JP2002517407A - 抗体の精製 - Google Patents

抗体の精製

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JP2002517407A JP2000552147A JP2000552147A JP2002517407A JP 2002517407 A JP2002517407 A JP 2002517407A JP 2000552147 A JP2000552147 A JP 2000552147A JP 2000552147 A JP2000552147 A JP 2000552147A JP 2002517407 A JP2002517407 A JP 2002517407A
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シャロン・リム
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Abstract

(57)【要約】 抗体および少なくとも１種の汚染物質の混合物から抗体を分離する方法であって、該方法は：ａ）抗体および汚染物質混合物を第１の溶媒流中に置き、第１の溶媒流は電気泳動膜によって第２の溶媒流から分離されており；ｂ）分離されるべき抗体よりも低い等電点（ｐＩ）を有する汚染物質が荷電されるように第１の溶媒流についてｐＨを選択し；ｃ）２つの溶媒流間に電位を加え、抗体を実質的に第１の溶媒流中に保持しつつ、または膜に侵入したら、実質的に第２の溶媒流中に侵入することを妨げつつ、膜を通じて第２の溶媒流中への少なくともいくつかの汚染物質の移動を引き起こし；ｄ）所望により、電位を定期的に停止および逆転させて、膜に侵入したいずれもの抗体の第１の溶媒流中への逆戻りを起こさせ、このとき、第２の溶媒流中に侵入したいずれもの汚染物質の実質的な第１の溶媒流中への再侵入を起こさせず；ｅ）第１の溶媒流が所望の抗体純度を含有するまで、工程ｃ）および所望により、工程ｄ）を繰り返すことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明は、抗体、特にモノクローナル抗体の腹水液からの精製に適する方法に
関する。
【０００２】 背景分野 複合生物学的溶液のプロセッシングは、バイオテクノロジー産業において主要
な障害であり、天然および組換えタンパク質の精製に関する費用に対して最も効
率のよい技術に対する強い要求がある。これは、特にモノクローナル抗体を包含
する抗体に当てはまり、単純で総称的な精製方法を探求している途中である。特
に、モノクローナル抗体は、１９７５年に最初に生産されて以来、多くの研究、
治療および診断的応用がなされてきた。バイオプロセッシングにおける難点は、
現存の精製スキームにおけるモノクローナル抗体の回収がまれに報告されるが、
しばしば、１０〜７０％の範囲であるということであった。新規な方法は、収率
および回収という点で益々効果的になってきたが、一般に使用される方法は、し
ばしば、溶出のために過酷なｐＨまたはイオン強度条件を利用するものであり、
必ずしも、抗体の最大生物学的活性の維持に適合するものとはかぎらない。
【０００３】 本発明者らは、Gradiflow技術（ＡＵ６０１０４０）を用いる分取電気泳動が
抗体の精製に特に適当であることを見出した。従来の方法とは対照的に、Gradif
lowは穏かな非変性バッファーおよび条件を用い、より活性な抗体調製物を生産
するために利用されうる。
【０００４】 発明の開示 第１の態様において、本発明は、 （ａ）抗体および汚染物質混合物を第１の溶媒流中に置き、第１の溶媒流は電
気泳動膜によって第２の溶媒流から分離されており； （ｂ）分離されるべき抗体よりも低い等電点（ｐＩ）を有する汚染物質が荷電
されるように第１の溶媒流についてｐＨを選択し； （ｃ）２つの溶媒流間に電位を加え、抗体を実質的に第１の溶媒流中に保持し
つつ、または膜に侵入したら、実質的に第２の溶媒流中に侵入することを妨げつ
つ、膜を通じて第２の溶媒流中への少なくともいくつかの汚染物質の移動を引き
起こし； （ｄ）所望により、電位を定期的に停止および逆転させて、膜に侵入したいず
れもの抗体の第１の溶媒流中への逆戻りを起こさせ、このとき、第２の溶媒流中
に侵入したいずれもの汚染物質の実質的な第１の溶媒流中への再侵入を起こさせ
ず； （ｅ）第１の溶媒流が所望の抗体純度を含有するまで、工程（ｃ）および所望
により、工程（ｄ）を繰り返すことを特徴とする抗体および少なくとも１種の汚
