JP2004512539A

JP2004512539A - 複合分離法

Info

Publication number: JP2004512539A
Application number: JP2002539047A
Authority: JP
Inventors: ネア，ケミチェリ，ハリハラン; ギルバート，アンドリュー，マーク
Original assignee: グラディポア　リミテッド
Priority date: 2000-10-30
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2004-04-22
Also published as: CA2425848A1; AUPR110100A0; CN1473067A; AU2002211995A1; WO2002036245A1; EP1347820A1

Abstract

本発明は、化合物の混合物から所望の化合物を得るために１つ以上の従来分離技術と組み合わせた膜ベース電気泳動の使用を提供する。１つ以上の膜ベース電気泳動工程の使用は、所望の化合物のより迅速で、より効率的な産出をもたらす。

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、分離技術の組合せを用いる、化合物、特に生体分子の分離に関する。
【０００２】
背景技術
従来の血しょう分別は、最近まで１９４０年代後終わりごろに初めて記載されたＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙエタノール沈殿法に基づくものであった。Ｃｏｈｎ分別は、プロセスの効率および製品の品質を改善するためにカラムクロマトグラフィーが導入された１９７０年代初めごろまで、血しょう分別においてほとんど独占的に用いられた。大規模な血しょう処理のためのクロマトグラフィーの使用は、幾つかの会社が、それらの生産スキームから従来の沈殿を完全に排除してしまうような程度まで増加してきた。しかし、これらの方法を用いると、クロマトグラフィー樹脂メンテナンスのコスト、クロマトグラフィーカラムに必要とされる前濾過、およびカラムを用いて得られる限定された製品回収率をはじめとする幾つかの主要な固有の問題がある。
【０００３】
膜ベース（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂａｓｅｄ）電気泳動は、タンパク質、ヌクレオチドおよび複合糖のような高分子の分離のために元々開発された新しい技術である。高分子分離のために元々開発されたこのユニークな分取電気泳動技術は、ポリアクリルアミド膜を横断して電界または電位が印加される場合に膜を横断する接線流れを利用する。システムの一般的デザインは、ほぼ自生条件下でタンパク質および他の高分子の精製を促進する。これは、より高い収率と優れた回収率とをもたらす。本方法は、高分子分離の現行法よりも迅速で、安価でおよび高収率である高純度、スケールアップ可能な分離を提供する。さらに、本技術は、高分子溶液を同時に精製および解毒する可能性を提供する。
【０００４】
本発明は、全精製プロセスを置換する必要なしに、主要な血液分別のために用いられているもののような、従来の精製プロセスの中へ膜ベース電気泳動技術が統合できることを見いだした。この統合は、分離の全体的スピードおよび最終製品の純度に予期せぬ改善を可能にする。
【０００５】
発明の開示
一般的な態様において、本発明は、化合物の混合物から所望の化合物を得るために１つ以上の従来の分離技術と組み合わせた膜ベース電気泳動の使用を提供する。もう１つの膜ベース電気泳動工程の使用は、所望の化合物のより迅速で、より効率的な産出をもたらす。
【０００６】
第１の態様において、本発明は、化合物の混合物を有するサンプルからの少なくとも１種の所望の化合物を大規模に取り出す方法であって、
（ａ）少なくとも数種の所望の化合物を含有するサンプル分画を得るために１つ以上の分離法によってサンプルを処理する工程と、
（ｂ）陰極ゾーンに陰極と、陽極ゾーンに、陰極と陽極との間に電位を印加した際、その間の電界域に電界を生じるように陰極に関して配置された陽極と、電界域に配置された分離膜と、その間の第１間隙体積を画定するために第１電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１制限膜と、その間の第２間隙体積を画定するために第２電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２制限膜とを含む電気泳動装置の第１間隙体積中に所望の化合物を含有するサンプル分画の少なくとも幾つかを置く工程と、
（ｃ）選択されたｐＨを有する溶媒を該第１間隙体積に提供する工程と、
（ｄ）第１間隙体積中の選択された化合物のその他および他の構成成分の一部が第２間隙体積に入るのを妨げられる一方で、電位の印加が第１間隙体積中の選択された化合物および他の構成成分の選択された１種の分離膜を通った第２間隙体積への移行を引き起こす、第１と第２間隙体積との間に電位を印加する工程と、
（ｅ）間隙体積の１つが所望量の選択された化合物を含有して分離サンプルを形成するまで工程（ｄ）を維持する工程と、
を含む方法を提供する。
【０００７】
好ましくは、本発明の第１の態様による方法はさらに
（ｆ）分離サンプルの少なくとも一部を回収して、所望の化合物を含有する精製サンプルを得るために所望の化合物を含有する分離サンプルをもう１つのさらなる分離法にさらす工程
を含む。
【０００８】
好ましくは工程（ａ）および（ｆ）において、１つ以上の分離法は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、擬アフィニティークロマトグラフィー、膜ベースイオン交換システム、分取等電点電気泳動（ＩＥＦ）、バッファー交換／透析処理、沈殿、濾過、低温殺菌、塩／界面活性剤処理、遠心分離、限外濾過およびそれらの組合せから選択される。
【０００９】
好ましくは、工程（ｃ）は、サンプル分画中に正味電荷を有するかまたは実質的に中性である１種以上の化合物をもたらす。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、化合物の混合物を有するサンプルから少なくとも１種の所望の化合物の大規模取り出しのための方法であって、
（ａ）陰極ゾーンに陰極と、陽極ゾーンに、陰極と陽極との間に電位を印加すると適応してその間の電界域に電界を生じるように陰極に関して配置された陽極と、電界域に配置された分離膜と、その間の第１間隙体積を画定するために第１電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１制限膜と、その間の第２間隙体積を画定するために第２電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２制限膜とを含む電気泳動装置の第１間隙体積中に所望の化合物を含有するサンプルを置く工程と、
