛋白および他のマクロ分子の精製を容易にした。この技法は数個の膜
を特別に処理されたグリッドおよびガスケットの系に組み込ませてなるカートリ
ッジに集約されており、それによりチャージおよび／または分子量によるマクロ
分子の分離が可能となる。また、このシステムは同時に濃縮および脱塩／透析で
きる。このシステムの多様な性質は、この技術を、他の多くの分野、特に医学的
使用に関する生物学的成分の生成において使用することを可能にする。 バッファーの流れの中に低分子量の蛋白およびイオンが蓄積する影響で、精製
の間の蛋白の移動が遅くなりうる。これらのコンタミナントは電流を通し、標的
蛋白の移動を減少させ、蛋白溶液中の蓄積物の加熱を誘発しうる。本発明者らに
より行われた最近の研究は、修飾されたシステムを用いてこれら低分子量のコン
タミナントを取り除き、バッファーの流れを「きれい」にすることができること
を示唆する。バッファーの流れを分離装置を通して循環させることにより、発明
者らは、バッファーの伝導性およびｐＨを維持して、バッファーの流れ中に存在
する蛋白／コンタミナントの大部分を取り出すことができることを見出した。 近年のバイオテクノロジー産業は、特に遺伝子組換えにより産生された生体分
子の処理に関する多くの問題に直面している。組換え細胞中での組換え遺伝子の
発現は少なく、宿主細胞からの精製は難しいことが多い。開始試料は、通常、希
釈されており、慣用的な手段により試料を濃縮する必要性により低回収率となり
うる。通常、蛋白の精製を可能にするため、組換え蛋白に結合するフラッグペプ
チドが使用される（６つのヒスチジンのペプチドが組換え蛋白に加えられること
が多い）。このタグは、ホールディング作用により、例えば蛋白を不活性とし、
構築物を正確に評価できないことで、生物学的機能を妨害しうる。 現在、生体分子、特に組換え蛋白の精製は、しばしば、特に組換え生体分子を
精製する場合に、長くかつやっかいな処理である。 本発明者らは、この度、早くかつ選択的な方法にて蛋白および他の生体分子の
複合混合物から組換え蛋白を分離または精製する方法を開発した。
生体分子の工業的処理の間、大量のバッファーが必要とされ、これは高価であり
、処分に対する問題が生じうる。用尽されたバッファーはマクロ分子廃棄物を含
むことが多く、バッファーのさらなる使用を妨げるだけでなく、安全に処分する
必要がある。 過去において、マイクロ分子を分離するために、ポリアクリルアミド膜を横切
るように荷電させ、その膜を横切る接線流を利用してマクロ分子を分離して分取
する電気泳動法が使用された。その初期のシステムの一般的な設計は、自然に近
い条件下で蛋白および他のマクロ分子の精製を容易にした。この技法は数個の膜
を特別に処理されたグリッドおよびガスケットの系に組み込ませてなるカートリ
ッジに集約されており、それによりチャージおよび／または分子量によるマクロ
分子の分離が可能となる。また、このシステムは同時に濃縮および脱塩／透析で
きる。このシステムの多様な性質は、この技術を、他の多くの分野、特に医学的
使用に関する生物学的成分の生成において使用することを可能にする。 バッファーの流れの中に低分子量の蛋白およびイオンが蓄積する影響で、精製
の間の蛋白の移動が遅くなりうる。これらのコンタミナントは電流を通し、標的
蛋白の移動を減少させ、蛋白溶液中の蓄積物の加熱を誘発しうる。本発明者らに
より行われた最近の研究は、修飾されたシステムを用いてこれら低分子量のコン
タミナントを取り除き、バッファーの流れを「きれい」にすることができること
を示唆する。バッファーの流れを分離装置を通して循環させることにより、発明
者らは、バッファーの伝導性およびｐＨを維持して、バッファーの流れ中に存在
する蛋白／コンタミナントの大部分を取り出すことができることを見出した。 近年のバイオテクノロジー産業は、特に遺伝子組換えにより産生された生体分
子の処理に関する多くの問題に直面している。組換え細胞中での組換え遺伝子の
発現は少なく、宿主細胞からの精製は難しいことが多い。開始試料は、通常、希
釈されており、慣用的な手段により試料を濃縮する必要性により低回収率となり
うる。通常、蛋白の精製を可能にするため、組換え蛋白に結合するフラッグペプ
チドが使用される（６つのヒスチジンのペプチドが組換え蛋白に加えられること
が多い）。このタグは、ホールディング作用により、例えば蛋白を不活性とし、
構築物を正確に評価できないことで、生物学的機能を妨害しうる。 現在、生体分子、特に組換え蛋白の精製は、しばしば、特に組換え生体分子を
精製する場合に、長くかつやっかいな処理である。 本発明者らは、この度、早くかつ選択的な方法にて蛋白および他の生体分子の
複合混合物から組換え蛋白を分離または精製する方法を開発した。
【０００３】
（発明の開示）
本発明により、効率的および効果的にマクロ分子を分離し、試料およびバッフ
ァーの流れから低分子量のコンタミナントを除去できる電気泳動性システムが提
供される。 本発明は、電気泳動性分離によりマクロ分子を分離するためのシステムまたは
装置であって、 （ａ）第１陰極区分にある第１陰極と； （ｂ）第１陽極区分にある第１陽極であって、その第１陰極と第１陽極の間に電
位を加えると、その間にある第１電場領域に第１電場を発生させるのに適合する
ように第１陰極に対して相対的に配置される陽極と； （ｃ）第１陰極区分と第１陽極区分に配置される第１電気泳動性バッファーと； （ｄ）第１電場領域に配置される所定の分子量カットオフを有する第１分離膜と
； （ｅ）第１間隙容量を限定するために、第１陰極区分と第１分離膜の間に配置さ
れる第１制限膜と； （ｆ）第２間隙容量を限定するために、第１陽極区分と第１分離膜の間に配置さ
れる第２制限膜と； （ｇ）試料成分を第１間隙容量と第２間隙容量の選択された一つにて提供するの
に適合した手段であって、第１電位を加えると、選択された分離生成物が第１分
離膜を通って試料成分から取り出され、第１および第２間隙容量の他方に提供さ
れる手段と； （ｈ）第２陰極を含有していてもよい第２陰極区分と； （ｉ）第２陽極を含有していてもよい第２陽極区分であって、任意の第２陰極と
任意の第２陽極の間に任意の第２電位を加えると、その間に第２電場領域を形成
する、第２陰極区分に対して相対的に配置された第２陽極区分と； （ｊ）第２陰極区分と第２陽極区分に配置される第２電気泳動性バッファーと； （ｋ）第２電場領域に配置される所定の分子量カットオフを有する第２分離膜と
； （ｌ）第３間隙容量を限定するために、第２陰極区分と第２分離膜の間に配置さ
れる第３制限膜と； （ｍ）第４間隙容量を限定するために、第２陽極区分と第２分離膜の間に配置さ
れる第４制限膜と； （ｎ）第１電気泳動性バッファーを第３および第４間隙容量の選択された一つに
提供するのに適合した手段であって、選択された分離生成物が第２分離膜を通っ
て第１電気泳動性バッファーから取り出され、第３および第４間隙容量の他方に
提供され、実質的に第１電気泳動性バッファーが第３および第４間隙容量に入る
ことを妨げる手段と； （ｏ）選択された分離生成物を第１電気泳動性バッファーから取り出した後、第
１電気泳動性バッファーを第１間隙容量ならびに第１陰極および陽極区分の選択
された一つに提供するのに適合した手段と からなる、マクロ分子を分離するためのシステムまたは装置に関する。
ァーの流れから低分子量のコンタミナントを除去できる電気泳動性システムが提
供される。 本発明は、電気泳動性分離によりマクロ分子を分離するためのシステムまたは
装置であって、 （ａ）第１陰極区分にある第１陰極と； （ｂ）第１陽極区分にある第１陽極であって、その第１陰極と第１陽極の間に電
位を加えると、その間にある第１電場領域に第１電場を発生させるのに適合する
ように第１陰極に対して相対的に配置される陽極と； （ｃ）第１陰極区分と第１陽極区分に配置される第１電気泳動性バッファーと； （ｄ）第１電場領域に配置される所定の分子量カットオフを有する第１分離膜と
； （ｅ）第１間隙容量を限定するために、第１陰極区分と第１分離膜の間に配置さ
れる第１制限膜と； （ｆ）第２間隙容量を限定するために、第１陽極区分と第１分離膜の間に配置さ
れる第２制限膜と； （ｇ）試料成分を第１間隙容量と第２間隙容量の選択された一つにて提供するの
に適合した手段であって、第１電位を加えると、選択された分離生成物が第１分
離膜を通って試料成分から取り出され、第１および第２間隙容量の他方に提供さ
れる手段と； （ｈ）第２陰極を含有していてもよい第２陰極区分と； （ｉ）第２陽極を含有していてもよい第２陽極区分であって、任意の第２陰極と
任意の第２陽極の間に任意の第２電位を加えると、その間に第２電場領域を形成
する、第２陰極区分に対して相対的に配置された第２陽極区分と； （ｊ）第２陰極区分と第２陽極区分に配置される第２電気泳動性バッファーと； （ｋ）第２電場領域に配置される所定の分子量カットオフを有する第２分離膜と
； （ｌ）第３間隙容量を限定するために、第２陰極区分と第２分離膜の間に配置さ
れる第３制限膜と； （ｍ）第４間隙容量を限定するために、第２陽極区分と第２分離膜の間に配置さ
れる第４制限膜と； （ｎ）第１電気泳動性バッファーを第３および第４間隙容量の選択された一つに
提供するのに適合した手段であって、選択された分離生成物が第２分離膜を通っ
て第１電気泳動性バッファーから取り出され、第３および第４間隙容量の他方に
提供され、実質的に第１電気泳動性バッファーが第３および第４間隙容量に入る
ことを妨げる手段と； （ｏ）選択された分離生成物を第１電気泳動性バッファーから取り出した後、第
１電気泳動性バッファーを第１間隙容量ならびに第１陰極および陽極区分の選択
された一つに提供するのに適合した手段と からなる、マクロ分子を分離するためのシステムまたは装置に関する。
【０００４】
好ましくは、装置は任意の第２陰極ならびに陽極を含み、工程（ｎ）は第２電
位を加えて行う。 好ましくは、第２陰極、第２陰極区分、第２陽極、第２陽極区分および第２電
気泳動性バッファーをセカンダリー分離システムに連続的に配置する。 好ましくは、第１および第２間隙容量を第１上流および下流間隙容量を形成す
る、第１陰極区分と第１陽極区分の間に位置するカートリッジとして設ける。 好ましくは、第３および第４間隙容量を第２上流および下流間隙容量を形成す
る、第２陰極区分と第２陽極区分の間に位置するカートリッジとして設ける。
位を加えて行う。 好ましくは、第２陰極、第２陰極区分、第２陽極、第２陽極区分および第２電
気泳動性バッファーをセカンダリー分離システムに連続的に配置する。 好ましくは、第１および第２間隙容量を第１上流および下流間隙容量を形成す
る、第１陰極区分と第１陽極区分の間に位置するカートリッジとして設ける。 好ましくは、第３および第４間隙容量を第２上流および下流間隙容量を形成す
る、第２陰極区分と第２陽極区分の間に位置するカートリッジとして設ける。
【０００５】
さらには、第１の態様において、本発明は、電気泳動によりマクロ分子を分離
するためのシステムであって、 （ａ）第１陰極区画および第１陽極区画と； （ｂ）各々の区画に位置する第１陰極および第１陽極と； （ｃ）第１陰極および第１陽極区画に供給される第１電気泳動性バッファーの流
れと； （ｄ）所定の分子量カットオフを有する第１イオン透過性分離膜の両側にあり、
陰極区画と陽極区画の間に位置付けられ、その分離膜の両側に位置するイオン透
過性制限膜により分離される第１チャンバーおよび第２チャンバーであって、こ
こで、制限膜は電場の影響下、イオンの流れの区画およびチャンバーへの出入を
可能とするが、少なくとも一つ型ののマクロ分子が第２チャンバーから一の区画
へ移動することを実質的に制限するところの、第１チャンバーおよび第２チャン
バーと； （ｅ）第２陰極区画および第２陽極区画と； （ｆ）第２陰極および第２陽極区画の各々に位置付けられる任意の第２陰極およ
び第２陽極と； （ｇ）第２陰極および第２陽極区画に供給される第２電気泳動性バッファーの流
れと； （ｈ）所定の分子量カットオフを有する第２イオン透過性分離膜の両側にあり、
第２陰極区画と第２陽極区画の間に位置付けられ、その第２分離膜の両側に位置
する第３および第４イオン透過性制限膜により分離される第１チャンバーおよび
第２チャンバーと； からなるシステムに関する。
するためのシステムであって、 （ａ）第１陰極区画および第１陽極区画と； （ｂ）各々の区画に位置する第１陰極および第１陽極と； （ｃ）第１陰極および第１陽極区画に供給される第１電気泳動性バッファーの流
れと； （ｄ）所定の分子量カットオフを有する第１イオン透過性分離膜の両側にあり、
陰極区画と陽極区画の間に位置付けられ、その分離膜の両側に位置するイオン透
過性制限膜により分離される第１チャンバーおよび第２チャンバーであって、こ
こで、制限膜は電場の影響下、イオンの流れの区画およびチャンバーへの出入を
可能とするが、少なくとも一つ型ののマクロ分子が第２チャンバーから一の区画
へ移動することを実質的に制限するところの、第１チャンバーおよび第２チャン
バーと； （ｅ）第２陰極区画および第２陽極区画と； （ｆ）第２陰極および第２陽極区画の各々に位置付けられる任意の第２陰極およ
び第２陽極と； （ｇ）第２陰極および第２陽極区画に供給される第２電気泳動性バッファーの流
れと； （ｈ）所定の分子量カットオフを有する第２イオン透過性分離膜の両側にあり、
第２陰極区画と第２陽極区画の間に位置付けられ、その第２分離膜の両側に位置
する第３および第４イオン透過性制限膜により分離される第１チャンバーおよび
第２チャンバーと； からなるシステムに関する。
【０００６】
陰極区分または区画および陽極区分または区画にいずれか適当な手段により適
当なバッファーを供給する。処理される化合物を含む混合物を第１または第２間
隙容量またはチャンバーにいずれか適当な手段により直接的に供給する。 好ましくは、区分または区画および間隙容量またはチャンバーを、各々のバッ
ファーおよび試料溶液が流動し、流れを形成するように設定する。この形態にお
いて、大容量が迅速かつ効率的に処理できる。溶液は、典型的には、ポンプ手段
により各々の貯蔵所から区分または区画およびチャンバーを通り移動するか、ま
たは再循環される。好ましい具体例において、蠕動ポンプを試料、バッファーま
たは流体を移動させるためのポンプ手段として使用する。 １の具体例において、バッファー、試料または生成物溶液をいずれかの適当な
手段で冷却し、マイクロ分子、化合物またはマクロ分子の不活性化が分離処理の
間に生じないようにし、使用中、装置を望ましい温度に維持することができる。 好ましくは、分離した化合物またはマクロ分子を収集および濃縮するために、
分離すべき化合物またはマクロ分子を含む少なくとも１つのチャンバーまたは流
れ中の溶液を収集し、適当な溶媒で置換して電気泳動を続けることができるよう
にする。
当なバッファーを供給する。処理される化合物を含む混合物を第１または第２間
隙容量またはチャンバーにいずれか適当な手段により直接的に供給する。 好ましくは、区分または区画および間隙容量またはチャンバーを、各々のバッ
ファーおよび試料溶液が流動し、流れを形成するように設定する。この形態にお
いて、大容量が迅速かつ効率的に処理できる。溶液は、典型的には、ポンプ手段
により各々の貯蔵所から区分または区画およびチャンバーを通り移動するか、ま
たは再循環される。好ましい具体例において、蠕動ポンプを試料、バッファーま
たは流体を移動させるためのポンプ手段として使用する。 １の具体例において、バッファー、試料または生成物溶液をいずれかの適当な
手段で冷却し、マイクロ分子、化合物またはマクロ分子の不活性化が分離処理の