染物質の混合物から抗体を分離する方法よりなる。
【０００５】 好ましくは、抗体および汚染物質混合物は、腹水液中のモノクローナル抗体で
ある。 本発明の第１の態様の好ましい具体例において、電気泳動膜は、約５０〜１５
０ｋＤａ、好ましくは約１００ｋＤａの分子量カットオフを有する。分離される
べき抗体のｐＩは、通常、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）によって得られる。第１
の溶媒流のｐＨは、好ましくは、約７．５〜９．５である。ｐＩが４．９である
ことがよく知られているアルブミンを包含する主要なタンパク質汚染物質は、ｐ
Ｈ８．３にて第２の溶媒流中へ移動させることによって、抗体から分離できる。
【０００６】 第２の態様において、本発明は、 （ａ）分離した抗体を第１の溶媒流中に置き、第１の溶媒流は電気泳動膜によ
って第２の溶媒流から分離されており； （ｂ）抗体のｐＩの１ｐＨ単位内にあるように第１の溶媒流のｐＨを選択し； （ｃ）２つの溶媒流間に電位を加え、抗体を実質的に第１の溶媒流中に保持し
つつ、または膜に侵入したら、実質的に第２の溶媒流中に侵入することを妨げつ
つ、膜を通じて第２の溶媒流中への少なくともいくつかの汚染物質の移動を引き
起こし； （ｄ）所望により、電位を定期的に停止および逆転させて、膜に侵入したいず
れもの抗体の第１の溶媒流中への逆戻りを起こさせ、このとき、第２の溶媒流中
に侵入したいずれもの汚染物質の実質的な第１の溶媒流中への再侵入を起こさせ
ず； （ｅ）第１の溶媒流が所望の抗体純度を含有するまで、工程（ｃ）および所望
により、工程（ｄ）を繰り返すことを特徴とする抗体および少なくとも１種の汚
染物質の混合物から抗体を分離する方法よりなる。
【０００７】 工程（ａ）における電気泳動膜は、好ましくは、汚染物質が確実に第２の溶媒
流へ通過できるように、少なくとも約２００ｋＤａの分子量カットオフを有する
。大きな１０００ｋＤａ孔サイズ分離膜を含有するカートリッジが、本発明の該
態様に特に適当であることがわかった。工程（ｂ）におけるｐＨは、典型的には
、約６〜８．０である。バッファーのｐＨが、精製されるべき抗体のｐＩおよび
汚染物質のｐＩに依存することは明らかであろう。
【０００８】 工程（ｂ）において使用されるバッファーのｐＨは、分離されるべき抗体のｐ
Ｉより上または下であることができる。好ましくは、ｐＨは抗体のｐＩの０．５
ｐＨ単位内である。
【０００９】 第３の態様において、本発明は、 （ａ−ｅ）本発明の第１の態様に記載のように抗体を分離し； （ｆ）分離した抗体を新しい第１の溶媒流中に置き、第１の溶媒流は電気泳動
膜によって第２の溶媒流から分離されており； （ｇ）抗体のｐＩの１ｐＨ単位内にあるように新しい第１の溶媒流のｐＨを選
択し； （ｈ）２つの溶媒流間に電位を加え、抗体を実質的に新しい第１の溶媒流中に
保持しつつ、または膜に侵入したら、実質的に第２の溶媒流中に侵入することを
妨げつつ、膜を通じて第２の溶媒流中への少なくともいくつかの汚染物質の移動
を引き起こし； （ｉ）所望により、電位を定期的に停止および逆転させて、膜に侵入したいず
れもの抗体の第１の溶媒流中への逆戻りを起こさせ、このとき、第２の溶媒流中
に侵入したいずれもの汚染物質の実質的な第１の溶媒流中への再侵入を起こさせ
ず； （ｊ）新しい第１の溶媒流が所望の抗体純度を含有するまで、工程（ｈ）およ
び所望により、工程（ｉ）を繰り返すことを特徴とする抗体および少なくとも１
種の汚染物質の混合物から抗体を分離する方法よりなる。
【００１０】 工程（ｆ）において使用される電気泳動膜の分子量カットオフは、好ましくは
、工程（ｂ）において使用される膜よりも大きい。工程（ｆ）における電気泳動
膜は、汚染物質が確実に第２の溶媒流に通過できるように、好ましくは、少なく
とも約２００ｋＤａの分子量カットオフを有する。大きい１０００ｋＤａ孔サイ
ズ分離膜を含有するカートリッジが本発明の該態様に特に適当であることがわか
った。工程（ｇ）におけるｐＨは、典型的には、約６〜８．０である。バッファ
ーのｐＨが精製されるべき抗体のｐＩおよび汚染物質のｐＩに依存することは明
らかであろう。
【００１１】 工程（ｇ）において使用されるバッファーのｐＨは、分離されるべき抗体のｐ
Ｉより上または下であることができる。好ましくは、ｐＨは、抗体のｐＩの０．
５ｐＨ単位内にある。 本発明者らは、本発明の方法を用いて、少なくとも７０％、しばしば９０％以
上の腹水液由来のモノクローナル抗体の回収パーセントを得ることができた。