（ｂ）選択されたｐＨを有する溶媒を第１間隙体積に提供する工程と、
（ｃ）第１間隙体積中の選択された化合物のその他および他の構成成分の一部が第２間隙体積に入るのを妨げられる一方で、電位の印加が第１間隙体積中の選択された化合物および他の構成成分の選択された１種の分離膜を通った第２間隙体積への移行を引き起こす、第１と第２間隙体積との間に電位を印加する工程と、
（ｄ）間隙体積の１つが所望量の選択された化合物を含有して分離サンプルを形成するまで工程（ｃ）を維持する工程と、
（ｅ）サンプル分画を回収して、分離サンプル中に所望の化合物の必要量を得るために１つ以上の分離法によってサンプル分画の少なくとも一部を処理する工程と
を含む方法を提供する。
【００１１】
好ましくは工程（ｅ）において、１つ以上の分離法は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、擬アフィニティークロマトグラフィー、膜ベースイオン交換システム、分取等電点電気泳動（ＩＥＦ）、バッファー交換／透析処理、沈殿、濾過、低温殺菌、塩／界面活性剤処理、遠心分離、限外濾過およびそれらの組合せから選択される。
【００１２】
好ましくは、工程（ｂ）は、サンプル分画中に正味電荷を有するかまたは実質的に中性の１種以上の化合物をもたらす。
【００１３】
好ましくは、本発明の第１または第２の態様による方法は、分離サンプル中に少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％純度の所望の化合物をもたらす。
【００１４】
好ましい一形態において、サンプルは血液誘導サンプル、特に血しょうであり、得られる化合物は、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＩＩ、因子Ｘ、タンパク質Ｃ、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）から選択される。より好ましくは、化合物は、血しょうのＣｏｈｎ分画から得られる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。
【００１５】
別の好ましい形態において、サンプルは、細胞、培養物上澄み、ミルク、または植物素材のような任意の好適な源から得ることができる組換え製品である。
【００１６】
さらに別の好ましい形態において、サンプルはモノクローナル抗体を含有する。
【００１７】
しかし、複雑な混合物を含有するサンプルから高分子をはじめとする化合物を得るための他の大規模方法は、膜ベース電気泳動技術を利用する１つ以上の工程を含むように変更できることが認められるであろう。
【００１８】
膜ベース電気泳動技術の一利点は、１種以上の化合物を分離する間にサンプルから病原体または感染体を除去することも可能であることである。例えば、ウィルス、細菌、真菌類、酵母菌およびプリオンは、分離されるべき１種以上の生体分子の機能または完全性に有害であるかもしれない条件または処理を必要とせずに、効率的におよび安全に除去することができる。
【００１９】
別の好ましい形態において、工程（ａ）〜（ｆ）は、元のサンプルの１つ以上の処理が実施された後に実施される。
【００２０】
別の好ましい形態において、工程（ａ）〜（ｅ）は、実質的に純粋な形態で１種以上の化合物を得るための工程の後にさらに実施される。
【００２１】
１種以上の高分子の生産の方法に１つ以上の膜ベース電気泳動技術工程を包含することの結果として、方法の全体的効率が改善される。
【００２２】
好ましくは、膜は電気泳動分離膜かまたは制限膜である。
【００２３】
電気泳動分離膜は、好ましくはポリアクリルアミド製であり、少なくとも約３ｋＤａの分子質量カットオフを有する。分離膜の分子質量カットオフは、処理予定のサンプル、サンプル中の他の化合物、および実施される分離のタイプに依存する。
【００２４】
制限膜もまた、好ましくはポリアクリルアミド製である。制限膜の分子質量カットオフは、処理予定のサンプル、サンプル混合物中の他の化合物、および実施される分離のタイプに依存する。
【００２５】
電気泳動膜の形態での膜は、多層またはサンドイッチ配置として形成されてもよい。膜の厚さは、化合物の分離または移動に影響を及ぼすことができる。膜が薄ければ薄いほど、より迅速でより効率的な移動が起こることが分かった。
【００２６】
制限膜は、同じ分子質量カットオフまたは異なるカットオフを有することができ、その結果、非対称配列を形成する。
【００２７】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１または第２の態様に従った方法によって分離された高分子を提供する。
【００２８】
本明細書のどこでも、文脈が別の意味を必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」のような変形は、述べられる要素、整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の包含を意味すると理解されるであろうが、任意の他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の除外を意味するものではない。
【００２９】
本明細書に包含された文書、行為、材料、装置、物品などについてのいかなる議論も、もっぱら本発明に文脈を提供するという目的のためである。これらの事項のいずれかまたはすべてが、先行技術ベースの一部を形成するかまたはそれが本出願の各クレームの優先権日前にオーストラリアに存在したように本発明に関連した分野では共通一般知識であったことは、容認と理解されるべきではない。
【００３０】
本発明がより明確に理解されるように、好ましい形態が次の図面および実施例に関して説明される。
【００３１】
発明を実施するための態様
装置
電気泳動システム
本発明におけるような使用に好適な膜ベース電気泳動装置は、
（ａ）陰極ゾーンに陰極と、
（ｂ）陽極ゾーンに、陰極と陽極との間に電位を印加した際、その間の電界域に電界を生じるように陰極に関して配置された陽極と、
（ｃ）電界域に配置された分離膜と、
（ｄ）その間の第１間隙体積（流れ１）を画定するために第１電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１制限膜と、
（ｅ）その間の第２間隙体積（流れ２）を画定するために第２電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２制限膜と、
（ｆ）陰極ゾーン、陽極ゾーンならびに第１および第２間隙体積（流れ１および流れ２）の少なくとも１つに溶媒を提供するように改造された手段と、