間に生じないようにし、使用中、装置を望ましい温度に維持することができる。 好ましくは、分離した化合物またはマクロ分子を収集および濃縮するために、
分離すべき化合物またはマクロ分子を含む少なくとも１つのチャンバーまたは流
れ中の溶液を収集し、適当な溶媒で置換して電気泳動を続けることができるよう
にする。
【０００７】
使用において、試料を第１チャンバー中に置き、電位を第１チャンバーと第２
チャンバーの間に加え、試料中の小さなマクロ分子を第１電気泳動性バッファー
の流れに移動させ、第１電気泳動性バッファーの流れ中の小さなマクロ分子を含
むバッファーを第３チャンバーに移動させ、所望により第３チャンバーと第４チ
ャンバーの間に電位を加え、第２分離膜を通して小さなマクロ分子を第４チャン
バーに移動させてもよいが、実質的に第３チャンバー中のバッファーが第４チャ
ンバーに移動することを防止し、第３チャンバーから第１電気泳動性バッファー
の流れにバッファーを戻す。 チャンバーの順序は逆にすることができ、第１電気泳動性バッファーの流れ中
の小さなマクロ分子を含むバッファーを第４チャンバーに移動させ、第３チャン
バーと第４チャンバーの間に電位を加え、小さなマクロ分子を第２分離膜を通し
て第３チャンバーに移動させてもよいが、実質的に第４チャンバー中のバッファ
ーが第３チャンバーに移動することを防止し、バッファーが第４チャンバーから
第１電気泳動性バッファーの流れに戻ることは理解できるだろう。
チャンバーの間に加え、試料中の小さなマクロ分子を第１電気泳動性バッファー
の流れに移動させ、第１電気泳動性バッファーの流れ中の小さなマクロ分子を含
むバッファーを第３チャンバーに移動させ、所望により第３チャンバーと第４チ
ャンバーの間に電位を加え、第２分離膜を通して小さなマクロ分子を第４チャン
バーに移動させてもよいが、実質的に第３チャンバー中のバッファーが第４チャ
ンバーに移動することを防止し、第３チャンバーから第１電気泳動性バッファー
の流れにバッファーを戻す。 チャンバーの順序は逆にすることができ、第１電気泳動性バッファーの流れ中
の小さなマクロ分子を含むバッファーを第４チャンバーに移動させ、第３チャン
バーと第４チャンバーの間に電位を加え、小さなマクロ分子を第２分離膜を通し
て第３チャンバーに移動させてもよいが、実質的に第４チャンバー中のバッファ
ーが第３チャンバーに移動することを防止し、バッファーが第４チャンバーから
第１電気泳動性バッファーの流れに戻ることは理解できるだろう。
【０００８】
イオン透過性分離膜または膜は、好ましくはポリアクリルアミドから作られ、
約１ｋＤａ〜約１５００ｋＤａの分子量カットオフを有する電気泳動分離膜であ
る。分離膜の分子量カットオフは、混合物中の処理される試料および他の分子に
応じて選択されるだろう。しかしながら、他の膜特性または構成が本発明に使用
できることは明らかだろう。 第１および第２制限膜または膜は、好ましくは、ポリアクリルアミドから形成
され、分離膜よりも小さい分子量カットオフ、好ましくは約１ｋＤａ〜約１００
ｋＤａ分子量カットオフを有する制限膜である。制限膜の分子量カットオフは、
処理されるべき試料および除去されるべき小さなマクロ分子の大きさに応じて選
択されるだろう。 １の好ましい形態において、第１および第２チャンバーならびに第３および第
４チャンバーを、上流および下流を形成する、各電極区画の間に位置する分離カ
ートリッジまたはカセットとして設け、第１および第２チャンバーならびに第３
および第４チャンバーを定める。カートリッジは、２つの制限膜の間に位置付け
られる電気泳動分離膜を有するハウジングから構成され、したがって必要なチャ
ンバーを形成することが好ましい。 好ましくは、カートリッジまたはカセットはカートリッジを含むのに適合した
装置から取り外し可能である。 約１０００ｋＤａの分子量カットオフが、好ましくは電気泳動分離膜である、
第１イオン透過性分離膜に特に適していることが見出されている。このカットオ
フはバッファーの移動を防止するが、マクロ分子は第２チャンバーに移動するこ
とでき、これらは第２制限膜により保持される。しかしながら、小さなマクロ分
子の移動を防止する他のカットオフ膜もまた適当であることは理解できるだろう
。好ましい形態において、電気泳動分離膜は、約５ｋＤａの分子量カットオフを
有する２つの制限膜が第２電気泳動分離膜の両側に一定間隔を設けて位置し、そ
れにより第３および第４チャンバーを形成するところの、分離カートリッジの一
部を形成する。
約１ｋＤａ〜約１５００ｋＤａの分子量カットオフを有する電気泳動分離膜であ
る。分離膜の分子量カットオフは、混合物中の処理される試料および他の分子に
応じて選択されるだろう。しかしながら、他の膜特性または構成が本発明に使用
できることは明らかだろう。 第１および第２制限膜または膜は、好ましくは、ポリアクリルアミドから形成
され、分離膜よりも小さい分子量カットオフ、好ましくは約１ｋＤａ〜約１００
ｋＤａ分子量カットオフを有する制限膜である。制限膜の分子量カットオフは、
処理されるべき試料および除去されるべき小さなマクロ分子の大きさに応じて選
択されるだろう。 １の好ましい形態において、第１および第２チャンバーならびに第３および第
４チャンバーを、上流および下流を形成する、各電極区画の間に位置する分離カ
ートリッジまたはカセットとして設け、第１および第２チャンバーならびに第３
および第４チャンバーを定める。カートリッジは、２つの制限膜の間に位置付け
られる電気泳動分離膜を有するハウジングから構成され、したがって必要なチャ
ンバーを形成することが好ましい。 好ましくは、カートリッジまたはカセットはカートリッジを含むのに適合した
装置から取り外し可能である。 約１０００ｋＤａの分子量カットオフが、好ましくは電気泳動分離膜である、
第１イオン透過性分離膜に特に適していることが見出されている。このカットオ
フはバッファーの移動を防止するが、マクロ分子は第２チャンバーに移動するこ
とでき、これらは第２制限膜により保持される。しかしながら、小さなマクロ分
子の移動を防止する他のカットオフ膜もまた適当であることは理解できるだろう
。好ましい形態において、電気泳動分離膜は、約５ｋＤａの分子量カットオフを
有する２つの制限膜が第２電気泳動分離膜の両側に一定間隔を設けて位置し、そ
れにより第３および第４チャンバーを形成するところの、分離カートリッジの一
部を形成する。
【０００９】
電極間の距離は、膜を通るマクロ分子の分離または移動に影響を与える。電極
間の距離が短いほど、マイクロ分子の電気泳動の動きは速くなることがわかって
いる。約６ｃｍの距離が実験室規模の装置に適当であることがわかっている。大
規模化に関して、距離は分離膜の数および型、試料、バッファーおよび分離生成
物のチャンバーの大きさおよび容積に依存するだろう。好ましい距離は、約６ｍ
ｍ〜約１０ｍｍ程度であろう。また、距離は装置に用いられる電圧にも関係する
。
間の距離が短いほど、マイクロ分子の電気泳動の動きは速くなることがわかって
いる。約６ｃｍの距離が実験室規模の装置に適当であることがわかっている。大
規模化に関して、距離は分離膜の数および型、試料、バッファーおよび分離生成
物のチャンバーの大きさおよび容積に依存するだろう。好ましい距離は、約６ｍ
ｍ〜約１０ｍｍ程度であろう。また、距離は装置に用いられる電圧にも関係する
。
【００１０】
電界の効果は式：
ｅ＝Ｖ／ｄ
（ｅ＝電界、Ｖ＝電圧、ｄ＝距離）
に基づく。
したがって、電極間の距離が短くなると分離はより速くなる。好ましくは、電
極間の距離は、電界強度を増加させるために短くし、それによりさらに移動率が
改良される。
極間の距離は、電界強度を増加させるために短くし、それによりさらに移動率が
改良される。
【００１１】
試料／バッファーの流速は、マイクロ分子の分離に影響を与える。１時間あた
り数ミリリットルから１時間あたり数リットルの速度が装置の構成および分離す
る試料に応じて使用される。現在は、実験室規模の装置において、好ましい流速
は、約２０±５ｍＬ／分である。しかしながら、約０ｍＬ／分〜約５０，０００
ｍＬ／分の範囲の流速が、種々の分離方式にわたって使用される。最大流速は、
ポンプ手段および装置の大きさに応じてさらに速くなる。流速は移動させる生成
物、移動効率、他の適用の位置付けの前後に依存して選択する。 用いる電圧および／電流の選択または適用は分離に応じて変化する。典型的に
は、数千ボルトまで使用されるが、電圧の選択および変化は、装置の構成、バッ
ファーおよび分離される試料に依存する。実験室規模の装置において、好ましい
電圧は約２５０Ｖである。しかしながら、移動、効率、大規模化および特定の方
法に応じて、約０Ｖ〜約５０００Ｖが使用される。装置および処理される試料に
応じてより高電圧も考えられる。 １の具体例において、数個の第１および第２チャンバーが、大規模化した装置
において使用するために１つの装置において反復して用いられる。
り数ミリリットルから１時間あたり数リットルの速度が装置の構成および分離す
る試料に応じて使用される。現在は、実験室規模の装置において、好ましい流速
は、約２０±５ｍＬ／分である。しかしながら、約０ｍＬ／分〜約５０，０００
ｍＬ／分の範囲の流速が、種々の分離方式にわたって使用される。最大流速は、
ポンプ手段および装置の大きさに応じてさらに速くなる。流速は移動させる生成
物、移動効率、他の適用の位置付けの前後に依存して選択する。 用いる電圧および／電流の選択または適用は分離に応じて変化する。典型的に
は、数千ボルトまで使用されるが、電圧の選択および変化は、装置の構成、バッ
ファーおよび分離される試料に依存する。実験室規模の装置において、好ましい
電圧は約２５０Ｖである。しかしながら、移動、効率、大規模化および特定の方
法に応じて、約０Ｖ〜約５０００Ｖが使用される。装置および処理される試料に
応じてより高電圧も考えられる。 １の具体例において、数個の第１および第２チャンバーが、大規模化した装置
において使用するために１つの装置において反復して用いられる。
【００１２】
第２の態様において、本発明は、試料成分から小さなマクロ分子を取り出す方
法であって： （ａ）本発明の第１の態様に係る電気泳動性装置を準備し； （ｂ）試料成分を第１間隙容量に加え； （ｃ）第１および第２間隙容量の間に第１電位を加え、ここで第１電位が加えら
れると、選択される分離生成物が第１分離膜を通って試料成分から取り出され、
第１および第２間隙容量の他方および第１電気泳動性バッファーに提供され； （ｄ）小さなマクロ分子を含有する第１電気泳動性バッファーを第３および第４
間隙容量の選択された一方に移し； （ｅ）小さなマクロ分子のコンタミタントが第２イオン透過性分離膜を通って第
３および第４間隙容量の他方に移るが、実質的にバッファーがかかる間隙容量に
入ることを妨げ； （ｆ）第３および第４間隙容量の間に第２電位を加え、工程（ｅ）を補助しても
よく； （ｇ）選択された分離生成物が第１電気泳動性バッファーから取り出された後に
、第１電気泳動性バッファーを第１陰極および陽極区分の選択された一方に戻す
ことを含む、試料成分から小さなマクロ分子を取り出す方法を提供する。
法であって： （ａ）本発明の第１の態様に係る電気泳動性装置を準備し； （ｂ）試料成分を第１間隙容量に加え； （ｃ）第１および第２間隙容量の間に第１電位を加え、ここで第１電位が加えら
れると、選択される分離生成物が第１分離膜を通って試料成分から取り出され、
第１および第２間隙容量の他方および第１電気泳動性バッファーに提供され； （ｄ）小さなマクロ分子を含有する第１電気泳動性バッファーを第３および第４
間隙容量の選択された一方に移し； （ｅ）小さなマクロ分子のコンタミタントが第２イオン透過性分離膜を通って第
３および第４間隙容量の他方に移るが、実質的にバッファーがかかる間隙容量に
入ることを妨げ； （ｆ）第３および第４間隙容量の間に第２電位を加え、工程（ｅ）を補助しても
よく； （ｇ）選択された分離生成物が第１電気泳動性バッファーから取り出された後に
、第１電気泳動性バッファーを第１陰極および陽極区分の選択された一方に戻す
ことを含む、試料成分から小さなマクロ分子を取り出す方法を提供する。
【００１３】
本発明の第２の態様の好ましい具体例において、該方法は：
（ｈ）第１および第２間隙容量の間の電位を定期的に停止かつ反転させ、第１イ
オン透過性分離膜に侵入した、試料成分より取り出されるべき小さなマクロ分子
以外のいずれのマクロ分子も移動させ、試料成分を配置した第１および第２間隙
容量の一つに戻し、第１および第２間隙容量の他方に侵入した、いずれの小さな
マクロ分子または他のマクロ分子も第１および第２間隙容量の他方に再び侵入さ
せない、ことを含む。 電流の反転は任意であるが、もう一つ別の選択肢が静止期間である。静止期間
（電位を加えることなく、ポンプが作動したままの期間）は任意の工程であり、
任意の電位反転の前後に取って代わるか、または含まれる。この反転方法は、し
ばしば、電圧の反転に変わるものとして、蛋白の分離作業に用いられる。
オン透過性分離膜に侵入した、試料成分より取り出されるべき小さなマクロ分子
以外のいずれのマクロ分子も移動させ、試料成分を配置した第１および第２間隙
容量の一つに戻し、第１および第２間隙容量の他方に侵入した、いずれの小さな
マクロ分子または他のマクロ分子も第１および第２間隙容量の他方に再び侵入さ
せない、ことを含む。 電流の反転は任意であるが、もう一つ別の選択肢が静止期間である。静止期間
（電位を加えることなく、ポンプが作動したままの期間）は任意の工程であり、
任意の電位反転の前後に取って代わるか、または含まれる。この反転方法は、し
ばしば、電圧の反転に変わるものとして、蛋白の分離作業に用いられる。
【００１４】
本発明の方法の１つの利点は、分離される化合物の物理的または生物的特性を
変性させるか、または不利に変えることなしに大規模化できる可能性があること
である。 好ましくは、試料は他のマクロ分子を含み、その分子は第１イオン透過性分離
膜を介して大きさおよび電荷により第２チャンバーに分離される。 試料は取り出される必要のある小さなマクロ分子を含むいずれかの適当な試料
である。小さなマクロ分子は、通常、精製されるか、または分離される必要のあ
る他のマクロ分子とのコンタミナントである。これらの例として、限定するもの
ではないが、血液誘導生成物、例えば血漿、抗体試料、生体分子、例えば蛋白、
ペプチド、糖蛋白、オリゴヌクレオチド、組換え蛋白、細胞抽出物、細胞培養物
上清、成長因子、抗原、イムノゲンを含む試料およびそれらの組み合わせを含む
。 小さなマクロ分子は、限定するものではないが、マクロ分子の溶液をコンタミ
ネートする蛋白、ペプチドおよび蛋白フラグメントを含む。典型的には、小さな
マクロ分子は約１００Ｄａ〜１００ｋＤａの分子量を有する。 好ましくは、バッファーは第１電気泳動性バッファーの流れから第３チャンバ
ーおよび第３チャンバーから第１電気泳動性バッファーの流れの間で再循環する
。この状況において、マクロ分子の同時分離が達成され、第１バッファーの流れ
から小さなマクロ分子およびイオンが取り出される。第１電気泳動性バッファー
の流れ中の溶質、塩およびイオンを第２制限膜を通して移動させることにより第
２バッファーの流れに移す。第２バッファーの流れは、好ましくは第１チャンバ
ーに使用したものと同型のバッファーである。
変性させるか、または不利に変えることなしに大規模化できる可能性があること
である。 好ましくは、試料は他のマクロ分子を含み、その分子は第１イオン透過性分離
膜を介して大きさおよび電荷により第２チャンバーに分離される。 試料は取り出される必要のある小さなマクロ分子を含むいずれかの適当な試料