【００１２】 第４の態様において、本発明は、抗体の精製および／または分離におけるGrad
iflowの使用よりなる。 第５の態様において、本発明は、本発明の第１、第２または第３の態様の方法
によって精製された抗体よりなる。
【００１３】 本明細書を通して、文脈が別法を要求しないかぎり、「を特徴とする」なる語
は、記載された要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群を含
むことを意味するが、いずれか他の要素、整数または工程、あるいは要素、整数
または工程の群を排除するのではないと理解される。 本発明がより明白に理解されうるように、好ましい形態を下記の実施例におい
て、付随する図面に言及して記載する。
【００１４】 本発明の実施の形態 実験 抗体 本研究で使用した抗体は、全て、従来の手順（Bundesenら、1985）によって得
られ、ネズミ腹水液としてアゲン・バイオメディカル・ブリスベン（Agen Biome
dical Brisbane, Australia）によってグラディポア・リミテッド（Gradipore L
imited）に供給された。
【００１５】
【表１】 ａ １段階精製を示す ｂ ２段階精製を示す
【００１６】 Gradiflow技術 Gradiflowの分離カートリッジは、一連のポリアクリルアミドに基づく制限お
よび分離膜を含有し、サイズおよび電荷に基づいて巨大分子の分離を可能にする
（図１を参照）。カートリッジの範囲は、２５，０００〜１，０００，０００の
範囲のＭｒカットオフで利用できる。一連のｐＨにわたってタンパク質を分別で
きる能力および種々の孔サイズの膜の使用は、そのサイズまたは等電点によって
、いずれかの標的タンパク質を分離することを可能にする。
【００１７】 Model LM1000（Gradipore Limited, Sydney, Australia）は、蠕動ポンプ、ペ
ルティエ冷却器および電力供給を含有する。それは、ウィンドウズ９５およびLa
b Viewファーマット下でパーソナルコンピューターによって制御される。別法で
は、手動で設定される装置も利用でき、それは、従来の蠕動ポンプおよび電力供
給で作動できる（Margolisら、1995; Corthalsら、1996; Horvathら、1996; Cor
thalsら、1997）。
【００１８】 分離様式 サイズに基づく分離（図１ａ） サイズ分離のために、全てのタンパク質が同じ電荷（この場合、負）を有する
ｐＨを選択する。したがって、「上流」コンパートメント中を循環する混合物由
来のタンパク質の全てが「下流」コンパートメント中に移動しようとする。制限
孔サイズの膜が選択される場合、例えば、この場合Ｍｒ１００，０００が使用さ
れるが、Ｍｒ１００，０００より大きい分子（例えば、標的の抗体）は、膜の向
こう側へ移動できず、上流に残留する。マウス腹水液中の本質的に全てのタンパ
ク質はｐＨ７．７より小さいｐＩ値を有するので、該明細書においてはサイズ分
離にｐＨ８．３が選択された。これらの条件下で大部分の腹水タンパク質は「下
流」に移動し、後にＭｒ１６０，０００の抗体分子を残す。
【００１９】 電荷に基づく分離（図１ｂ） 電荷に基づく分離のために、１のタンパク質が正の電荷を有し、他方が負の電
荷を有するように、２つのタンパク質の等電点の間のｐＨを選択する。該例にお
いて、タンパク質混合物は「上流」コンパートメント中を連続的に循環する。電
流を流すと、負に荷電したタンパク質は膜を通って「下流」コンパートメントに
移動する。上流および下流コンパートメントの連続的循環は、２つのタンパク質
の分離を完了させる。
【００２０】 ネズミ腹水液中の大量の非抗体タンパク質は、ｐＨ６．５より小さい等電点を
有するので、ｐＨ６．５より大きいｐＨで、これらのタンパク質は負に荷電し、
下流に移動し、通常ｐＨ６．６以上のｐＩを有する抗体を後に残す。電荷分離の
場合、通常、膜の向こう側へ最大限の輸送を可能にするために、大きい孔サイズ
を有する膜（Ｍｒ１ｘ１０6）を使用する。
【００２１】 モノクローナル抗体の精製 腹水液の各試料（０．５−２ｍｌ）を少なくとも３容量の４０ｍＭ トリス−
ホウ酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するバッファー（ｐＨ８．３）で希釈した。
まず最初に、各試料のサイズ分離を該バッファー中で３０〜４０分間、２００Ｖ
にて、Ｍｒカットオフ１００，０００分離膜を用いて行った。これらの条件下で