（ｇ）第１間隙および第２間隙体積の選択された１つ中のサンプル成分を提供するように改造された手段であって、電位を印加すると、選択された分離製品が少なくとも１つの膜を通ってサンプル成分から取り出されて第１および第２間隙体積の他方または陰極もしくは陽極ゾーンに提供される手段と
を含む。
【００３２】
好ましい一形態において、装置はさらに
（ｈ）装置において発生した熱を除去するように改造された手段
を含む。
【００３３】
好ましくは、サンプルおよび流体は、電気泳動中に装置によって発生した熱を除去するために熱交換器に通される。
【００３４】
陰極ゾーンおよび陽極ゾーンは、任意の好適なポンプ送液手段によって好適な溶媒またはバッファー液を供給される。処理されるべきサンプルは、任意の好適なポンプ送液手段によって第１または第２間隙体積に直接供給される。
【００３５】
好ましくは、ゾーンおよび間隙体積は、それぞれの流体／バッファーおよびサンプル溶液の流れが流れを形成するのを許すように設計される。この形態においては、大きな体積を迅速に、効率的に処理することができる。溶液は、好適なポンプ送液手段によってそれぞれのリザーバからゾーンおよび体積を通って典型的に移動されるかまたは再循環される。好ましい実施態様において、サンプル、バッファーまたは流体を移動させるためのポンプ送液手段としてぜん動ポンプが用いられる。
【００３６】
一実施態様において、分離プロセスの間にミクロ分子、化合物または高分子の失活が起こらないことを確実にするためにおよび使用の間に装置の所望温度を維持するために電極バッファー、他のバッファーおよびサンプル溶液は、任意の好適な手段によって冷却される。
【００３７】
好ましくは、分離される成分を集めるおよび／または濃縮するために、体積または流れの少なくとも１つの中に任意の分離される構成成分または分子を含有する溶液が集められ、電気泳動が効率的なやり方で継続できることを確実にするために好適な溶媒で置換される。
【００３８】
使用の際には、サンプルは第１間隙体積（流れ１）中に置かれ、バッファーまたは溶媒は電極ゾーンおよび第２間隙体積（流れ２）に提供され、電位は、電界域に印加されてサンプル中の少なくとも１種の成分を陰極ゾーン中のバッファー／溶媒または第２間隙体積中のバッファー／溶媒へ移動させる。
【００３９】
間隙体積の順序は、サンプルが第２間隙体積中に置かれる場合には逆にすることができ、バッファーまたは溶媒は電極ゾーンおよび第１間隙体積に提供され、電位は、電界域に印加されてサンプル中の少なくとも１種の成分を陽極ゾーン中のバッファーまたは第１間隙体積中のバッファーへ移動させることが認められるであろう。
【００４０】
電気泳動ゾーンの１つ（または両方）中にサンプルを置くこともまた可能であり、１つ以上の間隙体積中への移動は電圧の印加の間ずっと達成される。
【００４１】
分離膜は好ましくは、ポリアクリルアミドからなる、確定した分子質量カットオフを有する電気泳動分離膜である。好ましくは、電気泳動分離膜は、約１ｋＤａから約２０００ｋＤａの分子質量カットオフを有する。分離膜の分子質量カットオフの選択は、処理予定のサンプルおよび混合物中の他の分子に依存する。しかし、他の膜化学または成分が本発明のために使用できることが認められるであろう。
【００４２】
第１および第２制限膜は、好ましくはポリアクリルアミドから形成され、通常、分離膜よりも小さい、好ましくは約１ｋＤａ〜約１０００ｋＤａの分子質量カットオフを有する。制限膜の分子質量カットオフの選択は、処理予定のサンプルおよび取り出されるべき高分子のサイズに依存する。制限膜は、同じ分子質量カットオフまたは異なるカットオフを有することができ、非対称配列を形成する。
【００４３】
好ましい一形態において、第１および第２間隙体積を形成する膜は、装置の電極ゾーン間に置かれたカートリッジまたはカセットとして提供される。カートリッジの構造は、好ましくは第１と第２制限膜との間に置かれた分離膜付きハウジングであり、こうして必要な間隙体積を形成する。
【００４４】
好ましくは、カートリッジまたはカセットは、カートリッジを含有するかまたは受け入れるように改造された電気泳動装置から取り外し可能である。
【００４５】
電極間の距離は、膜を通るサンプル成分の分離または移動に影響を及ぼす。電極間の距離が短ければ短いほど、成分の電気泳動移動は速くなる。約６ｍｍの距離が実験室規模の装置にとって好適であることが分かった。スケールアップ版については、距離は、分離膜の数およびタイプ、サンプル用の室のサイズおよび体積、バッファーおよび分離される製品に依存する。好ましい距離は、約６ｍｍ〜約１０ｃｍのオーダーであろう。距離はまた、装置に印加される電圧にも関係する。
【００４６】
電界の効果は次式による。
【００４７】
【数１】

（ｅ＝電界、Ｖ＝電圧、ｄ＝距離）
従って、電極間の距離が小さければ小さいほど、分離は速くなる。好ましくは、電極間の距離は、電界強度を増加させ、それによって膜を通る移行速度をさらに改善するために減少すべきである。
【００４８】
サンプル／バッファー／流体の流量は成分の分離に影響を及ぼす。装置の構造ならびに分離されるべきサンプルの性質および体積次第で、毎分ミリリットル〜毎分リットルまでの流量が用いられる。一般に実験室規模機器では、好ましい流量は約２０±５ｍＬ／分である。しかし、様々な分離体制中で約０ｍＬ／分〜約５０，０００ｍＬ／分の流量が用いられる。ポンプ送液手段および装置のサイズ次第では、最大流量はさらにもっと高い。流量の選択は、移行されるべき製品、移行の効率、他の用途に対応した前−および後−配置に依存する。
【００４９】
印加される電圧および／または電流の選択または印加は、分離次第で変化する。典型的には数千ボルトまでが用いられるが、電圧の選択および変化は、装置の構造、バッファーおよび分離されるべきサンプルに依存する。実験室規模機器では、好ましい電圧は約２５０Ｖである。しかし、移行、効率、スケールアップおよび具体的な方法次第で、約０Ｖ〜約５０００Ｖが用いられる。装置および処理されるべきサンプル次第では、より高い電圧もまた考えられる。
【００５０】
任意に、膜を通って完全に通過したいかなる成分も膜を通って実質的に戻さないが、膜に入った成分の移動を引き起こして、それが出てきた体積または流れの中へ逆移動させるために電位が周期的に停止および／または逆転されてもよい。
【００５１】
電位の逆転は任意であるが、別の代案は静止期である。静止（電位が印加されていない期間）は、任意の電位逆転の前または後に置き換えうるかまたは含まれうる任意の工程である。この静止技術は、多くの場合、電位逆転の代案または添え物として具体的な分離用途向けに実践することができる。
【００５２】
便宜上、第１間隙体積または流れは流れ１と呼ばれ、第２間隙体積または流れは流れ２と呼ばれる。典型的には、サンプルは流れ１中に置かれ、成分は分離膜を通って流れ２中へ移動させられる。
【００５３】