である。小さなマクロ分子は、通常、精製されるか、または分離される必要のあ
る他のマクロ分子とのコンタミナントである。これらの例として、限定するもの
ではないが、血液誘導生成物、例えば血漿、抗体試料、生体分子、例えば蛋白、
ペプチド、糖蛋白、オリゴヌクレオチド、組換え蛋白、細胞抽出物、細胞培養物
上清、成長因子、抗原、イムノゲンを含む試料およびそれらの組み合わせを含む
。 小さなマクロ分子は、限定するものではないが、マクロ分子の溶液をコンタミ
ネートする蛋白、ペプチドおよび蛋白フラグメントを含む。典型的には、小さな
マクロ分子は約１００Ｄａ〜１００ｋＤａの分子量を有する。 好ましくは、バッファーは第１電気泳動性バッファーの流れから第３チャンバ
ーおよび第３チャンバーから第１電気泳動性バッファーの流れの間で再循環する
。この状況において、マクロ分子の同時分離が達成され、第１バッファーの流れ
から小さなマクロ分子およびイオンが取り出される。第１電気泳動性バッファー
の流れ中の溶質、塩およびイオンを第２制限膜を通して移動させることにより第
２バッファーの流れに移す。第２バッファーの流れは、好ましくは第１チャンバ
ーに使用したものと同型のバッファーである。
【００１５】
別法として、バッファーは第１電気泳動性バッファーの流れから第４チャンバ
ーおよび第４チャンバーから第１電気泳動性バッファーの流れの間で再循環する
。この状態において、マクロ分子の同時分離が達成され、第１バッファーの流れ
から小さなマクロ分子およびイオンが除去される。第１電気泳動性バッファーの
流れ中の溶質、塩およびイオンを第２制限膜を通して移動させることにより第２
バッファーの流れに除去する。第２バッファーの流れは、好ましくは第１チャン
バーに使用したものと同型のバッファーである。 工程（ｅ）の間、小さなマクロ分子は第１イオン透過性分離膜および／または
第１制限膜を通り移動し、第２制限膜を通し第１バッファーの流れに移動しても
よい。
ーおよび第４チャンバーから第１電気泳動性バッファーの流れの間で再循環する
。この状態において、マクロ分子の同時分離が達成され、第１バッファーの流れ
から小さなマクロ分子およびイオンが除去される。第１電気泳動性バッファーの
流れ中の溶質、塩およびイオンを第２制限膜を通して移動させることにより第２
バッファーの流れに除去する。第２バッファーの流れは、好ましくは第１チャン
バーに使用したものと同型のバッファーである。 工程（ｅ）の間、小さなマクロ分子は第１イオン透過性分離膜および／または
第１制限膜を通り移動し、第２制限膜を通し第１バッファーの流れに移動しても
よい。
【００１６】
第３の態様において、本発明は試料からの１つまたはそれ以上の生体分子、特
に組換え分子の分離における、本発明の第１の態様の装置の使用を提供する。 第４の態様において、本発明は、本発明の第２の態様の方法により生産された
組換え蛋白を提供する。 好ましくは、組換え蛋白は、開始試料から少なくとも７０％の純度、および少
なくとも７０％の回収率で得られる。より好ましくは、組換え蛋白は、開始試料
から少なくとも８０％の純度、および少なくとも８０％の回収率で得られる。さ
らにより好ましくは、組換え蛋白は、開始試料から少なくとも９０％の純度、お
よび少なくとも９０％の回収率で得られる。 組換え蛋白は真核および／または原核系（培地、培養物、上清または細胞溶解
物）から産生されるいずれかの組換え分子である。
に組換え分子の分離における、本発明の第１の態様の装置の使用を提供する。 第４の態様において、本発明は、本発明の第２の態様の方法により生産された
組換え蛋白を提供する。 好ましくは、組換え蛋白は、開始試料から少なくとも７０％の純度、および少
なくとも７０％の回収率で得られる。より好ましくは、組換え蛋白は、開始試料
から少なくとも８０％の純度、および少なくとも８０％の回収率で得られる。さ
らにより好ましくは、組換え蛋白は、開始試料から少なくとも９０％の純度、お
よび少なくとも９０％の回収率で得られる。 組換え蛋白は真核および／または原核系（培地、培養物、上清または細胞溶解
物）から産生されるいずれかの組換え分子である。
【００１７】
第５の態様において、本発明は、化合物の混合物から組換え蛋白を分離する方
法であって： （ａ）第１間隙容量および第２間隙容量の選択された一つに上記した混合物を入
れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも小さいか、または大き
い分子量カットオフを有するイオン透過性分離膜で分離されており、その第１お
よび第２間隙容量は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移
動を可能とするが、組換え蛋白の移動を妨げるように形成されたイオン透過性制
限膜により電気泳動性バッファーの流れから分離されており；その間隙容量は陰
極区分にある陰極と陽極区分にある陽極の間に位置付けられ、陰極と陽極の間に
電位を加えると、その間の電場領域に電場が発生するのに適合するように陰極に
対して相対的に陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように一のｐ
Ｈを有する第１間隙および第２間隙容量の選択された一つのための溶媒を選択し
； （ｃ）第１間隙および第２間隙容量の間に電位を加え、ここで電位を加えると、
混合物中の選択された化合物または組換え蛋白は、第１分離膜を通って移動し、
第１間隙および第２間隙容量の他方に提供され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、分離膜に入った選択された化合物ま
たは組換え蛋白を動かし、選択された化合物または組換え蛋白が取り出された間
隙容量に戻してもよいが、実質的に第１間隙容量および第２間隙容量の他方に提
供された選択された化合物または組換え蛋白はそのような選択された化合物また
は組換え蛋白が取り出された間隙容量に再び入ることはなく；および （ｅ）組換え蛋白が開始混合物から少なくとも約７０％の純度および少なくとも
約７０％の回収率で得られるまで、工程（ｃ）および任意の工程（ｄ）を維持す
る； ことを含む、組換え蛋白の分離方法を提供する。 好ましくは、第１間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは、組換え蛋白を
負に荷電させるために組換え蛋白のｐＩよりも大きいか、または組換え蛋白を正
に荷電させるために組換え蛋白のｐＩよりも小さいかどちらかである。
法であって： （ａ）第１間隙容量および第２間隙容量の選択された一つに上記した混合物を入
れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも小さいか、または大き
い分子量カットオフを有するイオン透過性分離膜で分離されており、その第１お
よび第２間隙容量は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移
動を可能とするが、組換え蛋白の移動を妨げるように形成されたイオン透過性制
限膜により電気泳動性バッファーの流れから分離されており；その間隙容量は陰
極区分にある陰極と陽極区分にある陽極の間に位置付けられ、陰極と陽極の間に
電位を加えると、その間の電場領域に電場が発生するのに適合するように陰極に
対して相対的に陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように一のｐ
Ｈを有する第１間隙および第２間隙容量の選択された一つのための溶媒を選択し
； （ｃ）第１間隙および第２間隙容量の間に電位を加え、ここで電位を加えると、
混合物中の選択された化合物または組換え蛋白は、第１分離膜を通って移動し、
第１間隙および第２間隙容量の他方に提供され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、分離膜に入った選択された化合物ま
たは組換え蛋白を動かし、選択された化合物または組換え蛋白が取り出された間
隙容量に戻してもよいが、実質的に第１間隙容量および第２間隙容量の他方に提
供された選択された化合物または組換え蛋白はそのような選択された化合物また
は組換え蛋白が取り出された間隙容量に再び入ることはなく；および （ｅ）組換え蛋白が開始混合物から少なくとも約７０％の純度および少なくとも
約７０％の回収率で得られるまで、工程（ｃ）および任意の工程（ｄ）を維持す
る； ことを含む、組換え蛋白の分離方法を提供する。 好ましくは、第１間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは、組換え蛋白を
負に荷電させるために組換え蛋白のｐＩよりも大きいか、または組換え蛋白を正
に荷電させるために組換え蛋白のｐＩよりも小さいかどちらかである。
【００１８】
さらには、１つの好ましい形態において、該方法は：
（ａ）混合物を試料の流れに置き、ここで試料の流れは組換え蛋白の分子量より
も小さい分子量カットオフを有するイオン透過性分離膜で生成物の流れから分離
されており；試料および生成物の流れは、電位を加えている間、イオンおよび小
さなマクロ分子の移動を可能とするように形成されたイオン透過性制限膜により
電気泳動性バッファーの流れから分離されており、試料および生成物の流れは陰
極区分にある陰極と陽極区分にある陽極の間に位置付けられ、陰極と陽極の間に
電位を加えると、その間の電場領域に電場が発生するのに適合するように陰極に
対して相対的に陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように一のｐ
Ｈを有する第１間隙容量のためのバファーまたは溶媒を選択し； （ｃ）試料と生成物の流れの間に電位を加え、組換え蛋白よりも小さな分子量を
有する混合物中の化合物が分離膜を通って生成物の流れに入るようにするが、組
換え蛋白は実質的に第１間隙容量に留まっているか、あるいは分離膜に入った場
合には、その分離膜を通過することが妨げられるようにし； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、分離膜に入った組換え蛋白を動かし
、第１間隙容量に戻してもよいが、実質的に生成物の流れに入った化合物が第１
間隙容量に再び入ることはなく；および （ｅ）組換え蛋白よりも小さな分子量を有する望ましい量の化合物を、第１間隙
容量中の混合物から取りだし、得られた試料中の組換え蛋白が開始混合物から少
なくとも約７０％の純度および少なくとも約７０％の回収率で得られるまで、工
程（ｃ）および任意の工程（ｄ）を維持する； ことを含む、組換え蛋白の分離方法を提供する。 好ましくは、第１間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは、化合物が負に
荷電されるように他の化合物のｐＩよりも大きい。
も小さい分子量カットオフを有するイオン透過性分離膜で生成物の流れから分離
されており；試料および生成物の流れは、電位を加えている間、イオンおよび小
さなマクロ分子の移動を可能とするように形成されたイオン透過性制限膜により
電気泳動性バッファーの流れから分離されており、試料および生成物の流れは陰
極区分にある陰極と陽極区分にある陽極の間に位置付けられ、陰極と陽極の間に
電位を加えると、その間の電場領域に電場が発生するのに適合するように陰極に
対して相対的に陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように一のｐ
Ｈを有する第１間隙容量のためのバファーまたは溶媒を選択し； （ｃ）試料と生成物の流れの間に電位を加え、組換え蛋白よりも小さな分子量を
有する混合物中の化合物が分離膜を通って生成物の流れに入るようにするが、組
換え蛋白は実質的に第１間隙容量に留まっているか、あるいは分離膜に入った場
合には、その分離膜を通過することが妨げられるようにし； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、分離膜に入った組換え蛋白を動かし
、第１間隙容量に戻してもよいが、実質的に生成物の流れに入った化合物が第１
間隙容量に再び入ることはなく；および （ｅ）組換え蛋白よりも小さな分子量を有する望ましい量の化合物を、第１間隙
容量中の混合物から取りだし、得られた試料中の組換え蛋白が開始混合物から少
なくとも約７０％の純度および少なくとも約７０％の回収率で得られるまで、工
程（ｃ）および任意の工程（ｄ）を維持する； ことを含む、組換え蛋白の分離方法を提供する。 好ましくは、第１間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは、化合物が負に
荷電されるように他の化合物のｐＩよりも大きい。
【００１９】
より特別には、他の好ましい形態において、該方法は：
（ａ）第１間隙容量および第２間隙容量の選択された一つに上記した混合物を入
れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも大きな分子量カットオ
フを有するイオン透過性分離膜で分離されており、その第１および第２間隙容量
は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とするよ
うに形成されたイオン透過性制限膜により電気泳動性バッファーの流れから分離
されており、その間隙容量は陰極区分にある陰極と陽極区分にある陽極の間に位
置付けられ、陰極と陽極の間に電位を加えると、その間の電場領域に電場が発生
するのに適合するように陰極に対して相対的に陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第１間隙および第２間隙容量の選択された一つに適する溶媒を選択
し； （ｃ）第１間隙および第２間隙容量の間に第１電位を加え、ここで第１電位を加
えると、組換え蛋白は第１分離膜を通って混合物から取り出され、第１間隙およ
び第２間隙容量の他方に提供され、残りの化合物は実質的に組換え蛋白が取り出
された間隙容量に保持されるか、または分離膜に入っているならば、その分離膜
を通過することが実質的に防止され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、分離膜に入った残りの化合物を動か
し、組換え蛋白が取り出された間隙容量に戻してもよいが、実質的に第１間隙容
量および第２間隙容量の他方に提供された組換え蛋白はそのような組換え蛋白が
取り出された間隙容量に再び入ることはなく；および （ｅ）望ましい量の組換え蛋白が混合物から取り出され、得られた組換え蛋白が
開始混合物から少なくとも約７０％の純度および少なくとも約７０％の回収率で
得られるまで、工程（ｃ）および任意の工程（ｄ）を維持する； ことを含む。 好ましくは、第１間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは、組換え蛋白が
負に荷電するように組換え蛋白のｐＩよりも大きい。
れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも大きな分子量カットオ
フを有するイオン透過性分離膜で分離されており、その第１および第２間隙容量
は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とするよ
うに形成されたイオン透過性制限膜により電気泳動性バッファーの流れから分離
されており、その間隙容量は陰極区分にある陰極と陽極区分にある陽極の間に位