、アルブミンおよび他の不純物は迅速に膜の向こう側へ移動し、後には精製され
た抗体が上流に残った。
【００２２】 より高純度のために、各特定の抗体のｐＩに近いｐＨを選択し、Ｍｒカットオ
フ１ｘ１０6膜を用いて、第２の工程を行った。例えば、４０ｍＭ トリスバッフ
ァーを酢酸を用いて所望のｐＨに調整できる。実施時間は２００Ｖで４０分であ
った。残留する不純物は膜を通って移動したが、抗体は上流に残留した。第１お
よび第２の工程の間中、１０分間隔で上流および下流の５０μｌアリコートを採
取することによって、次いで、標的抗体の純度を変性ドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決定した。回収
パーセントは、工程完了後に、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）によって決
定した。
【００２３】 上流および下流は４０分後に採収した。抗体を最大限に回収するために、分離
工程の最後に、逆電流で、少量（７ｍｌ）のランニングバッファーを上流および
下流中で１分間ポンピングした。電流逆転のスイッチを切った後、上流および下
流をさらに１分間循環させた後、上流の洗浄物を回収し、最初に得られた抗体と
合わせた。さらに１０−１５％の抗体が該洗浄工程で回収できる。
【００２４】 等電点電気泳動 Novex（San Diego CA, USA）ＩＥＦゲル装置を用いて、製造者による記載のと
おりに等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行うことによって、各抗体のｐＩを決定した
。簡単に言えば、実施条件は、１００Ｖで１時間、２００Ｖで１時間および５０
０Ｖで３０分間の実施時間であった。ＩＥＦゲルは、脱イオン水中における３．
５％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸（Sigma Product No S-3147）を含有する
１２％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（Sigma Product No T8657）の溶液で３０分間
固定された後、Gradipure（登録商標）クーマシー・ブルーで染色された。
【００２５】 抗体純度の決定 試料をGradipore４−２０％Ｔ ＳＤＳゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分
析した［Ｔ＝（ｇアクリルアミド＋ｇ Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド
）／１００ｍｌ溶液］。種々の時間での上流および下流のタンパク質バンドを比
較することによって、試料純度に対する経時的変化を決定した。
【００２６】 抗体回収率の決定 タンパク質濃度 ２８０ｎｍでの紫外線吸収を測定することによって、上流および下流のタンパ
ク質レベルを決定した。マウスモノクローナル抗体の１ｍｇ／ｍｌ溶液は、１．
２ＡＵの吸光度を有すると想定された。
【００２７】 エンザイムイムノアッセイ 抗原または非標識ヒツジ抗マウス免疫グロブリンのいずれかを捕獲成分として
用いる２部位ＥＩＡによって、抗体活性を決定した。まず、ミクロプレートをリ
ン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中の５０μｌの抗原（１０μｌ／ｍ
ｌ）またはウサギ抗マウス免疫グロブリン（１０μｌ／ｍｌ）Dako（Carpinteri
a, USA）のいずれかで、室温にて１時間被覆した。
【００２８】 プレートを逆さにし、軽くたたくことによって過剰の抗原を除去し、０．１％
Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔ）で３回、プレートを洗浄した
。次いで、試験下のモノクローナル画分の適当なＰＢＳ／Ｔ中希釈液５０μｌを
加え、インキュベーションを室温で１時間行った。洗浄によって非結合抗体を除
去後、結合した抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−標識化抗抗マ
ウス抗体の１／１０００希釈液の添加によって標識し、さらに１時間インキュベ
ートした。最後に、さらに洗浄した後、基質および停止溶液の添加によって結合
した抗体を検出した。
【００２９】 結果および考察 等電点電気泳動 ＩＥＦは、タンパク質をそれらのｐＩ値によって特徴付けることができる技術