上のシステムは、Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ社（オーストラリア）によって生み出され、Ｇｒａｄｉｆｌｏｗ^ＴＭ技術と言われる。Ｇｒａｄｉｆｌｏｗ^ＴＭは、Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ社の商標である。
【００５４】
適用例
本発明の一適用例は、健康産業で使用される多数の血液製品を生産するための血しょうの商業的処理にある。他の適用例には、ミルク源からの組換えタンパク質の分離およびモノクローナル抗体の分離が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
血しょうタンパク質の生産で用いられるようなカラムクロマトグラフィースキームの最初の調査は、膜ベース電気泳動技術への適用の幾つかのポイントを特定した。これらの分野は、図１で強調されている。
【００５６】
統合のポイント１
寒冷沈降反応は、最初の分別工程であり、沈殿をまだ利用する精製スキームにおける唯一のポイントである。結果として、それは、遠心分離および／または濾過が必要とされる唯一の段階であり、それによって全体スキームにおけるネックとして働く。
【００５７】
しかし、それは、因子ＶＩＩＩがｖｏｎ　Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）およびフィブリノーゲンから分離される工程である。因子ＶＩＩＩは血しょう分別市場の伝統的なコストドライバーの１つであり、他の下流処理の多くは因子ＶＩＩＩの需要と供給とに基づいている。寒冷沈降反応の膜ベース電気泳動技術による置換は、タンパク質前分別の安価な、同時により効率的な方法を保証するであろう。
【００５８】
統合のポイント２
止血因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘおよびタンパク質Ｃの生産における中間のイオン交換工程は、膜ベース電気泳動技術にとって使用の可能なポイントである。その方法での２つ以上のカラム工程の必要性は、ただ一つの膜ベース電気泳動法によって置換されてもよく、それによって、余分の品質保証（ＱＡ）の必要性を取り除き、膜ベース電気泳動が同時除染工程として働くことができるので病原体汚染のリスクを最小限にする。統合のポイントはまた、処理時間を短くし、方法の効率および製品のナティビティを改善するであろう。
【００５９】
統合のポイント３
アルブミンおよびＩｇＧの生産における最終中間工程は、膜ベース電気泳動技術による置換にとって最も有望な候補である。イオン交換およびゲル濾過工程は、比較的非特異的であり（アフィニティークロマトグラフィーとは違って）、それゆえ新技術で容易に置換されるかもしれない。他の貴重な血しょう化合物（すなわち、止血因子）は従来技術を用いるスキームにおいてはより早くに精製されるので、それらを失活させるリスクは排除される。多段カラム工程は排除することができ、結果として効率が改善され、ＱＡ要件が低減されるであろう。これに加えて、本発明者らは、膜ベース電気泳動技術が高品質アルブミンおよびＩｇＧの生産においてかなりの利点を追加することを知っている。
【００６０】
Ｃｏｈｎ分別は血しょうを分別するのに用いられる主要な方法であるが、他の方法は硫酸アンモニウムおよびＰＥＧ沈殿を用いる。従って、膜ベース電気泳動技術は、有用な製品を得るためのかかる方法においてもまた使用することができる。
【００６１】
実験
Ｉ．Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ冷エタノール沈殿の置換
背景および目的
Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙエタノール分別は、大規模血しょう分別の初期段階において改良形態でまだ使用されている。多数の商業生産者は、彼らの現行免疫グロブリン生産スキームにおいて陰イオン交換クロマトグラフィー、低温殺菌および化学的処理と一緒にこの古い方法を使用している。その方法のＣｏｈｎ分別構成要素を膜関連電気泳動ベース技術で置換できる可能性がある。モデルとしてＩｇＧを使用して、このプロジェクトは、電気泳動の潜在的使用を研究し、得られた製品を、従来スキームおよび膜関連電気泳動による確立されたＩｇＧ精製からのものと比較することを目的とした。
【００６２】
サイズカット
これらの実験の目的は、膜関連電気泳動を用いて血しょうを高および低分子量分画へ処理することにあった。血しょうからのタンパク質のこの分割は、それらのさらなる精製を簡単にし、Ｃｏｈｎ／Ｏｎｃｌｅｙエタノール沈殿法によく似ている。
【００６３】
方法
どのカートリッジ構造が所望の分離をもたらすかを判定するために３つの実験を実施した。出発原料として流れ１では１５ｍＬの１：３希釈血しょうを、流れ２では１０ｍＬのバッファーと共にそれを使用した。６５ｍＭトリス／ホウ酸塩バッファーを使用し、おおよそ１．８Ｌのそれをバッファー流れ中へ負荷してｐＨ９．０で実験を実施した。使用した３つのカートリッジ構造は、
５−‘１００’−５（上部制限−‘分離膜’−下部制限膜）
５−‘２００’−５（上部制限−‘分離膜’−下部制限膜）
５−‘５００’−５（上部制限−‘分離膜’−下部制限膜）
であった。
【００６４】
すべての分離を順方向極性下に２５０Ｖ、１５０ｍＡで〜５００分間実施した。１０ｍＬのバッファーで置換しながら流れ２を１時間ごとに採取した。ＯＤ_{２８０ｎｍ}での吸光度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および比濁法を用いて分析を実施した。
【００６５】
結果
すべての分離は、ランの推移の間ずっと出発サンプル中のＩｇＧの大部分が流れ１に保持されるという結果になった。それは、アルブミンのほぼ完全な流れ２への移行を可能にするが、ＩｇＧの＞８０％を流れ１に保持するので、５−‘２００’−５カートリッジを使用した分離を、最良の結果を有するものとして選んだ。アルブミンは人間の血しょう中で最も豊富なタンパク質であるので、これは好都合である。図２は、５−‘２００’−５ランについて流れ１および流れ２サンプルを分析する２つのゲルを示す。
【００６６】
結論
５−‘２００’−５カートリッジを使って実施した分離は、２つの分画をもたらした。一分画は、〜１５０ｋＤａよりも大きいサイズのタンパク質の大部分を含有する高分子量サンプルであった。もう一方は、〜１２０ｋＤａよりも小さいサイズのタンパク質の大部分を含有する低分子量サンプルであった。これらの分画は、さらなる精製のための出発原料として使用することができた。
【００６７】
イオン交換を用いる高分子量分画からのＩｇＧの部分精製
これらの実験の目的は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて高分子量分画からＩｇＧを部分的に精製することにあった。
【００６８】
方法
使用したクロマトグラフィーシステムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のＡＫＴＡ　Ｐｒｉｍｅ装置であった。カラムは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製の５ｍＬ　ＨｉＴｒａｐ−ＱセファロースＨＰイオン交換カラムであった。結合バッファーは２０ｍＭトリス／ＨＣｌ　ｐＨ８．０であり、溶出バッファーは２０ｍＭトリス／ＨＣｌ　ｐＨ８．０＋１Ｍ　ＮａＣｌであった。次のプロトコルを用いた。
１００％溶出バッファー
１００％結合バッファー
結合バッファーと共にサンプルを注入のこと
４０〜９０％溶出グラジエント、２５ｍＬ＠３ｍＬ／分　３ｍＬ分画
１００％溶出バッファー
【００６９】
分画を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、自生ＰＡＧＥ、およびウェスタンブロットを用いて非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＩｇＧについて分析した。
【００７０】
結果
分画３〜６にわたって単一ピークが見られた（図３）。図４に示した非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質の大部分が分画４および５にあることを示した。
【００７１】
このゲルのウェスタンブロットは、分画４および５中のタンパク質のほとんどに対して正信号をもたらした。
【００７２】
結論
ランに先立って実施した用心のためのシリンジ濾過のみをクロマトグラフィーシステムに統合することによって、出発原料から純粋なＩｇＧを得た。これは、さらなるクロマトグラフ処理に通す前に遠心分離を必要とするほとんどのＣｏｈｎ／Ｏｎｃｌｅｙ調製とは対照的である。
【００７３】
ＩＩ．膜ベース電気泳動を用いるＣｏｈｎＩＩ、ＩＩＩペーストからのＩｇＧの精製
目的
従来の精製スキームにおけるクロマトグラフィーの立場を置換して、ＣｏｈｎＩＩ、ＩＩＩペーストからＩｇＧを高純度に精製するための電気泳動装置（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ　ＢＦ２００）の使用。
【００７４】
方法
Ｓｉｇｍａから供給されたＣｏｈｎＩＩ、ＩＩＩペーストに関して、ＩｇＧ精製スキームの開発を実施した。それぞれが結果のわずかに異なる組合せを与える、幾つかの戦略を開発した。幾つかのスキームには、その用途向けに特に作製された膜が含まれた。下記は、選択した最終プロトコルの要約である。
【００７５】
結果
スキーム１
カートリッジ構造：５−‘２５０’−５（上部制限−‘分離膜’−下部制限膜）−分離膜はＩｇＧの通過を許す
バッファー：ＧＡＢＡ／酢酸＠ｐＨ５．０　０．１％Ｔｗｅｅｎ２０入り
ラン時間：１６０分
収率：流れ２中に＞９０％
【００７６】
スキーム２
カートリッジ構造：５−‘１００’−５（上部制限−‘分離膜’−下部制限膜）−分離膜はＩｇＧの通過を妨げる
バッファー：トリス／ホウ酸＠ｐＨ９．０　０．１％Ｔｗｅｅｎ２０入り
ラン時間：１８０分
収率：流れ１中に＞９０％
【００７７】
スキーム３
カートリッジ構造：５−‘１００’−５（上部制限−‘分離膜’−下部制限膜）−分離膜はＩｇＧの通過を妨げる
バッファー：ＧＡＢＡ／酢酸＠ｐＨ５．０＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
ラン時間：１８０分
収率：流れ２中に＞９０％
【００７８】
スキーム４−２段階
第１段階カートリッジ構造：５−‘１００’−５（上部制限−‘分離膜’−下部制限膜）−分離膜はＩｇＧの通過を妨げる
第１段階バッファー：トリス／ホウ酸＠ｐＨ９．０　０．１％Ｔｗｅｅｎ２０入り
第１段階ラン時間：１８０分
第１段階収率：第１段階＞９０％
【００７９】
第２段階カートリッジ構造：５−‘１００’−５（上部制限−‘分離膜’−下部制限膜）−分離膜はＩｇＧの通過を妨げる
第２段階バッファー：ＧＡＢＡ／酢酸＠　ｐＨ５．０＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０第２段階ラン時間：２４０分
第２段階収率：〜７０％
【００８０】
収率結果は比濁法を用いて得られ、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いることによって確定した。２段階プロトコルを除き、ランはＩｇＧの９０％より高い回収率という結果になった。達成された純度の程度は、治療のＩＶＩＧ製品Ｇａｍｉｍｕｎｅ（バイエル社）と比べて同様であった。スキーム１、３、および４で使用した分離膜は、ＩｇＧの流れ２への移行を許すがブタのパルボウィルスを流れ１に添加してブタのパルボウィルスを制限した実験でも使用した。
【００８１】
スキーム１、２、３および４の分離結果は、それぞれ図４、５、６および７に示す。
【００８２】
結論
上のプロトコルは、高純度および高収率でＣｏｈｎＩＩ、ＩＩＩからＩｇＧを精製するのに使用することができる。異物の大部分は、かなりのレベルへ除去された。出発原料の低品位を考えれば、これは良好な結果であった。
【００８３】
ＩＩＩ．様々なクロマトグラフィー法を用いるアルブミン減損（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）血しょうからのＩｇＧの精製
背景および目的
膜ベース電気泳動の一商業的用途は、従来の血液分別スキームへの具現である。分離を改善するために、プロセス内の異なるポイントでの１つ以上の電気泳動工程の具現を取り扱うための方法を考案した。この実験では、膜ベース電気泳動によって得たサンプルを、（商業生産において日常的に用いられているものに似た）クロマトグラフィー法を用いてさらに精製した。このプロジェクトの目的は、膜ベース電気泳動技術を用いて得たアルブミン減損血しょうサンプルからＩｇＧを精製することにあった。
【００８４】
出発原料
次の構造を使って大規模（１００×）膜ベース電気泳動ランを実施した。
膜スタック：５ｋＤ−２００ｋＤ−５ｋＤ（上部制限−‘分離膜’−下部制限膜）×５
バッファー：トリスホウ酸塩ｐＨ８　０．１％Ｔｗｅｅｎ２０入り
出発サンプル：２Ｌ　１：３Ｃｌｉｎｉｓｙｓ血しょう（バッファーに１：３希釈）
ランニング条件：５９０Ｖ、２５Ａ、１０Ｃ、０．５時間採取で５時間。
【００８５】
このランの目的は、アルブミンの大部分を流れ２中へ移行させることにあった。流れ１に残留するサンプルはアルブミン減損血しょうである。図８は、このサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【００８６】
強陰イオン交換クロマトグラフィーを用いるアルブミン減損人間血しょう（膜ベース電気泳動技術を用いて調製）からのＩｇＧの精製
目的
商業的に文書化された条件下に強陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてアルブミン減損人間血しょうからＩｇＧを精製すること。