置付けられ、陰極と陽極の間に電位を加えると、その間の電場領域に電場が発生
するのに適合するように陰極に対して相対的に陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第１間隙および第２間隙容量の選択された一つに適する溶媒を選択
し； （ｃ）第１間隙および第２間隙容量の間に第１電位を加え、ここで第１電位を加
えると、組換え蛋白は第１分離膜を通って混合物から取り出され、第１間隙およ
び第２間隙容量の他方に提供され、残りの化合物は実質的に組換え蛋白が取り出
された間隙容量に保持されるか、または分離膜に入っているならば、その分離膜
を通過することが実質的に防止され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、分離膜に入った残りの化合物を動か
し、組換え蛋白が取り出された間隙容量に戻してもよいが、実質的に第１間隙容
量および第２間隙容量の他方に提供された組換え蛋白はそのような組換え蛋白が
取り出された間隙容量に再び入ることはなく；および （ｅ）望ましい量の組換え蛋白が混合物から取り出され、得られた組換え蛋白が
開始混合物から少なくとも約７０％の純度および少なくとも約７０％の回収率で
得られるまで、工程（ｃ）および任意の工程（ｄ）を維持する； ことを含む。 好ましくは、第１間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは、組換え蛋白が
負に荷電するように組換え蛋白のｐＩよりも大きい。
【００２０】
第６の態様において、本発明は、化合物の混合物から組換え蛋白を分離する方
法であって： （ａ）第１間隙容量および第２間隙容量の選択された一つに上記した混合物を入
れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも小さい分子量カットオ
フを有する第１イオン透過性分離膜で分離されており、その第１および第２間隙
容量は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とす
るように形成された第１および第２イオン透過性制限膜により第１電気泳動性バ
ッファーの流れから分離されており、その第１および第２間隙容量は第１陰極区
分にある第１陰極と第１陽極区分にある第１陽極の間に位置付けられ、第１陰極
と第１陽極の間に電位を加えると、その間の第１電場領域に電場が発生するのに
適合するように第１陰極に対して相対的に第１陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第１間隙および第２間隙容量の選択された一つに適する溶媒を選択
し； （ｃ）第１間隙および第２間隙容量の間に第１電位を加え、ここで第１電位を加
えると、組換え蛋白よりも小さな分子量を有する混合物中の選択された化合物は
第１分離膜を通って混合物から取り出され、第１間隙および第２間隙容量の他方
に提供され、組換え蛋白は実質的に選択された化合物が取り出された間隙容量に
保持されるか、または第１分離膜に入っているならば、その第１分離膜を通過す
ることが実質的に防止され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、第１分離膜に入った組換え蛋白を動
かし、選択された化合物が取り出された間隙容量に戻してもよいが、実質的に第
１間隙容量および第２間隙容量の他方に提供された選択された化合物はそのよう
な選択された化合物が取り出された間隙容量に再び入ることはなく； （ｅ）望ましい量の選択された化合物が混合物から取り出されるまで、工程（ｃ
）および任意の工程（ｄ）を維持し； （ｆ）第３間隙容量および第４間隙容量の選択された一つに工程（ｅ）で得られ
た混合物を入れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも大きい分
子量カットオフを有する第２イオン透過性分離膜で分離されており、その第３お
よび第４間隙容量は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移
動を可能とするように形成された第３および第４イオン透過性制限膜により第２
電気泳動性バッファーの流れから分離されており、その第３および第４間隙容量
は第２陰極区分にある第２陰極と第２陽極区分にある第２陽極の間に位置付けら
れ、第２陰極と第２陽極の間に電位を加えると、その間の第２電場領域に電場が
発生するのに適合するように第２陰極に対して相対的に第２陽極を配置し； （ｇ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第３間隙および第４間隙容量の選択された一つに適する溶媒を選択
し； （ｈ）第３間隙および第４間隙容量の間に第２電位を加え、ここで第２電位を加
えると、組換え蛋白は第２分離膜を通って混合物から取り出され、第３間隙およ
び第４間隙容量の他方に提供され、残りの化合物は実質的に組換え蛋白が取り出
された間隙容量に保持されるか、または第２分離膜に入っているならば、その第
２分離膜を通過することが実質的に防止され； （ｉ）第２電位を定期的に止めて反転させ、第２分離膜に入った残りの化合物を
動かし、組換え蛋白が取り出された間隙容量に戻してもよいが、実質的に第３間
隙容量および第４間隙容量の他方に提供された組換え蛋白はそのような組換え蛋
白が取り出された間隙容量に再び入ることはなく； （ｊ）望ましい量の組換え蛋白が混合物から取り出されるまで、工程（ｈ）およ
び任意の工程（ｉ）を維持し、ここで組換え蛋白は開始化合物から少なくとも７
０％の純度で、少なくとも７０％の回収率で得られる； ことを含む方法を提供する。
法であって： （ａ）第１間隙容量および第２間隙容量の選択された一つに上記した混合物を入
れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも小さい分子量カットオ
フを有する第１イオン透過性分離膜で分離されており、その第１および第２間隙
容量は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とす
るように形成された第１および第２イオン透過性制限膜により第１電気泳動性バ
ッファーの流れから分離されており、その第１および第２間隙容量は第１陰極区
分にある第１陰極と第１陽極区分にある第１陽極の間に位置付けられ、第１陰極
と第１陽極の間に電位を加えると、その間の第１電場領域に電場が発生するのに
適合するように第１陰極に対して相対的に第１陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第１間隙および第２間隙容量の選択された一つに適する溶媒を選択
し； （ｃ）第１間隙および第２間隙容量の間に第１電位を加え、ここで第１電位を加
えると、組換え蛋白よりも小さな分子量を有する混合物中の選択された化合物は
第１分離膜を通って混合物から取り出され、第１間隙および第２間隙容量の他方
に提供され、組換え蛋白は実質的に選択された化合物が取り出された間隙容量に
保持されるか、または第１分離膜に入っているならば、その第１分離膜を通過す
ることが実質的に防止され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、第１分離膜に入った組換え蛋白を動
かし、選択された化合物が取り出された間隙容量に戻してもよいが、実質的に第
１間隙容量および第２間隙容量の他方に提供された選択された化合物はそのよう
な選択された化合物が取り出された間隙容量に再び入ることはなく； （ｅ）望ましい量の選択された化合物が混合物から取り出されるまで、工程（ｃ
）および任意の工程（ｄ）を維持し； （ｆ）第３間隙容量および第４間隙容量の選択された一つに工程（ｅ）で得られ
た混合物を入れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも大きい分
子量カットオフを有する第２イオン透過性分離膜で分離されており、その第３お
よび第４間隙容量は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移
動を可能とするように形成された第３および第４イオン透過性制限膜により第２
電気泳動性バッファーの流れから分離されており、その第３および第４間隙容量
は第２陰極区分にある第２陰極と第２陽極区分にある第２陽極の間に位置付けら
れ、第２陰極と第２陽極の間に電位を加えると、その間の第２電場領域に電場が
発生するのに適合するように第２陰極に対して相対的に第２陽極を配置し； （ｇ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第３間隙および第４間隙容量の選択された一つに適する溶媒を選択
し； （ｈ）第３間隙および第４間隙容量の間に第２電位を加え、ここで第２電位を加
えると、組換え蛋白は第２分離膜を通って混合物から取り出され、第３間隙およ
び第４間隙容量の他方に提供され、残りの化合物は実質的に組換え蛋白が取り出
された間隙容量に保持されるか、または第２分離膜に入っているならば、その第
２分離膜を通過することが実質的に防止され； （ｉ）第２電位を定期的に止めて反転させ、第２分離膜に入った残りの化合物を
動かし、組換え蛋白が取り出された間隙容量に戻してもよいが、実質的に第３間
隙容量および第４間隙容量の他方に提供された組換え蛋白はそのような組換え蛋
白が取り出された間隙容量に再び入ることはなく； （ｊ）望ましい量の組換え蛋白が混合物から取り出されるまで、工程（ｈ）およ
び任意の工程（ｉ）を維持し、ここで組換え蛋白は開始化合物から少なくとも７
０％の純度で、少なくとも７０％の回収率で得られる； ことを含む方法を提供する。
【００２１】
好ましくは、第１間隙および第２間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは
、選択された化合物が負に荷電されるように選択された化合物のｐＩよりも大き
い。 好ましくは、第３間隙および第４間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは
、組換え蛋白が負に荷電されるように組換え蛋白のｐＩよりも大きい。
、選択された化合物が負に荷電されるように選択された化合物のｐＩよりも大き
い。 好ましくは、第３間隙および第４間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは
、組換え蛋白が負に荷電されるように組換え蛋白のｐＩよりも大きい。
【００２２】
さらには、該方法は：
（ａ）第１間隙容量に上記した混合物を入れ、第１間隙容量は組換え蛋白の分子
量よりも小さい分子量カットオフを有する第１イオン透過性分離膜で第１生成物
の流れから分離されており；その第１試料および生成物の流れは、電位を加えて
いる間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とするように形成された第
１および第２イオン透過性制限膜により第１電気泳動性バッファーの流れから分
離されており、その第１試料および生成物の流れは第１陰極区分にある第１陰極
と第１陽極区分にある第１陽極の間に位置付けられ、第１陰極と第１陽極の間に
電位を加えると、その間の第１電場領域に電場が発生するのに適合するように第
１陰極に対して相対的に第１陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第１間隙容量に適するバッファーまたは溶媒を選択し； （ｃ）第１試料と第１生成物の流れの間に第１電位を加え、組換え蛋白よりも小
さな分子量を有する混合物中の化合物を第１分離膜を通って第１生成物の流れに
入るようにするが、組換え蛋白は実質的に第１間隙容量に留まったままであり、
または第１分離膜に入っているならば、その第１分離膜を通過することが実質的
に防止され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、第１分離膜に入った組換え蛋白を動
かし、第１間隙容量に戻してもよいが、実質的に第１生成物の流れに入った化合
物は第１間隙容量に再び入ることはなく； （ｅ）望ましい量の組換え蛋白よりも小さな分子量を有する化合物が第１間隙容
量にある混合物から取り出されるまで、工程（ｃ）および任意の工程（ｄ）を維
持し； （ｆ）第２間隙容量に工程（ｅ）で得られた混合物を入れ、第２試料の流れは組
換え蛋白の分子量よりも大きい分子量カットオフを有する第２イオン透過性分離
膜で第２生成物の流れから分離されており、その第２試料と第２生成物の流れは
、第２電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とする
ように形成された第３および第４イオン透過性制限膜により第２電気泳動性バッ
ファーの流れから分離されており、その第２試料および生成物の流れは第２陰極
区画にある第２陰極と第２陽極区画にある第２陽極の間に位置付けられ、第２陰
極と第２陽極の間に電位を加えると、その間の第２電場領域に電場が発生するの
に適合するように第２陰極に対して相対的に第２陽極を配置し； （ｇ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第１間隙容量に適するバッファーまたは溶媒を選択し； （ｈ）第２試料と生成物の流れの間に第２電位を加え、混合物中の組換え蛋白を
第２分離膜を通して第２生成物の流れの中に入れるが、混合物中の他の化合物は
実質的に第２間隙容量に保持されるか、または分離膜に入っているならば、その
分離膜を通過して第２生成物の流れに入ることが実質的に防止され； （ｉ）第２電位を定期的に止めて反転させ、第２分離膜に入った他の化合物を動
かし、第２間隙容量に戻してもよいが、実質的に第２生成物の流れに入った組換
え蛋白はいずれもそのような第２間隙容量に再び入ることはなく； （ｊ）望ましい量の組換え蛋白が混合物から第２生成物の流れの中に取り出され
るまで、工程（ｈ）および任意の工程（ｉ）を維持する、 ことを含む。
量よりも小さい分子量カットオフを有する第１イオン透過性分離膜で第１生成物
の流れから分離されており；その第１試料および生成物の流れは、電位を加えて
いる間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とするように形成された第
１および第２イオン透過性制限膜により第１電気泳動性バッファーの流れから分
離されており、その第１試料および生成物の流れは第１陰極区分にある第１陰極
と第１陽極区分にある第１陽極の間に位置付けられ、第１陰極と第１陽極の間に
電位を加えると、その間の第１電場領域に電場が発生するのに適合するように第
１陰極に対して相対的に第１陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第１間隙容量に適するバッファーまたは溶媒を選択し； （ｃ）第１試料と第１生成物の流れの間に第１電位を加え、組換え蛋白よりも小
さな分子量を有する混合物中の化合物を第１分離膜を通って第１生成物の流れに
入るようにするが、組換え蛋白は実質的に第１間隙容量に留まったままであり、
または第１分離膜に入っているならば、その第１分離膜を通過することが実質的
に防止され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、第１分離膜に入った組換え蛋白を動
かし、第１間隙容量に戻してもよいが、実質的に第１生成物の流れに入った化合