であり、電荷に基づく分離のための最良の条件を決定するために用いることがで
きる。出発物質のＩＥＦゲルは、各腹水液が、標的抗体の複数のバンドの位置が
大きく相違する独特のＩＥＦパターンを有することを示した。
【００３０】 ＩＥＦゲルは、腹水液試料由来の４つの異なる抗体についてｐＩ６．６〜７．
７の範囲を示した。抗体のｐＩ値を表１に列挙する。電荷の不均一は複数の幅広
いピークおよびテーリング効果を生じるので、イソ型の多様性は、抗体について
従来のイオン交換プロトコール由来の低い回収率にもっともらしい理由を提供す
る。
【００３１】 マウス抗体の精製 サイズ分離 ＩＥＦ（図１）が個々の抗体の等電電荷における幅広い変化を示す場合、サイ
ズ排除が第１工程として選択された。Ｍｒ１６０，０００抗体を保持し、また、
より小さなタンパク質分子の迅速な通過を可能にするので、Ｍｒカットオフ１０
０，０００を有する膜が選択された。大量の免疫腹水液タンパク質が正味の負の
電荷を有するように、ｐＨ８．３が選択された。
【００３２】 抗体４の精製の時間推移を図２に示す。同様の結果が他の３つの抗体について
得られた。２０分後、試料流中で最も有意なバンドは、モノクローナル抗体の特
徴的なＨ鎖およびＬ鎖である。４０分で実質的に改善されることなく、３０分後
に許容される純度に達した（図２のレーン５）。マウス血清アルブミンが最も豊
富なより低分子量のタンパク質は、Ｍｒ１００，０００膜を迅速に通過し、抗体
が上流に残留した。下流を１０分毎に採収し、各々、その後の採収物中のタンパ
ク質量が低下することを示した（図２、レーン７−９）。不純物の大部分は、最
初の１０分で抗体から除去され（レーン７）、１０分および２０分で収集された
２つの最初の下流採収物中に大量のアルブミンが存在した。アルブミンは、１０
分後に上流から消失した。この最後の部分は、１０分の試料を採取したとき、１
０分の試料中において下流に見られる残りのアルブミンは、分離膜内を通過中で
あるとして解釈された。
【００３３】 これらの条件は、いずれかの抗体の高収量、高純度での精製を可能にする全般
的な第１工程を選択しようとするために、最初の分離について選択された。トリ
ス−ホウ酸塩バッファーは、多くの他の応用において、自然条件下での分離に有
用なバッファーであることが証明されていたので、該バッファーが選択された。
電圧は、３０分以内で工程を完了する目的で、必要な分離速度に基づいて選択さ
れた。ほとんどの応用の場合、電圧が高ければ高いほど、より迅速な精製が可能
になる。
【００３４】 いくつかの抗体は、室温で不安定であると考えられ、温度はタンパク質ホール
ディングに影響を及ぼし、より低温でタンパク質可変性を増加させるという多く
の報告がある。
【００３５】 電荷分離 各抗体のｐＩに近いｐＨで行われる電荷に基づく第２工程において、各抗体に
ついてより高純度が達成できる。等電点は多様であるので、これは、異なるｐＨ
が各抗体について選択されることを意味した。サイズまたは電荷のいずれかを用
いる分離の間に、各標的抗体の溶解性がそのｐＩよりも高いかまたはそのｐＩに
近いｐＨによって影響を及ぼされたという形跡はなかった。これらの作動条件お
よび使用されるバッファーの選択によって、タンパク質の溶解性が優れて残存し
た。電荷分離の前に、異なる抗体溶液の各々を酢酸を用いて、ｐＩに近いｐＨに
調整した。電荷分離に使用した膜は、汚染タンパク質の除去速度を上げるために
Ｍｒ１ｘ１０6孔サイズであった。これらの条件下で、このときモノクローナル
抗体は非電荷であり、上流に残留し、負に荷電した汚染タンパク質は下流に移動
した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）は、該第２工程を用いて、全ての抗体について
高純度が達成されたことを示した。抗体１の比較的高いｐＩは、Ｍｒ１ｘ１０6
孔サイズ膜（Ｍｒ１００，０００の代わりに）を用いてｐＨ８．３にて、１段階
での該抗体の精製を可能にした。該抗体は、該ｐＨで小さい負電荷を有したので
、Ｍｒ１ｘ１０6膜を通って移動すると予測されたが、１時間以内の短い工程で
あったので、上流に残留した。実際、より長い分離時間（１−２時間）で、いく
らかの下流への移動が示された。
【００３６】 回収率 モノクローナル抗体の回収率は、上流、下流およびその洗浄物に存在する抗体
の最終的な生物学的活性を出発物質と比較することによって決定した（表１）。
抗体２、３および４（２段階精製を用いる）についての回収率は抗体１よりも小