【００８７】
方法
実験用に次のシステムを考案した。
装置：ＡｋｔａＰｒｉｍｅ　ＡＰＢｉｏｔｅｃｈクロマトグラフィーシステム
カラム：ＡＰＢｉｏｔｅｃｈ製の５ｍＬ　ＨｉＴｒａｐＱ　ＨＰ強陰イオン交換結合バッファー：２０ｍＭ　Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ　Ｐｒｏｐａｎｅ　ｐＨ６．５（ＨＣｌ入り）
溶出バッファー：２０ｍＭ　Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ　Ｐｒｏｐａｎｅ　ｐＨ６．５（ＨＣｌ入り）＋１Ｍ　ＮａＣｌ
出発原料：結合バッファーで１：５希釈した５ｍＬアルブミン減損血しょう
【００８８】
このシステムは、異物タンパク質の大部分を結合させ、結合工程の間ずっとＩｇＧを流出させることを目的とする。
【００８９】
結果
分画２および３中へ溶出した肩のあるピークが得られた。該分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、図９のレーン３および４に見ることができる。
【００９０】
ＩｇＧ二分画の比濁法は、出発原料中に存在したＩｇＧの〜８０％が該分画に溶出されたことを示した。
【００９１】
ウェスタンブロット技術を用いてプラスミノーゲン除去についての分析を実施した。ＩｇＧ分画を、血しょうおよびアルブミン減損血しょう出発原料と比較した。ブロットおよび相当するＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を下の図１０に示す。
【００９２】
ブロットは、クロマトグラフィー工程が、目に見えるプラスミノーゲンがサンプル中に存在することなく、ＩｇＧを精製したことを示す。
【００９３】
結論
強陰イオン交換を使用して、膜ベース電気泳動によって得たアルブミン減損血しょうサンプルからＩｇＧを成功裡に精製した。ＩｇＧの純度は、クーマシー系汚染で汚染されたＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンド純度の、優れたものであった。収率は、回収された出発原料中のＩｇＧの８０％よりも高かった。精製はまた、プラスミノーゲンのレベルを検出限界より下に低下させることが分かった。これは、膜ベース電気泳動生成物をクロマトグラフィーできれいにすることの利点を例示する。
【００９４】
弱陰イオン交換クロマトグラフィーを用いるアルブミン減損人間血しょうからのＩｇＧの精製
目的
商業的に文書化された条件下に弱陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてアルブミン減損人間血しょうからＩｇＧを精製すること。
【００９５】
方法
実験用に次のシステムを考案した。
装置：ＡｋｔａＰｒｉｍｅ　ＡＰＢｉｏｔｅｃｈクロマトグラフィーシステム
カラム：ＡＰＢｉｏｔｅｃｈ製の２０ｍＬ　ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＤＥＡＥ　ＦＦ弱陰イオン交換
結合バッファー：２０ｍＭ　Ｌ−ヒスチジン　ｐＨ５．２０（ＨＣｌ入り）
溶出バッファー：２０ｍＭ　Ｌ−ヒスチジン　ｐＨ５．２０（ＨＣｌ入り）＋１Ｍ　ＮａＣｌ
出発原料：結合バッファーで１：５希釈した５ｍＬアルブミン減損血しょう
【００９６】
このシステムは、異物タンパク質の大部分を結合させ、結合工程の間ずっとＩｇＧを流出させることを目的とする。
【００９７】
結果
分画３〜５中に溶出した幅広いピークが生じた。分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、図１１のレーン４〜６に見ることができる。
【００９８】
ＩｇＧ分画の比濁法は、出発原料中に存在したＩｇＧのたったの〜３０％が検出されることを示した。
【００９９】
結論
弱陰イオン交換を使用して、膜ベース電気泳動によって得たアルブミン減損血しょうサンプルからＩｇＧを高純度へ成功裡に精製した。低い回収率は、イオン交換クロマトグラフィー手順に典型的でありうる。
【０１００】
タンパク質Ａアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いるアルブミン減損人間血しょうからのＩｇＧの精製
目的
タンパク質Ａアフィニティーカラムクロマトグラフィーおよび開発したアプリケーション方法を用いてアルブミン減損人間血しょうからＩｇＧを精製すること。
【０１０１】
方法
用いた方法は、カラムと共にＡＰＢｉｏｔｅｃｈによって提供されたアプリケーション鋳型に基づくものであった。実験用に次のシステムを考案した。
装置：ＡｋｔａＰｒｉｍｅ　ＡＰＢｉｏｔｅｃｈクロマトグラフィーシステム
カラム：ＡＰＢｉｏｔｅｃｈ製の１ｍＬ　ＨｉＴｒａｐ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ
結合バッファー：１００ｍＭ　リン酸ナトリウム＋１００ｍＭ　クエン酸ナトリウム　ｐＨ７．０（ＮａＯＨ入り）
溶出バッファー：１００ｍＭ　リン酸ナトリウム＋１００ｍＭ　クエン酸ナトリウム　ｐＨ３．０（ＨＣｌ入り）
出発原料：結合バッファーで１：５希釈した５ｍＬアルブミン減損血しょう
【０１０２】
このシステムは、カラムにＩｇＧに結合させ、異物の大部分がカラムを通過するにまかせることを目的とする。次にＩｇＧを溶出して集める。
【０１０３】
結果
主として第２および第３分画中に溶出した狭いピークが得られた。該分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、図１２のレーン５および６に見ることができる。
【０１０４】
ＩｇＧ分画の比濁法は、出発原料中に存在したＩｇＧの７０％より多くが検出されることを示した。
【０１０５】
結論
タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用して、膜ベース電気泳動によって得たアルブミン減損血しょうサンプルからＩｇＧを成功裡に精製した。ＩｇＧの純度は、ＩｇＧの単一バンドの下にわずかなタンパク質汚れがあるだけで良好であった（クーマシー系汚染で汚染されたＳＤＳ−ＰＡＧＥで見られるように）。主なＩｇＧ分画中に検出された収率は、出発原料中のＩｇＧの７０％より大きかった。
【０１０６】
タンパク質Ａと結合しない免疫グロブリンにはタンパク質Ｇを使用できることが理解されるであろう。
【０１０７】
既存血しょう分別スキームへの膜ベース電気泳動の統合の利点
Ｃｏｈｎ分画置換
このモードでの本発明の利点には、
−クロマトグラフィーを用いて得られるものよりも高いＣｏｈｎ分画からの回収率。
膜ベース電気泳動は８０％以上の回収率を生み出すことができるが、クロマトグラフィーのみでは典型的に出発製品の７０％以下をもたらす。ＩＶＩＧ製品のすべての１％が売上高でおおよそ９百万米国ドルに等しいことを理解すれば、その相違はかなりのものである。