物は第１間隙容量に再び入ることはなく； （ｅ）望ましい量の組換え蛋白よりも小さな分子量を有する化合物が第１間隙容
量にある混合物から取り出されるまで、工程（ｃ）および任意の工程（ｄ）を維
持し； （ｆ）第２間隙容量に工程（ｅ）で得られた混合物を入れ、第２試料の流れは組
換え蛋白の分子量よりも大きい分子量カットオフを有する第２イオン透過性分離
膜で第２生成物の流れから分離されており、その第２試料と第２生成物の流れは
、第２電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とする
ように形成された第３および第４イオン透過性制限膜により第２電気泳動性バッ
ファーの流れから分離されており、その第２試料および生成物の流れは第２陰極
区画にある第２陰極と第２陽極区画にある第２陽極の間に位置付けられ、第２陰
極と第２陽極の間に電位を加えると、その間の第２電場領域に電場が発生するの
に適合するように第２陰極に対して相対的に第２陽極を配置し； （ｇ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第１間隙容量に適するバッファーまたは溶媒を選択し； （ｈ）第２試料と生成物の流れの間に第２電位を加え、混合物中の組換え蛋白を
第２分離膜を通して第２生成物の流れの中に入れるが、混合物中の他の化合物は
実質的に第２間隙容量に保持されるか、または分離膜に入っているならば、その
分離膜を通過して第２生成物の流れに入ることが実質的に防止され； （ｉ）第２電位を定期的に止めて反転させ、第２分離膜に入った他の化合物を動
かし、第２間隙容量に戻してもよいが、実質的に第２生成物の流れに入った組換
え蛋白はいずれもそのような第２間隙容量に再び入ることはなく； （ｊ）望ましい量の組換え蛋白が混合物から第２生成物の流れの中に取り出され
るまで、工程（ｈ）および任意の工程（ｉ）を維持する、 ことを含む。
【００２３】
好ましくは、組換え蛋白は開始混合物から少なくとも約７０％の純度および少
なくとも約７０％の回収率で得られる。 好ましくは、第１間隙および第２間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは
、選択された化合物が負に荷電するように、選択された化合物のｐＩよりも大き
い。 好ましくは、第３間隙および第４間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは
、組換え蛋白が負に荷電するように、組換え蛋白のｐＩよりも大きい。 好ましくは、第２陰極、第２陰極バッファー区分、第２陽極、第２陽極バッフ
ァー区分および第２電気泳動性バッファーはセカンダリー分離システムにおいて
、連続的に配置される。
なくとも約７０％の回収率で得られる。 好ましくは、第１間隙および第２間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは
、選択された化合物が負に荷電するように、選択された化合物のｐＩよりも大き
い。 好ましくは、第３間隙および第４間隙容量中の溶媒またはバッファーのｐＨは
、組換え蛋白が負に荷電するように、組換え蛋白のｐＩよりも大きい。 好ましくは、第２陰極、第２陰極バッファー区分、第２陽極、第２陽極バッフ
ァー区分および第２電気泳動性バッファーはセカンダリー分離システムにおいて
、連続的に配置される。
【００２４】
１の具体例において、この混合物は組換え微生物により発現かつ放出され、細
胞外で得られるか、または移送された組換え蛋白を含む培地である。別法として
、混合物は蛋白を発現するが、必ずしも細胞外への蛋白の放出または移送をしな
い組換え微生物の細胞溶解物である。組換え蛋白が細胞から分泌されるとすれば
、通常はまず、細胞を取り出すために培地が処理される。細胞を取り出すために
用いられる適当な方法は、例えば、遠心分離、濾過または凝集である。細胞を取
り出した後、混合物を本発明により処理される前に希釈するか、または処理でき
る。組換え蛋白を分泌しない組換え微生物の場合、細胞は、典型的には、溶解さ
れるか、または処理され、組換え蛋白は溶液中に放出される。溶菌は加圧または
浸透圧衝撃を含む多数の手段により達成される。細胞溶解物を、本発明による処
理の前に遠心分離するか、または濾過して細胞の残骸を除去できる。 好ましくは、イオン透過性分離膜は、約４０〜約１０００ｋＤａの分子量カッ
トオフを有する電気泳動分離膜である。膜カットオフの大きさは、混合物中の組
換え蛋白および他の生体分子の大きさに依存するだろう。
胞外で得られるか、または移送された組換え蛋白を含む培地である。別法として
、混合物は蛋白を発現するが、必ずしも細胞外への蛋白の放出または移送をしな
い組換え微生物の細胞溶解物である。組換え蛋白が細胞から分泌されるとすれば
、通常はまず、細胞を取り出すために培地が処理される。細胞を取り出すために
用いられる適当な方法は、例えば、遠心分離、濾過または凝集である。細胞を取
り出した後、混合物を本発明により処理される前に希釈するか、または処理でき
る。組換え蛋白を分泌しない組換え微生物の場合、細胞は、典型的には、溶解さ
れるか、または処理され、組換え蛋白は溶液中に放出される。溶菌は加圧または
浸透圧衝撃を含む多数の手段により達成される。細胞溶解物を、本発明による処
理の前に遠心分離するか、または濾過して細胞の残骸を除去できる。 好ましくは、イオン透過性分離膜は、約４０〜約１０００ｋＤａの分子量カッ
トオフを有する電気泳動分離膜である。膜カットオフの大きさは、混合物中の組
換え蛋白および他の生体分子の大きさに依存するだろう。
【００２５】
本発明による方法に特に適当であることが見出されたバッファーは約ｐＨ９の
トリスホウ酸塩およびＧＡＢＡ（ガンマアミノ酪酸）である。しかしながら、分
離すべき蛋白に応じて他のバッファーが使用されることは明らかだろう。選択さ
れたバッファーの濃度は、分離膜を通るマクロ分子の移動に影響を与えるか、ま
たは作用する。典型的には、約２００ｍＭまで、より好ましくは約２０ｍＭ〜約
８０ｍＭの濃度が特に適当であることが見出された。 選択されたバッファーの濃度はまた、組換え蛋白を含む生体分子および化合物
の分離膜を通る動きに影響を与えるか、または作用する。 １の具体例において、分離された組換え蛋白は、その後、その組換え蛋白の分
子量よりも小さな分子量カットオフを有する電気泳動分離膜を組み込んだシステ
ムを用いて濃縮される。 本発明による方法は、少なくとも約９０％の純度で約７０％以上の収率を与え
る。 本発明による方法の利点は組換え蛋白の物理学的または生物学的特性を変性さ
せるか、または不利に変えることなしにスケールアップの可能性のあることであ
る。
トリスホウ酸塩およびＧＡＢＡ（ガンマアミノ酪酸）である。しかしながら、分
離すべき蛋白に応じて他のバッファーが使用されることは明らかだろう。選択さ
れたバッファーの濃度は、分離膜を通るマクロ分子の移動に影響を与えるか、ま
たは作用する。典型的には、約２００ｍＭまで、より好ましくは約２０ｍＭ〜約
８０ｍＭの濃度が特に適当であることが見出された。 選択されたバッファーの濃度はまた、組換え蛋白を含む生体分子および化合物
の分離膜を通る動きに影響を与えるか、または作用する。 １の具体例において、分離された組換え蛋白は、その後、その組換え蛋白の分
子量よりも小さな分子量カットオフを有する電気泳動分離膜を組み込んだシステ
ムを用いて濃縮される。 本発明による方法は、少なくとも約９０％の純度で約７０％以上の収率を与え
る。 本発明による方法の利点は組換え蛋白の物理学的または生物学的特性を変性さ
せるか、または不利に変えることなしにスケールアップの可能性のあることであ
る。
【００２６】
第７の態様において、本発明は本発明により精製されるか、または分離された
組換え蛋白を提供する。 第８の態様において、本発明は医学的および獣医学的適用における本発明の第
７の態様による組換え蛋白の使用に関する。
組換え蛋白を提供する。 第８の態様において、本発明は医学的および獣医学的適用における本発明の第
７の態様による組換え蛋白の使用に関する。
【００２７】
本明細書にわたって、特に必要としない限り、「含む（comprise）」またはそ
の派生語（comprisesまたはcomprising）なる語は、所定の要素、整数または工
程あるいは一群の要素、整数または工程を含むことを意味し、他の要素、整数ま
たは工程あるいは一群の要素、整数または工程を除外するものではない。 本明細書に含まれる書類、作用、物質、機器、論文等は、本発明の状況を分か
り易くする目的のために提供されているにすぎない。これらの事項のうちいずれ
かまたはすべてが、従来技術の基礎の一部を形成するか、あるいは本願の優先日
の前にオーストラリアに存在する本発明に関連する分野では常識であると考える
べきではない。 本発明をより明確に理解するために、好ましい形態を以下の図面および実施例
をもって説明する。
の派生語（comprisesまたはcomprising）なる語は、所定の要素、整数または工
程あるいは一群の要素、整数または工程を含むことを意味し、他の要素、整数ま
たは工程あるいは一群の要素、整数または工程を除外するものではない。 本明細書に含まれる書類、作用、物質、機器、論文等は、本発明の状況を分か
り易くする目的のために提供されているにすぎない。これらの事項のうちいずれ
かまたはすべてが、従来技術の基礎の一部を形成するか、あるいは本願の優先日
の前にオーストラリアに存在する本発明に関連する分野では常識であると考える
べきではない。 本発明をより明確に理解するために、好ましい形態を以下の図面および実施例
をもって説明する。
【００２８】
（図面の簡単な記載）
図１は、本発明の方法を用いてアルブミンを分離する間に、バッファーの流れ
の中に蛋白が段階的に蓄積されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レー
ン１：シグマ分子量マーカー。レーン２：Ｂ／Ｓ（バッファーの流れ）時間０分
。レーン３：Ｂ／Ｓ時間６０分。レーン４：Ｂ／Ｓ時間１２０分。レーン５：Ｂ
／Ｓ時間１８０分。レーン６：Ｂ／Ｓ時間２７０分。 図２は、本発明の方法を用いてアルブミンを分離する間に、バッファーの流れ
の中に蛋白が段階的に蓄積されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レー
ン１：シグマ分子量マーカー。レーン２：Ｂ／Ｓ（バッファーの流れ）アルブミ
ン分離の時間０。レーン３：Ｂ／Ｓアルブミン分離の時間６０。レーン４：Ｂ／
Ｓアルブミン分離の時間１２０。レーン５：Ｂ／Ｓアルブミン分離の時間１８０
分。レーン６：Ｂ／Ｓアルブミン分離の時間２７０。レーン７：Ｄ／Ｓ（下流）
時間６０分。レーン８：Ｄ／Ｓ時間１２０分。レーン９：Ｄ／Ｓ時間１８０分。
レーン１０：Ｄ／Ｓ時間２７０分。 図３は、アルブミンを分離する間にバッファーの流れ中に存在する蛋白の量お
よびバッファー再生法を用いて取り出された蛋白の量を示す、シプロ・ルビー（
Sypro ruby）（BioRad）で染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。分離操作を
２００ｋＤａ分離膜を５０ｋＤａ制限膜と共に用いて、１５ｍＬの直血漿から１
５０分で行い、ついでカートリッジを交換し、再び同様の操作を行った。バッフ
ァーを２つの実験の間で交換しなかった。ついで、コンタミネートされたバッフ
ァーを本発明により１．５ｋＤａ分離膜および５ｋＤａ制限膜を用いるシングル
パス法によりきれいにした。レーン１：シグマ分子量マーカー。レーン２：Ｂ／
Ｓ（バッファーの流れ）アルブミン分離の時間０。レーン３：Ｂ／Ｓアルブミン
分離の時間１５０分。レーン４：Ｂ／Ｓアルブミン分離の時間２７０分。レーン
５：バッファー再生の最初の通過後のＢ／Ｓ。レーン６：２回目の通過後のＢ／
Ｓ。レーン７：最初の通過後のＤ／Ｓ。レーン８：２回目の通過後のＤ／Ｓ。レ
ーン９：３回目の通過後のＤ／Ｓ。 図４は、オンラインバッファー再生スキームの模式図を示す。本発明による第
１の装置（ＢＦ１）は蛋白精製のために用いられ、本発明による第２の装置（Ｂ
Ｆ２）は、分離を行う間、ＢＦ１のバッファーの流れをきれいにした。 図５は、本発明により分離される組換えモノクローナル抗体の減少性ＳＤＳ
ＰＡＧＥゲル（８〜１８％勾配）分析を示す。 図６は、５０ｋＤａ分離のクマシー染色した非減少性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す
。試料を分析前０、６０、９０、１２０分で上流に、６０、９０、１２０分で下
流に入れた。ＷはＰＢＳ洗浄を示す。 図７は、５０ｋＤａ分離の銀染色を示す。試料を洗浄フラクション（Ｗ）を除
いて、図４のように付す。クマシー染色ゲルに関して現れる高分子量コンタミナ
ントが銀染色（負荷電染色）に関しては現れなかった。 図８は、本発明の分離システムまたは装置の好ましい具体例の模式図を示す。
の中に蛋白が段階的に蓄積されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レー
ン１：シグマ分子量マーカー。レーン２：Ｂ／Ｓ（バッファーの流れ）時間０分
。レーン３：Ｂ／Ｓ時間６０分。レーン４：Ｂ／Ｓ時間１２０分。レーン５：Ｂ
／Ｓ時間１８０分。レーン６：Ｂ／Ｓ時間２７０分。 図２は、本発明の方法を用いてアルブミンを分離する間に、バッファーの流れ
の中に蛋白が段階的に蓄積されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レー
ン１：シグマ分子量マーカー。レーン２：Ｂ／Ｓ（バッファーの流れ）アルブミ
ン分離の時間０。レーン３：Ｂ／Ｓアルブミン分離の時間６０。レーン４：Ｂ／
Ｓアルブミン分離の時間１２０。レーン５：Ｂ／Ｓアルブミン分離の時間１８０
分。レーン６：Ｂ／Ｓアルブミン分離の時間２７０。レーン７：Ｄ／Ｓ（下流）
時間６０分。レーン８：Ｄ／Ｓ時間１２０分。レーン９：Ｄ／Ｓ時間１８０分。
レーン１０：Ｄ／Ｓ時間２７０分。 図３は、アルブミンを分離する間にバッファーの流れ中に存在する蛋白の量お
よびバッファー再生法を用いて取り出された蛋白の量を示す、シプロ・ルビー（
Sypro ruby）（BioRad）で染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。分離操作を
２００ｋＤａ分離膜を５０ｋＤａ制限膜と共に用いて、１５ｍＬの直血漿から１
５０分で行い、ついでカートリッジを交換し、再び同様の操作を行った。バッフ
ァーを２つの実験の間で交換しなかった。ついで、コンタミネートされたバッフ
ァーを本発明により１．５ｋＤａ分離膜および５ｋＤａ制限膜を用いるシングル
パス法によりきれいにした。レーン１：シグマ分子量マーカー。レーン２：Ｂ／
Ｓ（バッファーの流れ）アルブミン分離の時間０。レーン３：Ｂ／Ｓアルブミン
分離の時間１５０分。レーン４：Ｂ／Ｓアルブミン分離の時間２７０分。レーン
５：バッファー再生の最初の通過後のＢ／Ｓ。レーン６：２回目の通過後のＢ／
Ｓ。レーン７：最初の通過後のＤ／Ｓ。レーン８：２回目の通過後のＤ／Ｓ。レ
ーン９：３回目の通過後のＤ／Ｓ。 図４は、オンラインバッファー再生スキームの模式図を示す。本発明による第
１の装置（ＢＦ１）は蛋白精製のために用いられ、本発明による第２の装置（Ｂ
Ｆ２）は、分離を行う間、ＢＦ１のバッファーの流れをきれいにした。 図５は、本発明により分離される組換えモノクローナル抗体の減少性ＳＤＳ
ＰＡＧＥゲル（８〜１８％勾配）分析を示す。 図６は、５０ｋＤａ分離のクマシー染色した非減少性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す