さかったが（表１）、８ｍｇより多くの量の各抗体が腹水液１ｍｌあたり回収さ
れた。該回収率は、他の精製法で予測される収率よりも高い。このようにより高
い活性が回収されるのは、使用される穏かなバッファーと分離に要する比較的短
時間の分離時間との組み合わせのためであり、分離カートリッジおよび短い精製
時間を用いて実現した。
【００３７】 開発されたプロトコールは、腹水液中の他のタンパク質と比較して大きいサイ
ズ（Ｍｒ１６０，０００）のモノクローナル抗体であって、ネズミ腹水液中の他
のタンパク質と比べて比較的高いｐＩ値のモノクローナル抗体に有益である。本
明細書に記載のプロトコールは、より多くの変数を考慮しなければならない従来
のクロマトグラフィー精製技術よりも複雑ではない。免疫グロブリン画分は、通
常、腹水液中において全タンパク質の約２−２５％である。腹水液中に存在する
高含量の脂質は、分別カラムの寿命を減少させることが知られている。本発明の
実施例において、試料を脱脂質化（delipidise）または前処理する必要もなく、
優れた精製および回収率が達成された。
【００３８】 最初に、少量（１０−２０ｍｇ）の各標的抗体を精製して本発明を試験した。
１５ｃｍ2膜（本明細書で使用される）から２００ｃｍ2までの直線状のスケール
アップが本発明者らおよびヘモグロビン／アルブミン分離のときの以前の共同研
究者（Horvathら、1994）によって成し遂げられた。２ｍｌから１０ｍｌへのマ
ウス腹水液の１５ｃｍ2カートリッジ上での予備的なスケールアップが達成され
た。より長い処理時間またはより大量の分離カートリッジが、大量のタンパク質
に必要とされうる。
【００３９】 本発明によって分離された抗体と、第三の物質との共同作用によるプロテイン
−Ａ、プロテイン−Ｇおよびイオン交換クロマトグラフィーを包含する標準的技
術によって精製された同じ抗体との比較は、本発明によって得られた抗体がより
活性であることを示した。さらに、抗体収率は、本発明を用いてより大きかった
。表２および３は、抗体の数種類の精製の比較結果を示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【００４２】 本発明によって精製された抗体の電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、より
少数のタンパク質バンドを示し、それは、本発明の方法が他の精製技術と比べて
、抗体を切断または損傷しないことを示す。本発明はより高収率の抗体を提供で
きるだけではなく、より活性でより変性していない抗体調製物も提供する。
【００４３】 広く記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の具体例
に示されるような本発明に多数の変更および／または修飾がなされることは、当
業者に明らかであろう。したがって、本発明の具体例は、全ての点において例示
として意図されるものであり、制限しようとするものではない。
【００４４】 引用文献 PG Bundesen, DM Wyatt, LE Cottis, AS Blake, DA Massingham, WA Fletcher
, G Street, JS Welch, DB Rylatt Vet Immunol Immunopath 8 (1985) 245-260
Horvath ZC, Corthals GL, Wrigley CW and Margolis J. Multifunctional ap
paratus for electrokinetic processing of proteins. Electrophoresis 1994
15 968-971 Margolis J, Corthals G and Horvath ZS. Preparative reflux electrochore
sis. Electrophoresis 1995 16 98-100. Corthals GL, Margolis J, Williams KL and Gooley AA. The role of pH and
membrane porosity in preparative electrophoresis. Electrophoresis 1996
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tionation of protein samples prior to two-dimensional electrophoresis. E