−カラムすなわち前濾過に比べてより少ない膜ベース電気泳動向けサンプル調製。
−サイズおよび／または装填量基準で得られる高純度
−特異的な異物除去
−その場でのウィルス、細菌ならびにプリオンおよびパイロジェン除去
−一次でスケールアップ可能（ｌｉｎｅａｒｌｙ　ｓｃａｌａｂｌｅ）
が含まれる。
【０１０８】
従来法との統合
−Ｃｏｈｎ分別よりも高い回収率。Ｃｏｈｎは典型的に利用可能なＩＶＩＧのおおよそ５０％の損失をもたらす。上で議論したように、これは、かなりの金銭的コストに等しい
−多数の沈殿工程とは対照的に単一段階。これは、インフラストラクチュアが解消されるのを可能にし、異物導入の機会を少なくし、品質保証コストを最小限にする
−標的分子はプロセスの始めから終わりまで溶液中に保持されているので、沈殿物質を除去するための遠心分離／濾過が不要。これは、現行法の主要なネックの１つである
−膜ベース電気泳動総捕獲後にＣｏｈｎによって得られるものよりも精製された製品。これは、幾つかの精製工程の後に、現在入手可能なものよりも高品質の製品を潜在的にもたらす
−スキームにおけるウィルスならびにプリオンおよびパイロジェン除去
−クロマトグラフィーを用いる特異的な異物除去
【０１０９】
膜ベース電気泳動と他の精製法との統合の全体的な利点
−全体的処理スキームへの最小の妨害
−既存のＣｏｈｎおよびクロマトグラフィー技術のために少ない資本的支出
−既存技術が既に認められているので、少ない規制の干渉
−より安全な製品
−カラム長寿命
−カラム効率改善
−インフラストラクチュア解消
−置換可能な／使い捨てのカートリッジを使用するので、カラムの再充填が不要−カラム殺菌過程が不要
【０１１０】
血しょうからの血液製品の分離を例示してきたが、本発明は、細胞および細胞溶解産物からの組換えタンパク質、ミルクおよび乳製品、抗生物質、ならびに他の微生物製品の生産をはじめとする他の大規模商業的精製法に適用できる。
【０１１１】
広範に説明したような本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施態様に示したような本発明に多数の変形および／または修正が行われることは、当業者によって認められるであろう。従って、本実施態様は、すべての点で例示的なものとして、かつ、限定されないものとして考えられるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】血しょうタンパク質の商業生産のためのクロマトグラフプロセスを示す。
【図２】膜ベースクロマトグラフィーを用いる他の血しょう構成成分からのＩｇＧの分離のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３】膜ベースクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いる他の血しょう構成成分からのＩｇＧの分離の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４】スキーム１を用いるＣｏｈｎＩＩ、ＩＩＩペーストからのＩｇＧの分離のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図５】スキーム２を用いるＣｏｈｎＩＩ、ＩＩＩペーストからのＩｇＧの分離のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図６】スキーム３を用いるＣｏｈｎＩＩ、ＩＩＩペーストからのＩｇＧの分離のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図７】２つの分離段階を有するスキーム４を用いるＣｏｈｎＩＩ、ＩＩＩペーストからのＩｇＧの分離のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図８】アルブミン減損血しょうのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図９】強陰イオン交換精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１０】プラスミノーゲンについてのウェスタンブロットおよび相当するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１１】弱陰イオン交換精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１２】ＩｇＧのタンパク質Ａクロマトグラフィー精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

Claims

化合物の混合物を有するサンプルからの少なくとも１種の所望の化合物を大規模に取り出す方法であって、
（ａ）少なくとも数種の所望の化合物を含有するサンプル分画を得るために、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、擬アフィニティークロマトグラフィー、膜ベースイオン交換システム、分取等電点電気泳動（ＩＥＦ）、バッファー交換／透析処理、沈殿、濾過、低温殺菌、塩／界面活性剤処理、遠心分離、限外濾過およびそれらの組合せからなる群から選択された１つ以上の分離法によってサンプルを処理する工程と、
（ｂ）陰極ゾーンに陰極と、陽極ゾーンに、陰極と陽極との間に電位を印加した際に、その間の電界域に電界を生じるように陰極に関して配置された陽極と、電界域に配置された分離膜と、その間の第１間隙体積を画定するために第１電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１制限膜と、その間の第２間隙体積を画定するために第２電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２制限膜とを含む電気泳動装置の第１間隙体積中に所望の化合物を含有するサンプル分画の少なくとも幾つかを置く工程と、
（ｃ）選択されたｐＨを有する溶媒を該第１間隙体積に提供する工程と、
（ｄ）第１間隙体積中の選択された化合物のその他および他の構成成分の一部が第２間隙体積に入るのを妨げられる一方で、電位の印加が第１間隙体積中の選択された化合物および他の構成成分の選択された１種の分離膜を通った第２間隙体積への移行を引き起こす、第１と第２間隙体積との間に電位を印加する工程と、
（ｅ）間隙体積の１つが所望量の選択された化合物を含有して分離サンプルを形成するまで工程（ｄ）を維持する工程と
を含む方法。