。試料を分析前０、６０、９０、１２０分で上流に、６０、９０、１２０分で下
流に入れた。ＷはＰＢＳ洗浄を示す。 図７は、５０ｋＤａ分離の銀染色を示す。試料を洗浄フラクション（Ｗ）を除
いて、図４のように付す。クマシー染色ゲルに関して現れる高分子量コンタミナ
ントが銀染色（負荷電染色）に関しては現れなかった。 図８は、本発明の分離システムまたは装置の好ましい具体例の模式図を示す。
【００２９】
図８は本発明の装置１０の好ましい具体例を示す。装置１０は第１陰極区分ま
たは区画１１および第１陽極区分または区画１２を含み、膜１９、１３および２
０で分けられる。電極１４および１５は第１分離膜１３ならびに第１および第２
制限膜１９および２０の両側にあるように電極区分または区画の内側に設けられ
る。しかしながら、もう一つ別の具体例において、電極はバッファー区画の外に
位置付けられることが理解される。電極を用いて第１分離膜を横切るように電気
泳動性電位を加える。 第１チャンバー１７は第１陰極区画１１と第１分離膜１３の間に位置付けられ
る。第１チャンバーは一の面を第１分離膜１３で、他の面を第１制限膜１９で定
められる。しかしながら、もう一つ別の具体例において、第１チャンバーは陽極
バッファー区画とその分離膜の間に位置付けられることが理解される。 第２チャンバー１８は第１陽極バッファー区画１２と第１分離膜１３の間に位
置付けられる。第２チャンバーは一の面を第１分離膜１３で、他の面を第２制限
膜２０で定められる。しかしながら、もう一つ別の具体例において、第２チャン
バーは陰極バッファー区画と第１分離膜の間に位置付けられることが理解される
。 装置はさらに第１電源の適用を選択するためのスイッチ２５（電源を切るか、
または静止期間を設けるためなどのスイッチ）、陰極／陽極の電流の方向を切り
かえるか、反転期間を設けるためのスイッチ２６、および電源２７および２８を
含む。
たは区画１１および第１陽極区分または区画１２を含み、膜１９、１３および２
０で分けられる。電極１４および１５は第１分離膜１３ならびに第１および第２
制限膜１９および２０の両側にあるように電極区分または区画の内側に設けられ
る。しかしながら、もう一つ別の具体例において、電極はバッファー区画の外に
位置付けられることが理解される。電極を用いて第１分離膜を横切るように電気
泳動性電位を加える。 第１チャンバー１７は第１陰極区画１１と第１分離膜１３の間に位置付けられ
る。第１チャンバーは一の面を第１分離膜１３で、他の面を第１制限膜１９で定
められる。しかしながら、もう一つ別の具体例において、第１チャンバーは陽極
バッファー区画とその分離膜の間に位置付けられることが理解される。 第２チャンバー１８は第１陽極バッファー区画１２と第１分離膜１３の間に位
置付けられる。第２チャンバーは一の面を第１分離膜１３で、他の面を第２制限
膜２０で定められる。しかしながら、もう一つ別の具体例において、第２チャン
バーは陰極バッファー区画と第１分離膜の間に位置付けられることが理解される
。 装置はさらに第１電源の適用を選択するためのスイッチ２５（電源を切るか、
または静止期間を設けるためなどのスイッチ）、陰極／陽極の電流の方向を切り
かえるか、反転期間を設けるためのスイッチ２６、および電源２７および２８を
含む。
【００３０】
装置１０は第２陰極区分または区画３１および第２陽極区分または区画３２を
含み、３つの膜３９、３３および４０で分けられる。電極３４および３５は分離
膜３３ならびに制限膜３９および４０の両側にあるように電極区分または区画の
内側に設けられる。しかしながら、もう一つ別の具体例において、電極はバッフ
ァー区画の外に位置付けられることが理解される。電極を用いて分離膜を横切る
ように電気泳動性電位を加える。 第３チャンバー３７は陰極区画３１と分離膜３３の間に位置付けられる。第３
チャンバーは一の面を分離膜３３で、他の面を第３制限膜３９で定められる。し
かしながら、もう一つ別の具体例において、第３チャンバーは陽極バッファー区
画とその分離膜の間に位置付けられることが理解される。 第４チャンバー３８は陽極区画３２と第２分離膜３３の間に位置付けられる。
第４チャンバーは一の面を第２分離膜３３で、他の面を第４制限膜４０で定めら
れる。しかしながら、もう一つ別の具体例において、第４チャンバーは第２陰極
区画と第２分離膜の間に位置付けられることが理解される。 装置はさらに第２電源の適用を選択するためのスイッチ４５（電源を切るか、
または静止期間を設けるためなどのスイッチ）、陰極／陽極の電流の方向を切り
かえるか、反転期間を設けるためのスイッチ４６、および電源４７および４８を
含む。
含み、３つの膜３９、３３および４０で分けられる。電極３４および３５は分離
膜３３ならびに制限膜３９および４０の両側にあるように電極区分または区画の
内側に設けられる。しかしながら、もう一つ別の具体例において、電極はバッフ
ァー区画の外に位置付けられることが理解される。電極を用いて分離膜を横切る
ように電気泳動性電位を加える。 第３チャンバー３７は陰極区画３１と分離膜３３の間に位置付けられる。第３
チャンバーは一の面を分離膜３３で、他の面を第３制限膜３９で定められる。し
かしながら、もう一つ別の具体例において、第３チャンバーは陽極バッファー区
画とその分離膜の間に位置付けられることが理解される。 第４チャンバー３８は陽極区画３２と第２分離膜３３の間に位置付けられる。
第４チャンバーは一の面を第２分離膜３３で、他の面を第４制限膜４０で定めら
れる。しかしながら、もう一つ別の具体例において、第４チャンバーは第２陰極
区画と第２分離膜の間に位置付けられることが理解される。 装置はさらに第２電源の適用を選択するためのスイッチ４５（電源を切るか、
または静止期間を設けるためなどのスイッチ）、陰極／陽極の電流の方向を切り
かえるか、反転期間を設けるためのスイッチ４６、および電源４７および４８を
含む。
【００３１】
使用において、第１陰極１１および第１陰極１２区画または区分にあるバッフ
ァーはフロー５０により第3チャンバーまたは間隙容量３７に供給され、そこで
バッファー中の小さな化合物は第４チャンバー３８に移される。ついで、バッフ
ァーをフロー５１により第１陰極１１および第１陰極１２区画または区分に戻し
てリサイクルに付す。 本発明に係る装置またはシステムを用いて、化合物、蛋白または他のマクロ分
子の混合物を含有する試料を精製または処理する間に、電気泳動性バッファーの
小さなマクロ分子での段階的コンタミネーションが見られる。このコンタミネー
ションは図１および２から明らかである。 開放式上部制限膜および開放式分離膜であるが、閉鎖式下部制限膜を有する装
置を通してアルブミン分離液からのバッファーをシングルパス方式にて循環させ
ることにより、大部分の低分子量の蛋白をそのバッファーから取り出すことがで
きる。ついで、第２のパスを行うことにより、図３に示されるように、ｐＨおよ
び伝導率を維持しながら、溶液から残りの最終蛋白を取り出すことも可能であっ
た。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと組み合わせて、ＯＤ２８０と銀およびシプロ（
Sypro）ルビー（BioRad）蛋白染色を用いてこの方法を評価し、操作の間にバッ
ファー流に入っているコンタミナントの大部分が取り出しに成功していることが
わかった。 さらに、図４に示されるようなバッファー流を処理するための別の装置を用い
て分離を行う間にも、低分子量のコンタミナントの大部分がバッファーから除去
されることが見出された。このオンライン式バッファー再生は、操作の間にバッ
ファーをきれいにすることができ、分離を行うのに必要なバッファーの量を効果
的に減少させ、そして操作の間にバッファーを変更する必要性が排除される、と
いう多くの利点がある。バッファーの寿命を延ばすことができ、そのため、商業
的規模で分離する場合に必要とされるバッファーの量をより低いレベルにまで下
げることができる。
ァーはフロー５０により第3チャンバーまたは間隙容量３７に供給され、そこで
バッファー中の小さな化合物は第４チャンバー３８に移される。ついで、バッフ
ァーをフロー５１により第１陰極１１および第１陰極１２区画または区分に戻し
てリサイクルに付す。 本発明に係る装置またはシステムを用いて、化合物、蛋白または他のマクロ分
子の混合物を含有する試料を精製または処理する間に、電気泳動性バッファーの
小さなマクロ分子での段階的コンタミネーションが見られる。このコンタミネー
ションは図１および２から明らかである。 開放式上部制限膜および開放式分離膜であるが、閉鎖式下部制限膜を有する装
置を通してアルブミン分離液からのバッファーをシングルパス方式にて循環させ
ることにより、大部分の低分子量の蛋白をそのバッファーから取り出すことがで
きる。ついで、第２のパスを行うことにより、図３に示されるように、ｐＨおよ
び伝導率を維持しながら、溶液から残りの最終蛋白を取り出すことも可能であっ
た。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと組み合わせて、ＯＤ２８０と銀およびシプロ（
Sypro）ルビー（BioRad）蛋白染色を用いてこの方法を評価し、操作の間にバッ
ファー流に入っているコンタミナントの大部分が取り出しに成功していることが
わかった。 さらに、図４に示されるようなバッファー流を処理するための別の装置を用い
て分離を行う間にも、低分子量のコンタミナントの大部分がバッファーから除去
されることが見出された。このオンライン式バッファー再生は、操作の間にバッ
ファーをきれいにすることができ、分離を行うのに必要なバッファーの量を効果
的に減少させ、そして操作の間にバッファーを変更する必要性が排除される、と
いう多くの利点がある。バッファーの寿命を延ばすことができ、そのため、商業
的規模で分離する場合に必要とされるバッファーの量をより低いレベルにまで下
げることができる。
【００３２】
一般に、出発物質の複合的蛋白混合物として５ｍｌの血漿を用いる場合の研究
規模の装置においては、１．５−１．８リットルのバッファーがバッファー流を
介して循環される。より大きな規模の装置の場合、より効率的な冷却システムが
用いられるため、必要とされるバッファーの量を減少させることができる。６０
倍スケールアップしたモデルでは、５０Ｌのバッファーが必要とされるであろう
。血漿の開始量を１００リットルに上げたならば、その場合、バッファー流の要
件の補外は、分離を行うのに１７０００リットルのバッファーが必要とされるこ
とを意味する。このことは、バッファー材料、水およびまたこれら多量のバッフ
ァーの貯蔵および冷却などの諸経費が大きく、バッファーの量が許容できない程
多量であるとすることができる。使用するバッファーの量をより少なくできるこ
とは、この種の状況において多大な商業的利点があるであろう。 本発明の２０倍スケールアップしたモデルの場合、２５０ｍＬの血漿が処理さ
れた。この容量の血漿を１平方センチメートル当たりの膜に適用すれば、工業的
規模のシステムに用いた場合に、分離されるべき１００Ｌの血漿に対して６７０
０Ｌのバッファーに相当する。トリス−ホウ酸バッファー（ｐＨ９）を用いる場
合の典型的なアルブミン分離に対するバッファー１リットル当たりの経費を考え
た場合、一回のバッファー交換を行う操作当たりの費用は７０００ドルを越える
。 分離を行っている別の装置のバッファー流に取り付けられた一台の装置で、そ
の操作を介してバッファー流から少なくとも１５％のコンタミナントを取り出す
ことができる。たった一回の分離ユニットを介するリサイクルで１５％のバッフ
ァー容量が減少することは一回の分離につき約３６００Ｌのバッファーの節約を
生み出すであろう。 大規模のユニットにおいて、多数のカートリッジを、何ら問題なく、数本のバ
ッファー再生流を導入することのできる、サンドイッチ配列で相互に積み重ねる
ことができることが認識されている。数本のバッファー再生流を使用することで
、一回の分離につきバッファーを変える必要性が減少し、ずっと少ない量のバッ
ファーをバッファー流に用いることも可能となるであろう。バッファーをリサイ
クルし、２回の分離に用いたならば、１００リットルの血漿の分離において、か
なりの節約がなされるであろう。数社が年間に数十万リットルの血漿を処理して
いることを鑑みれば、その節約は本当に価値のあるものである。
規模の装置においては、１．５−１．８リットルのバッファーがバッファー流を
介して循環される。より大きな規模の装置の場合、より効率的な冷却システムが
用いられるため、必要とされるバッファーの量を減少させることができる。６０
倍スケールアップしたモデルでは、５０Ｌのバッファーが必要とされるであろう
。血漿の開始量を１００リットルに上げたならば、その場合、バッファー流の要
件の補外は、分離を行うのに１７０００リットルのバッファーが必要とされるこ
とを意味する。このことは、バッファー材料、水およびまたこれら多量のバッフ
ァーの貯蔵および冷却などの諸経費が大きく、バッファーの量が許容できない程
多量であるとすることができる。使用するバッファーの量をより少なくできるこ
とは、この種の状況において多大な商業的利点があるであろう。 本発明の２０倍スケールアップしたモデルの場合、２５０ｍＬの血漿が処理さ
れた。この容量の血漿を１平方センチメートル当たりの膜に適用すれば、工業的
規模のシステムに用いた場合に、分離されるべき１００Ｌの血漿に対して６７０
０Ｌのバッファーに相当する。トリス−ホウ酸バッファー（ｐＨ９）を用いる場
合の典型的なアルブミン分離に対するバッファー１リットル当たりの経費を考え
た場合、一回のバッファー交換を行う操作当たりの費用は７０００ドルを越える
。 分離を行っている別の装置のバッファー流に取り付けられた一台の装置で、そ
の操作を介してバッファー流から少なくとも１５％のコンタミナントを取り出す
ことができる。たった一回の分離ユニットを介するリサイクルで１５％のバッフ
ァー容量が減少することは一回の分離につき約３６００Ｌのバッファーの節約を
生み出すであろう。 大規模のユニットにおいて、多数のカートリッジを、何ら問題なく、数本のバ
ッファー再生流を導入することのできる、サンドイッチ配列で相互に積み重ねる
ことができることが認識されている。数本のバッファー再生流を使用することで
、一回の分離につきバッファーを変える必要性が減少し、ずっと少ない量のバッ
ファーをバッファー流に用いることも可能となるであろう。バッファーをリサイ
クルし、２回の分離に用いたならば、１００リットルの血漿の分離において、か
なりの節約がなされるであろう。数社が年間に数十万リットルの血漿を処理して
いることを鑑みれば、その節約は本当に価値のあるものである。
【００３３】
組換えＤＮＡ法は、新規な治療用および診断用製品を開発するための強力な手
段を提供する。しかしながら、これらの製品を利用するにおいて主たる問題点は
、それらの製品を培養液から高純度および高回収率で単離することにある。本発
明は、組換えモノクローナル抗体を含む、組換え蛋白を、製品またはその活性を
最小の損失で、その発現培地から単離するところの新規な方法を提供する。
段を提供する。しかしながら、これらの製品を利用するにおいて主たる問題点は
、それらの製品を培養液から高純度および高回収率で単離することにある。本発
明は、組換えモノクローナル抗体を含む、組換え蛋白を、製品またはその活性を
最小の損失で、その発現培地から単離するところの新規な方法を提供する。
【００３４】