lectrophoresis 1997 18 317-323.
【図面の簡単な説明】
【図１】 Gradiflow分離カートリッジの作動様式を示す。（ａ）サイズに
基づく分離−これは、主要汚染物質が上流の抗体混合物から下流に除去される第
１工程である。（ｂ）電荷に基づく分離−これは、高純度の抗体を必要とする場
合、いずれかの残留する汚染物質を除去するために適当な第２工程である。
【図２】 抗体４の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１は０分の上流
であり、レーン２−５は、各々、１０、２０、３０および４０分後の上流である
。レーン６−９は、各々、１０、２０、３０および４０分の下流を示す。レーン
１０は、ＳＤＳ分子量マーカーを含有する。Ｍａｂ＝モノクローナル抗体；ｋＤ
ａ＝キロダルトン
【図３】 本発明の第２の態様における精製モノクローナル抗体のＳＤＳ−
ＰＡＧＥを示す。レーン１および７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量マーカーである
。対照として、抗体１の出発物質をレーン２に置き、レーン３、４、５および６
は最終的な４つの生成抗体を含有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 シャロン・リム オーストラリア2010ニュー・サウス・ウェ ールズ州サリー・ヒルズ、バッキンガム・ ストリート28／61−89番 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CE14 DA13 4H045 AA11 AA20 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 GA10 GA30 HA06 HA07 HA16 HA17 HA18 HA19

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）抗体および汚染物質混合物を第１の溶媒流中に置き、
    第１の溶媒流は電気泳動膜によって第２の溶媒流から分離されており； （ｂ）分離されるべき抗体よりも低い等電点（ＰＩ）を有する汚染物質が荷電
    されるように第１の溶媒流についてｐＨを選択し； （ｃ）２つの溶媒流間に電位を加え、抗体を実質的に第１の溶媒流中に保持し
    つつ、または膜に侵入したら、実質的に第２の溶媒流中に侵入することを妨げつ
    つ、膜を通じて第２の溶媒流中への少なくともいくつかの汚染物質の移動を引き
    起こし； （ｄ）所望により、電位を定期的に停止および逆転させて、膜に侵入したいず
    れもの抗体の第１の溶媒流中への逆戻りを起こさせ、このとき、第２の溶媒流中
    に侵入したいずれもの汚染物質の実質的な第１の溶媒流中への再侵入を起こさせ
    ず； （ｅ）第１の溶媒流が所望の抗体純度を含有するまで、工程（ｃ）および所望
    により、工程（ｄ）を繰り返すことを特徴とする抗体および少なくとも１種の汚
    染物質の混合物から抗体を分離する方法。
  2. 【請求項２】 抗体および汚染物質混合物が腹水液中のモノクローナル抗体
    である請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 電気泳動膜が５０〜１５０ｋＤａの分子量カットオフを有す
    る請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 電気泳動膜が１００ｋＤａの分子量カットオフを有する請求
    項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 第１の溶媒流がｐＨ７．５〜９．５である請求項１〜４のい
    ずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 さらに、 （ｆ）分離した抗体を新しい第１の溶媒流中に置き、第１の溶媒流は電気泳動
    膜によって第２の溶媒流から分離されており； （ｇ）抗体のｐＩの１ｐＨ単位内にあるように新しい第１の溶媒流のｐＨを選
    択し； （ｈ）２つの溶媒流間に電位を加え、抗体を実質的に新しい第１の溶媒流中に
    保持しつつ、または膜に侵入したら、実質的に第２の溶媒流中に侵入することを
    妨げつつ、膜を通じて第２の溶媒流中への少なくともいくつかの汚染物質の移動