（ｆ）前記分離サンプルの少なくとも一部を回収して、所望の化合物を含有する精製サンプルを得るために所望の化合物を含有する前記分離サンプルを、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、擬アフィニティークロマトグラフィー、膜ベースイオン交換システム、分取等電点電気泳動（ＩＥＦ）、バッファー交換／透析処理、沈殿、濾過、低温殺菌、塩／界面活性剤処理、遠心分離、限外濾過およびそれらの組合せからなる群から選択されたもう１つのさらなる分離法にさらす工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
工程（ｃ）が、サンプル分画中に正味電荷を有するかまたは実質的に中性である１種以上の化合物をもたらす請求項１または２に記載の方法。
前記分離サンプル中に少なくとも７０％純度の前記所望の化合物をもたらす請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記分離サンプル中に少なくとも８０％純度の前記所望の化合物をもたらす請求項４に記載の方法。
前記分離サンプル中に少なくとも９０％純度の前記所望の化合物をもたらす請求項５に記載の方法。
前記サンプルが血液−誘導サンプルである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記血液−誘導サンプルが血しょうである請求項７に記載の方法。
得られる前記化合物が、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＩＩ、因子Ｘ、タンパク質Ｃ、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）およびアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
前記化合物が血しょうのＣｏｈｎ分画から得られた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である請求項９に記載の方法。
工程（ａ）が寒冷沈降反応である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
工程（ａ）が硫酸アンモニウム沈殿およびポリエチレングリコール沈殿である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記サンプルが組換えタンパク質を含有するミルクである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記サンプルがモノクローナル抗体を含有する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
化合物の混合物を有するサンプルからの少なくとも１種の所望の化合物を大規模に取り出す方法であって、
（ａ）陰極ゾーンに陰極と、陽極ゾーンに、陰極と陽極との間に電位を印加した際に、その間の電界域に電界を生じるように陰極に関して配置された陽極と、電界域に配置された分離膜と、その間の第１間隙体積を画定するために第１電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１制限膜と、その間の第２間隙体積を画定するために第２電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２制限膜とを含む電気泳動装置の第１間隙体積中に前記所望の化合物を含有するサンプルを置く工程と、
（ｂ）選択されたｐＨを有する溶媒を第１間隙体積に提供する工程と、
（ｃ）前記第１間隙体積中の選択された化合物のその他および他の構成成分の一部が第２間隙体積に入るのを妨げられる一方で、電位の印加が第１間隙体積中の選択された化合物および他の構成成分の選択された１種の分離膜を通った第２間隙体積への移行を引き起こす、第１と第２間隙体積との間に電位を印加する工程と、
（ｄ）前記間隙体積の１つが所望量の選択された化合物を含有してサンプル分画を形成するまで工程（ｃ）を維持する工程と、
（ｅ）サンプル分画を回収して、分離サンプル中に前記所望の化合物の必要量を得るためにアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、擬アフィニティークロマトグラフィー、膜ベースイオン交換システム、分取等電点電気泳動（ＩＥＦ）、バッファー交換／透析処理、沈殿、濾過、低温殺菌、塩／界面活性剤処理、遠心分離、限外濾過およびそれらの組合せからなる群から選択された１つ以上の分離法によって前記サンプル分画の少なくとも一部を処理する工程と
を含む方法。
工程（ｂ）が前記サンプル分画中に正味電荷を有するかまたは実質的に中性である１種以上の化合物をもたらす請求項１５に記載の方法。
前記分離サンプル中に少なくとも７０％純度の前記所望の化合物をもたらす請求項１５または１６に記載の方法。
前記分離サンプル中に少なくとも８０％純度の前記所望の化合物をもたらす請求項１７に記載の方法。
前記分離サンプル中に少なくとも９０％純度の前記所望の化合物をもたらす請求項１８に記載の方法。
前記サンプルが血液−誘導サンプルである請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
前記血液−誘導サンプルが血しょうである請求項２０に記載の方法。
得られる前記化合物が、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＩＩ、因子Ｘ、タンパク質Ｃ、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）およびアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
前記化合物が血しょうのＣｏｈｎ分画から得られた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である請求項２２に記載の方法。
前記化合物が硫酸アンモニウム沈殿およびポリエチレングリコール沈殿から得られた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である請求項２２に記載の方法。
工程（ｅ）がイオン交換クロマトグラフィーである請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
前記イオン交換クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである請求項２５に記載の方法。
工程（ｅ）がアフィニティークロマトグラフィーである請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
前記アフィニティークロマトグラフィーがタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーまたはタンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィーである請求項２７に記載の方法。