組換えモノクローナル抗体を含有する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞発現培地を、本発明に係る装置の上流に置いた。混合蛋白を電荷および大
きさに基づいて除去する二段階方法にて抗体を精製した。段階１はトリスホウ酸
塩バッファー（ｐＨ８．０）の使用を含む。このｐＨで標的抗体は第１間隙容量
中に留まるが、２５０Ｖを用いると混合蛋白は３００ｋＤａの孔径分離膜を通る
生成物の流れに変わり、そこでコンタミナントを一定間隔で集めて収穫した。組
換え蛋白は処理された第１間隙容量に留まった。段階１を９０分間行った。 段階２はＧＡＢＡ（ガンマアミノ酪酸２４ｍＭ、酢酸１３３ｍＭ）を用いてｐ
Ｈ４．２にバッファーを変更することを含み、標的蛋白（組換えモノクローナル
抗体）を正に荷電させた。ついで、２５０Ｖの逆極性を用いて抗体を処理された
第１間隙容量から下流に移し、一定間隔で集めて収穫した。段階２を１８０分間
行った。 標的組換えモノクローナル抗体を二段階方法にてＣＨＯ培地から精製した。生
成物の純度を図５に示されるような還元性ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて分析した。
イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の特徴的な重鎖および軽鎖が明瞭であり、純度は
９５％より大きいことと推定された。クマシー染色法を用いて極微量のコンタミ
ネーションを観察した。 生成物の回収率をＯＤ２８０ｎｍを読み取ることで測定し、開始材料の８７％
であると算定された。開始濃度をBehring BN 100比濁計をＤＡＤＥ Behring IgG
比濁計試薬と組み合わせて用いて測定した。製造業者の指示に従ってアッセイを
行った。 組換えモノクローナル抗体を、開始生成物の８７％回収率にて、二段階単離方
法によりＣＨＯ培地から精製した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析に基づいて純度は９５
％より大きいと推定された。
）細胞発現培地を、本発明に係る装置の上流に置いた。混合蛋白を電荷および大
きさに基づいて除去する二段階方法にて抗体を精製した。段階１はトリスホウ酸
塩バッファー（ｐＨ８．０）の使用を含む。このｐＨで標的抗体は第１間隙容量
中に留まるが、２５０Ｖを用いると混合蛋白は３００ｋＤａの孔径分離膜を通る
生成物の流れに変わり、そこでコンタミナントを一定間隔で集めて収穫した。組
換え蛋白は処理された第１間隙容量に留まった。段階１を９０分間行った。 段階２はＧＡＢＡ（ガンマアミノ酪酸２４ｍＭ、酢酸１３３ｍＭ）を用いてｐ
Ｈ４．２にバッファーを変更することを含み、標的蛋白（組換えモノクローナル
抗体）を正に荷電させた。ついで、２５０Ｖの逆極性を用いて抗体を処理された
第１間隙容量から下流に移し、一定間隔で集めて収穫した。段階２を１８０分間
行った。 標的組換えモノクローナル抗体を二段階方法にてＣＨＯ培地から精製した。生
成物の純度を図５に示されるような還元性ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて分析した。
イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の特徴的な重鎖および軽鎖が明瞭であり、純度は
９５％より大きいことと推定された。クマシー染色法を用いて極微量のコンタミ
ネーションを観察した。 生成物の回収率をＯＤ２８０ｎｍを読み取ることで測定し、開始材料の８７％
であると算定された。開始濃度をBehring BN 100比濁計をＤＡＤＥ Behring IgG
比濁計試薬と組み合わせて用いて測定した。製造業者の指示に従ってアッセイを
行った。 組換えモノクローナル抗体を、開始生成物の８７％回収率にて、二段階単離方
法によりＣＨＯ培地から精製した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析に基づいて純度は９５
％より大きいと推定された。
【００３５】
実施例２−ペリジリン−クロロフィル蛋白（ＰＣＰ）
封入体としてのエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）にてＰＣＰ（ペリジ
ニンクロロフィル蛋白）を組換え蛋白として発現させ、それを収穫し、本発明の
方法に用いるのに適する電気泳動性分離装置に用いるのに備えて熱トリス−塩酸
に溶かした。 組換えＰＣＰ蛋白を二段階分離にて精製した。第１段階は全蛋白を同時に濃縮
し、それらが存在するバッファー環境を変えた。第２段階はその大きさに基づい
てＰＣＰ蛋白を精製した。 段階１において、最低限５ｍｇの全蛋白を含有する、溶解させたＰＣＰ封入体
試料を、電気泳動性分離装置の上流に置いた。段階１に利用したバッファーは、
４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホ
ン酸）と２８ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）とを含む。この７．５のｐＨで、溶解
させた封入体試料中のＰＣＰおよび他の蛋白は、５００ｍＡの定常電流で、１０
００ｋＤａ孔径分離膜を通る小容量の生成物の流れに変化した。その生成物の流
れを９０分の段階１の終わりに収穫した。生成物の流れは小容量の封入体試料お
よびＨＥＰＥＳ／トリスバッファー（ｐＨ７．５）中に存在する蛋白の大部分を
含有した。 収穫した段階１の生成物の流れを電気泳動性分離装置の上流に置いた。段階２
は大きさを基礎とする方法を用いて混合蛋白からＰＣＰを分離することを含む。
ＰＣＰ蛋白は３２ｋＤａの大きさである。段階２に利用したバッファーは段階１
に利用したバッファー：４０ｍＭ ＨＥＰＥＳと２８ｍＭのトリス（ｐＨ７．５
）と同じであった。ＰＣＰ蛋白は５０ｋＤａ孔径分離膜を通って移動し、生成物
の流れに保持される。高分子量の混合蛋白は５０ｋＤａ孔径分離膜を通過せず、
上流に保持された。ＰＣＰよりも小さな混合蛋白は５０ｋＤａ孔径分離膜を、さ
らに２０ｋＤａ孔径の下部（陽極／正極）制限膜を通って、循環性バッファー流
となる。上部（陰極／負極）制限膜の孔径は５ｋＤａであり、小さな混合蛋白が
上流および生成物の流れから再び侵入することを防止する。ＰＣＰ蛋白を１２０
分の段階２の終わりに生成物の流れから収穫した。
ニンクロロフィル蛋白）を組換え蛋白として発現させ、それを収穫し、本発明の
方法に用いるのに適する電気泳動性分離装置に用いるのに備えて熱トリス−塩酸
に溶かした。 組換えＰＣＰ蛋白を二段階分離にて精製した。第１段階は全蛋白を同時に濃縮
し、それらが存在するバッファー環境を変えた。第２段階はその大きさに基づい
てＰＣＰ蛋白を精製した。 段階１において、最低限５ｍｇの全蛋白を含有する、溶解させたＰＣＰ封入体
試料を、電気泳動性分離装置の上流に置いた。段階１に利用したバッファーは、
４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホ
ン酸）と２８ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）とを含む。この７．５のｐＨで、溶解
させた封入体試料中のＰＣＰおよび他の蛋白は、５００ｍＡの定常電流で、１０
００ｋＤａ孔径分離膜を通る小容量の生成物の流れに変化した。その生成物の流
れを９０分の段階１の終わりに収穫した。生成物の流れは小容量の封入体試料お
よびＨＥＰＥＳ／トリスバッファー（ｐＨ７．５）中に存在する蛋白の大部分を
含有した。 収穫した段階１の生成物の流れを電気泳動性分離装置の上流に置いた。段階２
は大きさを基礎とする方法を用いて混合蛋白からＰＣＰを分離することを含む。
ＰＣＰ蛋白は３２ｋＤａの大きさである。段階２に利用したバッファーは段階１
に利用したバッファー：４０ｍＭ ＨＥＰＥＳと２８ｍＭのトリス（ｐＨ７．５
）と同じであった。ＰＣＰ蛋白は５０ｋＤａ孔径分離膜を通って移動し、生成物
の流れに保持される。高分子量の混合蛋白は５０ｋＤａ孔径分離膜を通過せず、
上流に保持された。ＰＣＰよりも小さな混合蛋白は５０ｋＤａ孔径分離膜を、さ
らに２０ｋＤａ孔径の下部（陽極／正極）制限膜を通って、循環性バッファー流
となる。上部（陰極／負極）制限膜の孔径は５ｋＤａであり、小さな混合蛋白が
上流および生成物の流れから再び侵入することを防止する。ＰＣＰ蛋白を１２０
分の段階２の終わりに生成物の流れから収穫した。
【００３６】
ＰＣＰを二段階方法を用いて溶解させたイー・コリ封入体試料から分離した。
収穫したＰＣＰの純度を非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６および７）のクマシー
および銀染色法を用いて測定した。ＰＣＰの純度は９０％より大きいと評価され
た。 蛋白回収率をビシンコニン酸蛋白アッセイを用いて評価した。イ・コリ封入体
中に６．８ｍｇの全蛋白がある場合、段階２の生成物の流れから収穫したＰＣＰ
試料は１．８ｍｇの蛋白を含有した。これは非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシ
ーおよび銀染色法を用いて最初の試料中に存在するＰＣＰの少なくとも８０％で
あると評価された。 封入体としてのイー・コリ中で発現される、組換えＰＣＰを二段階方法を用い
て精製した。回収されたＰＣＰ蛋白は開始材料中に存在するＰＣＰ蛋白の８０％
よりも多いと評価された。最終ＰＣＰ試料の純度は９０％よりも大きいと評価さ
れた。 広範囲に及ぶ本発明の精神および範囲から逸脱することなく、具体例に記載さ
れるように、本発明に対して種々の変形および修飾を行うことができる。したが
って、本発明の具体例は、あらゆる点において例示として考えるべきであり、限
定するものと解釈すべきではない。
収穫したＰＣＰの純度を非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６および７）のクマシー
および銀染色法を用いて測定した。ＰＣＰの純度は９０％より大きいと評価され
た。 蛋白回収率をビシンコニン酸蛋白アッセイを用いて評価した。イ・コリ封入体
中に６．８ｍｇの全蛋白がある場合、段階２の生成物の流れから収穫したＰＣＰ
試料は１．８ｍｇの蛋白を含有した。これは非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシ
ーおよび銀染色法を用いて最初の試料中に存在するＰＣＰの少なくとも８０％で
あると評価された。 封入体としてのイー・コリ中で発現される、組換えＰＣＰを二段階方法を用い
て精製した。回収されたＰＣＰ蛋白は開始材料中に存在するＰＣＰ蛋白の８０％
よりも多いと評価された。最終ＰＣＰ試料の純度は９０％よりも大きいと評価さ
れた。 広範囲に及ぶ本発明の精神および範囲から逸脱することなく、具体例に記載さ
れるように、本発明に対して種々の変形および修飾を行うことができる。したが
って、本発明の具体例は、あらゆる点において例示として考えるべきであり、限
定するものと解釈すべきではない。
【図１】 本発明の方法を用いてアルブミンを分離する間に、バッファーの
流れの中に蛋白が段階的に蓄積されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
流れの中に蛋白が段階的に蓄積されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２】 本発明の方法を用いてアルブミンを分離する間に、バッファーの
流れの中に蛋白が段階的に蓄積されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
流れの中に蛋白が段階的に蓄積されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３】 アルブミンを分離する間にバッファーの流れ中に存在する蛋白の
量およびバッファー再生法を用いて取り出された蛋白の量を示す、シプロ・ルビ
ー（バイオラッド）で染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
量およびバッファー再生法を用いて取り出された蛋白の量を示す、シプロ・ルビ
ー（バイオラッド）で染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図４】 オンラインバッファー再利用スキームの模式図を示す。
【図５】 本発明により分離される組換えモノクローナル抗体の減少ＳＤＳ
ＰＡＧＥゲル（８〜１８％勾配）分析を示す。
【図６】 ５０ｋＤａ分離のクーマシー染色非減少ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す
。
。
【図７】 ５０ｋＤａ分離の銀染色を示す。
【図８】 本発明の分離システムまたは装置の好ましい具体例の模式図を示
す。
す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 1/10 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｄ
３１５Ｇ
３１５Ｆ
３０１Ｃ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 アンドリュー・マーク・ギルバート
オーストラリア2122ニュー・サウス・ウェ
ールズ州イーストウッド、ビミエラ・ロー
ド62番
(72)発明者 ハリ・ネアー
オーストラリア2154ニュー・サウス・ウェ
ールズ州キャッスル・ヒル、コンバラ・ア
ベニュー１番
(72)発明者 ルーシー・ジェーン・ライアン
オーストラリア2153ニュー・サウス・ウェ
ールズ州ボーカム・ヒルズ、グレビリー・
グローブ18番
(72)発明者 デニス・ブライアン・ライラット
オーストラリア2112ニュー・サウス・ウェ
ールズ州ライド、スチュアート・ストリー
ト10番
(72)発明者 テレサ・マリー・トーマス
オーストラリア2762ニュー・サウス・ウェ
ールズ州スコフィールズ、ドンゴラ・サー
キット92番
Ｆターム(参考） 2G052 AA28 AA30 AB18 AB20 AD26
DA05 EA03 EB13 ED04 FD02
JA07 JA11
4D054 FA10 FB20
4H045 AA10 AA20 CA11 CA40 DA76
FA74 GA10 GA30 HA07
Claims (30)
- 【請求項１】 電気泳動性分離によりマクロ分子を分離するためのシステム
であって、 （ａ）第１陰極区分にある第１陰極と； （ｂ）第１陽極区分にある第１陽極であって、その第１陰極と第１陽極の間に電
位を加えると、その間にある第１電場領域に第１電場を発生させるのに適合する
ように第１陰極に対して相対的に配置される陽極と； （ｃ）第１陰極区分と第１陽極区分に配置される第１電気泳動性バッファーと；
（ｄ）第１電場領域に配置される所定の分子量カットオフを有する第１分離膜と
； （ｅ）第１間隙容量を限定するために、第１陰極区分と第１分離膜の間に配置さ
れる第１制限膜と； （ｆ）第２間隙容量を限定するために、第１陽極区分と第１分離膜の間に配置さ
れる第２制限膜と； （ｇ）試料成分を第１間隙容量と第２間隙容量の選択された一つにて提供するの
に適合した手段であって、第１電位を加えると、選択された分離生成物が第１分
離膜を通って試料成分から取り出され、第１および第２間隙容量の他方に提供さ
れる手段と； （ｈ）第２陰極を含有していてもよい第２陰極区分と； （ｉ）第２陽極を含有していてもよい第２陽極区分であって、任意の第２陰極と