    を引き起こし； （ｉ）所望により、電位を定期的に停止および逆転させて、膜に侵入したいず
    れもの抗体の新しい第１の溶媒流中への逆戻りを起こさせ、このとき、第２の溶
    媒流中に侵入したいずれもの汚染物質の実質的な新しい第１の溶媒流中への再侵
    入を起こさせず； （ｊ）新しい第１の溶媒流が所望の抗体純度を含有するまで、工程（ｈ）およ
    び所望により、工程（ｉ）を繰り返す工程を含む請求項１〜５のいずれか１項記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 工程（ｆ）において使用される膜の分子量カットオフが工程
    （ｂ）において使用されるものよりも大きい請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 工程（ｆ）において使用される電気泳動膜の分子量カットオ
    フが少なくとも２００ｋＤａである請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 工程（ｆ）において使用される電気泳動膜の分子量カットオ
    フが１０００ｋＤａである請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 工程（ｇ）におけるｐＨが６〜８である請求項６〜９のい
    ずれか１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 工程（ｇ）におけるｐＨが抗体のｐＩの０．５ｐＨ単位内
    にある請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】 抗体の回収パーセントが少なくとも７０％である請求項１
    〜１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 抗体の回収パーセントが少なくとも９０％である請求項１
    ２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 （ａ）分離した抗体を第１の溶媒流中に置き、第１の溶媒
    流は電気泳動膜によって第２の溶媒流から分離されており； （ｂ）抗体のｐＩの１ｐＨ単位内にあるように第１の溶媒流のｐＨを選択し； （ｃ）２つの溶媒流間に電位を加え、抗体を実質的に第１の溶媒流中に保持し
    つつ、または膜に侵入したら、実質的に第２の溶媒流中に侵入することを妨げつ
    つ、膜を通じて第２の溶媒流中への少なくともいくつかの汚染物質の移動を引き
    起こし； （ｄ）所望により、電位を定期的に停止および逆転させて、膜に侵入したいず
    れもの抗体の第１の溶媒流中への逆戻りを起こさせ、このとき、第２の溶媒流中
    に侵入したいずれもの汚染物質の実質的な第１の溶媒流中への再侵入を起こさせ
    ず； （ｅ）第１の溶媒流が所望の抗体純度を含有するまで、工程（ｃ）および所望
    により、工程（ｄ）を繰り返すことを特徴とする抗体および少なくとも１種の汚
    染物質の混合物から抗体を分離する方法。
  15. 【請求項１５】 抗体および汚染物質混合物が腹水液中のモノクローナル抗
    体である請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 工程（ａ）において使用される電気泳動膜の分子量カット
    オフが少なくとも２００ｋＤａである請求項１４または１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 工程（ａ）において使用される電気泳動膜の分子量カット
    オフが１０００ｋＤａである請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 工程（ｂ）におけるｐＨが６〜８である請求項１４〜１７
    のいずれか１項記載の方法。
  19. 【請求項１９】 工程（ｂ）におけるｐＨが抗体のｐＩの０．５ｐＨ単位内
    にある請求項１４〜１７のいずれか１項記載の方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法によって精製さ
    れた抗体。
  21. 【請求項２１】 モノクローナル抗体である請求項２０記載の抗体。
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