任意の第２陽極の間に任意の第２電位を加えると、その間に第２電場領域を形成
する、第２陰極区分に対して相対的に配置された第２陽極区分と； （ｊ）第２陰極区分と第２陽極区分に配置される第２電気泳動性バッファーと；
（ｋ）第２電場領域に配置される所定の分子量カットオフを有する第２分離膜と
； （ｌ）第３間隙容量を限定するために、第２陰極区分と第２分離膜の間に配置さ
れる第３制限膜と； （ｍ）第４間隙容量を限定するために、第２陽極区分と第２分離膜の間に配置さ
れる第４制限膜と； （ｎ）第１電気泳動性バッファーを第３および第４間隙容量の選択された一の容
量にて提供するのに適合した手段であって、選択された分離生成物が第２分離膜
を通って第１電気泳動性バッファーから取り出され、第３および第４間隙容量の
他方に提供され、実質的に第１電気泳動性バッファーが第３および第４間隙容量
に入ることを妨げる手段と； （ｏ）選択された分離生成物を第１電気泳動性バッファーから取り出した後、第
１電気泳動性バッファーを第１間隙容量ならびに第１陰極および陽極区分の選択
された一つに提供するのに適合した手段と からなる、マクロ分子を分離するためのシステム。 - 【請求項２】 第２陰極、第２陰極区分、第２陽極、第２陽極区分および第
２電気泳動性バッファーがセカンダリー分離システムにて隣接して配置されてい
る、請求項１記載の電気泳動性分離によりマクロ分子を分離するためのシステム
。 - 【請求項３】 イオン透過性分離膜がポリアクリルアミドからなり、約１な
いし約１５００ｋＤａの分子量カットオフを有する、請求項１または２記載のシ
ステム。 - 【請求項４】 第１および第２制限膜がポリアクリルアミドからなり、第１
分離膜よりも小さな分子量カットオフを有する、請求項１ないし３のいずれか１
つに記載のシステム。 - 【請求項５】 制限膜が約１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量カットオ
フを有する、請求項４記載のシステム。 - 【請求項６】 制限膜が約５ｋＤａの分子量カットオフを有する、請求項５
記載のシステム。 - 【請求項７】 第１および第２間隙容量が、第１上流および下流間隙容量を
形成する第１陰極区分と第１陽極区分の間に位置するカートリッジとして提供さ
れる、請求項１ないし６のいずれか１つに記載のシステム。 - 【請求項８】 第３および第４間隙容量が、第２上流および下流間隙容量を
形成する第２陰極区分と第２陽極区分の間に位置するカートリッジとして提供さ
れる、請求項１ないし７のいずれか１つに記載のシステム。 - 【請求項９】 小さなマクロ分子を試料成分から取り出す方法であって、 （ａ）本発明の第１の態様に係る電気泳動性装置を準備し； （ｂ）試料成分を第１間隙容量に加え； （ｃ）第１および第２間隙容量の間に第１電位を加え、ここで第１電位が加えら
れると、選択される分離生成物が第１分離膜を通って試料成分から取り出され、
第１および第２間隙容量の他方および第１電気泳動性バッファーに提供され； （ｄ）小さなマクロ分子を含有する第１電気泳動性バッファーを第３および第４
間隙容量の選択された一方に移し； （ｅ）小さなマクロ分子のコンタミタントが第２イオン透過性分離膜を通って第
３および第４間隙容量の他方に移るが、実質的にバッファーがかかる間隙容量に
入ることを妨げ； （ｆ）第３および第４間隙容量の間に第２電位を加え、工程（ｅ）を補助しても
よく； （ｇ）選択された分離生成物が第１電気泳動性バッファーから取り出された後に
、第１電気泳動性バッファーを第１陰極および陽極区分の選択された一方に戻す
ことを含む、試料成分から小さなマクロ分子を取り出す方法。 - 【請求項１０】 さらに、 （ｈ）第１および第２間隙容量の間の電位を定期的に停止かつ反転させ、第１イ
オン透過性分離膜に侵入した、試料成分より取り出されるべき小さなマクロ分子
以外のいずれのマクロ分子も移動させ、試料成分を配置した第１および第２間隙
容量の一つに戻し、第１および第２間隙容量の他方に侵入した、いずれの小さな
マクロ分子または他のマクロ分子も第１および第２間隙容量の他方に再び侵入さ
せない、ことを含む請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 試料成分が第１イオン透過性分離膜により大きさおよび電
荷で第１および第２間隙容量の他方に分離される他のマクロ分子を含む、請求項
９および１０の方法。 - 【請求項１２】 試料成分が、血漿を含む血液由来の生成物、抗体試料、蛋
白、ペプチド、糖蛋白、オリゴヌクレオチド、組換え蛋白、細胞抽出物、細胞培
養清澄物、成長因子、抗原、免疫原およびそれらの組み合わせからなる群より選
択される、請求項９ないし１１のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項１３】 小さなマクロ分子が、ペプチド、蛋白フラグメントおよび
他の小さな分子量の異物からなる群より選択される、請求項９ないし１２のいず
れか１つに記載の方法。 - 【請求項１４】 小さなマクロ分子が、約５００Ｄａないし約１００ｋＤａ
の分子量を有する、請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 小さなマクロ分子が工程（ｃ）の第１イオン透過性分離膜
および／または第１制限膜を通って移動する、請求項９ないし１４のいずれか１
つに記載の方法。 - 【請求項１６】 イオン透過性膜がポリアクリルアミドからなる電気泳動性
分離膜であり、約１ｋＤａないし約１５００ｋＤａの分子量カットオフを有する
、請求項９ないし１５のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項１７】 制限膜がポリアクリルアミドからなり、分離膜より小さい
分子量カットオフを有する請求項９ないし１６のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１８】 制限膜が約１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量カット
オフを有する請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 制限膜が約５ｋＤａの分子量カットオフを有する請求項１
８記載の方法。 - 【請求項２０】 約２５０Ｖの電位および約５００ｍＡの電流を加える請求
項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 請求項９ないし２０のいずれか１項記載の方法により生成
される組換え蛋白。 - 【請求項２２】 開始試料成分から少なくとも約７０％の純度かつ少なくと
も約７０％の回収率で得られる請求項２１記載の組換え蛋白。 - 【請求項２３】 開始試料成分から少なくとも約８０％の純度で得られる請
求項２２記載の組換え蛋白。 - 【請求項２４】 開始試料成分から少なくとも約９０％の純度で得られる請
求項２３記載の組換え蛋白。 - 【請求項２５】 化合物の混合物から組換え蛋白を分離する方法であって、 （ａ）第１間隙容量および第２間隙容量の選択された一つに上記した混合物を入
れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも小さいか、または大き
い分子量カットオフを有するイオン透過性分離膜で分離されており、その第１お
よび第２間隙容量は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移
動を可能とするが、組換え蛋白の移動を妨げるように形成されたイオン透過性制
限膜により電気泳動性バッファーの流れから分離されており；その間隙容量は陰
極区分にある陰極と陽極区分にある陽極の間に位置付けられ、陰極と陽極の間に
電位を加えると、その間の電場領域に電場が発生するのに適合するように陰極に
対して相対的に陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように一のｐ
Ｈを有する第１間隙および第２間隙容量の選択された一つのための溶媒を選択し
； （ｃ）第１間隙および第２間隙容量の間に電位を加え、ここで電位を加えると、
混合物中の選択された化合物または組換え蛋白は、第１分離膜を通って移動し、
第１間隙および第２間隙容量の他方に提供され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、分離膜に入った選択された化合物ま
たは組換え蛋白を動かし、選択された化合物または組換え蛋白が取り出された間
隙容量に戻してもよいが、実質的に第１間隙容量および第２間隙容量の他方に提
供された選択された化合物または組換え蛋白はそのような選択された化合物また
は組換え蛋白が取り出された間隙容量に再び入ることはなく；および （ｅ）組換え蛋白が開始混合物から少なくとも約７０％の純度および少なくとも
約７０％の回収率で得られるまで、工程（ｃ）および任意の工程（ｄ）を維持す
る； ことを含む、組換え蛋白の分離方法。 - 【請求項２６】 化合物の混合物から組換え蛋白を分離する方法であって
、 （ａ）第１間隙容量および第２間隙容量の選択された一つに上記した混合物を入
れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも小さい分子量カットオ
フを有するイオン透過性分離膜で分離されており、その第１および第２間隙容量
は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とするよ
うに形成されたイオン透過性制限膜により電気泳動性バッファーの流れから分離
されており、その間隙容量は陰極区分にある陰極と陽極区分にある陽極の間に位
置付けられ、陰極と陽極の間に電位を加えると、その間の電場領域に電場が発生
するのに適合するように陰極に対して相対的に陽極を配置し； （ｂ）組換え蛋白のｐＩよりも大きなｐＨを有する第１間隙および第２間隙容量
の選択された一つに適する溶媒を選択し； （ｃ）第１間隙および第２間隙容量の間に電位を加え、ここで電位を加えると、
組換え蛋白は分離膜を通って混合物から取り出され、第１間隙および第２間隙容
量の他方に提供され、残りの化合物は実質的に組換え蛋白が取り出された間隙容
量に保持されるか、または分離膜に入っているならば、その分離膜を通過するこ
とが実質的に防止され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、分離膜に入った選択された化合物ま
たは組換え蛋白を動かし、選択された化合物または組換え蛋白が取り出された間
隙容量に戻してもよいが、実質的に第１間隙容量および第２間隙容量の他方に提
供された選択された化合物または組換え蛋白はそのような選択された化合物また
は組換え蛋白が取り出された間隙容量に再び入ることはなく；および （ｅ）組換え蛋白が開始混合物から少なくとも約７０％の純度および少なくとも
約７０％の回収率で得られるまで、工程（ｃ）および任意の工程（ｄ）を維持す
る； ことを含む、組換え蛋白の分離方法。 - 【請求項２７】 化合物の混合物から組換え蛋白を分離する方法であって
、 （ａ）第１間隙容量および第２間隙容量の選択された一つに上記した混合物を入
れ、ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも小さい分子量カットオ
フを有する第１イオン透過性分離膜で分離されており、その第１および第２間隙
容量は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とす
るように形成された第１および第２イオン透過性制限膜により第１電気泳動性バ
ッファーの流れから分離されており、その第１および第２間隙容量は第１陰極区
分にある第１陰極と第１陽極区分にある第１陽極の間に位置付けられ、第１陰極
と第１陽極の間に電位を加えると、その間の第１電場領域に電場が発生するのに
適合するように第１陰極に対して相対的に第１陽極を配置し； （ｂ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第１間隙および第２間隙容量の選択された一つに適する溶媒を選択
し； （ｃ）第１間隙および第２間隙容量の間に第１電位を加え、ここで第１電位を加
えると、組換え蛋白よりも小さな分子量を有する混合物中の選択された化合物は
第１分離膜を通って混合物から取り出され、第１間隙および第２間隙容量の他方
に提供され、組換え蛋白は実質的に選択された化合物が取り出された間隙容量に
保持されるか、または第１分離膜に入っているならば、その第１分離膜を通過す
ることが実質的に防止され； （ｄ）第１電位を定期的に止めて反転させ、第１分離膜に入った組換え蛋白を動
かし、選択された化合物が取り出された間隙容量に戻してもよいが、実質的に第
１間隙容量および第２間隙容量の他方に提供された選択された化合物はそのよう
な選択された化合物が取り出された間隙容量に再び入ることはなく； （ｅ）望ましい量の選択された化合物が混合物から取り出されるまで、工程（ｃ
）および任意の工程（ｄ）を維持し； （ｆ）第３間隙容量および第４間隙容量の選択された一つにその混合物を入れ、
ここでこれらの間隙容量は組換え蛋白の分子量よりも大きい分子量カットオフを
有する第２イオン透過性分離膜で分離されており、その第３および第４間隙容量
は、電位を加えている間、イオンおよび小さなマクロ分子の移動を可能とするよ
うに形成された第３および第４イオン透過性制限膜により第２電気泳動性バッフ
ァーの流れから分離されており、その第３および第４間隙容量は第２陰極区分に
ある第２陰極と第２陽極区分にある第２陽極の間に位置付けられ、第２陰極と第
２陽極の間に電位を加えると、その間の第２電場領域に電場が発生するのに適合
するように第２陰極に対して相対的に第２陽極を配置し； （ｇ）試料中の組換え蛋白または他の化合物が所望の電荷を有するように、一の
ｐＨを有する第３間隙および第４間隙容量の選択された一つに適する溶媒を選択
し； （ｈ）第３間隙および第４間隙容量の間に第２電位を加え、ここで第２電位を加
えると、組換え蛋白は第２分離膜を通って混合物から取り出され、第３間隙およ
び第４間隙容量の他方に提供され、残りの化合物は実質的に組換え蛋白が取り出
された間隙容量に保持されるか、または第２分離膜に入っているならば、その第
２分離膜を通過することが実質的に防止され； （ｉ）第２電位を定期的に止めて反転させ、第２分離膜に入った残りの化合物を
動かし、組換え蛋白が取り出された間隙容量に戻してもよいが、実質的に第３間
隙容量および第４間隙容量の他方に提供された組換え蛋白はそのような組換え蛋
白が取り出された間隙容量に再び入ることはなく； （ｊ）望ましい量の組換え蛋白が混合物から取り出されるまで、工程（ｈ）およ
び任意の工程（ｉ）を維持し、ここで組換え蛋白は開始混合物から少なくとも７
０％の純度で、少なくとも７０％の回収率で得られる； ことを含む、組換え蛋白の分離方法。 - 【請求項２８】 イオン透過性分離膜が約４０ｋＤａと約１０００ｋＤａ
の分子量カットオフを有する電気泳動性分離膜である、請求項２７記載の方法。 - 【請求項２９】 バッファーが、トリスホウ酸塩、ガンマアミノ酪酸およ
びその組み合わせからなる群より選択され、約９．０のｐＨを有する、請求項２
７記載の方法。 - 【請求項３０】 バッファー濃度が約２００ｍＭまでである、請求項３３
記載の方法。
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