JP2022540838A - 眼科用タンパク質医薬品の精製方法(Refining method of ophthalmic protein pharmaceuticals) - Google Patents
眼科用タンパク質医薬品の精製方法(Refining method of ophthalmic protein pharmaceuticals) Download PDFInfo
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Abstract
Description
(a)pH4.5~6.6の緩衝液で平衡化された陽イオン交換樹脂にアフリベルセプト混合物を装填する工程;
(b)pH4.5~6.6の条件で0~40mM濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄する工程;及び
(c)pH4.5~6.6の条件で、工程(b)工程よりも高い濃度で、かつ40~120mM濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で溶出し、pH6.0~8.3の範囲のアフリベルセプトを採取する工程;
で行われる陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー法を提供し、これによってpH6.0~8.3の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを精製することができる。
(a)pH7.5~9.0の緩衝液で平衡化された陰イオン交換樹脂にアフリベルセプト混合物を装填する工程;
(b)pH7.5~9.0の条件で0~20mM濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄する工程;及び
(c)pH7.5~9.0の条件で工程(b)よりも高い濃度で、かつ20mM~150mMの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含んで溶出し、pH6.0~8.3の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを採取する工程;
で行われる陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー法を提供することにより、pH6.0~8.3の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを精製することができる。
(a)10mM酢酸ナトリウム、7%スクロース、0.03%ポリソルベート20、pH5.5の組成;
(b)10mM酢酸ナトリウム、6.5%スクロース、15mM塩化ナトリウム、0.03%ポリソルベート20、pH5.5の組成;
(c)50mM酢酸ナトリウム、6%スクロース、0.03%ポリソルベート20、pH5.5の組成。
まず、アフリベルセプト発現動物細胞の培養物から動物細胞を除去し、前処理溶液を得た。アフリベルセプト発現動物細胞は、好ましくは哺乳類、げっ歯類、鳥類または昆虫細胞であり、より好ましくはCHO(Chinese hamster ovary)、VERO、BHK(Baby hamster kidney)、NS0細胞であり、最も好ましくはCHO細胞である。
上記の前処理された培養液は、特定の範囲の等電点値を有するアフリベルセプトのみを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、アフィニティクロマトグラフィー、ミックスモードまたはマルチモーダルクロマトグラフィー、脱塩限外濾過工程からなる群から選択される少なくとも一つ以上の方法により精製することができるが、これに限定されるものではない。
上記の前処理された培養液は、特定の範囲の等電点値を有するアフリベルセプトのみを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、アフィニティクロマトグラフィー、ミックスモードまたはマルチモーダルクロマトグラフィー、脱塩限外濾過工程からなる群から選択される一つ以上の方法により精製することができるが、これに限定されるものではない。
(1)陽イオン交換クロマトグラフィーの実施方法
工程2のプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより得られたアフリベルセプトの試料溶液、またはプロテインAアフィニティクロマトグラフィーとマルチモーダルクロマトグラフィーを併用して、採取されたアフリベルセプト試料溶液を、陽イオン交換クロマトグラフィーに適用して、特定の範囲の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみを精製する。
弱陽イオン交換樹脂の一種であるCM-sepharose FF(GE healthcare)樹脂を用いて種々の平衡化、洗浄条件、及び溶出条件を試験したが、平衡溶液としては、主に酢酸ナトリウムとリン酸ナトリウム緩衝液を用いており、pHが4.5~6.6である。洗浄溶液としては、主に酢酸ナトリウムとリン酸ナトリウム緩衝液を用いており、pHが4.5~6.6であり、低濃度(すなわち、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含有しない場合は0~40mM濃度範囲であり、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含有する場合は、0超40以下の範囲であることを意味する)の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むことが好ましい。酢酸ナトリウムとリン酸ナトリウム緩衝液を用いた溶出溶液で用いられるpHは4.5~6.6であり、より高い濃度(40~120mM濃度範囲)の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムが含まれた。より好ましい溶出溶液の塩化ナトリウム塩濃度は40~100mMであり、表1に示すそれぞれの平衡化工程、装填工程、洗浄工程、溶出工程を実施し、標準品アフリベルセプトとほぼ同等の等電点値の範囲(pH6.0~8.3)を有するアフリベルセプト物質を効果的に精製することができた。
(1)陰イオン交換クロマトグラフィーの実施方法
工程2のプロテインAアフィニティクロマトグラフィーを通じて採取したアフリベルセプト試料溶液またはプロテインAアフィニティクロマトグラフィーとマルチモーダルクロマトグラフィーを併用して採取されたアフリベルセプト試料溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーに適用し、特定範囲の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみを精製する。
強塩基性陰イオン交換樹脂の一種であるQ-sepharose FF(GE healthcare)樹脂を用いて種々の平衡化及び洗浄条件、溶出条件を試験したが、平衡溶液としては、特にリン酸ナトリウムとトリス緩衝液を用いることができ、pHは7.5~9.0の範囲で行うことができ、洗浄溶液としては、特にリン酸ナトリウムとトリス緩衝液を用いることができ、pHは7.5~9.0の範囲であり、低濃度(0~20mM濃度範囲)の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むことが好ましい。溶出溶液としては、特にリン酸ナトリウムとトリス緩衝液を用いることができ、等電点が8.3以下の物質を精製するためには、洗浄工程の塩濃度よりも高い20mM以上、かつ約150mM以下の塩濃度で溶出することが好ましく、より好ましくは溶出溶液の塩化ナトリウム塩濃度は、pH=7.5~8.5のpHの条件で20mM~90mM条件である。しかし、90mM以上の塩濃度であっても標的とする等電点範囲のアフリベルセプトを精製することが可能であるが、溶出ピークの形状が比較的シャープでありながら、採取される分画間の等電点値の差が小さくなる傾向があった。
前記工程2のプロテインAアフィニティクロマトグラフィーを通じて採取したアフリベルセプト試料溶液またはプロテインAアフィニティクロマトグラフィーとマルチモーダルクロマトグラフィーが一緒に採取されたアフリベルセプト試料溶液に対して陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを併用して、特定範囲の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみを精製する。
前記の陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン/陰イオン交換樹脂を併用して精製する工程により採取したpH6.0~8.3の等電点を有するアフリベルセプト溶液を最終的に剤形化して原液を溶液を調製するために、Vivaspin(Sartorius、MWCO 50kDa)を用いて濃縮した後に、配合緩衝液を繰り返し添加する方法で配合緩衝液で置換し、ポリソルベート20の場合は、最終的に0.03%の含有量になるように添加し、約40mg/mlの含有量を有するアフリベルセプトを含む最終原液を調製した。このとき選択される配合緩衝液の組成は、10mM酢酸ナトリウム、7%スクロース、0.03%ポリソルベート20、pH5.5の組成を選択してもよく、長期安定性をより改善するために塩の濃度を高めた10mM酢酸ナトリウム、6.5%スクロース、15mM塩化ナトリウム、0.03%ポリソルベート20、pH5.5の組成を選択してもよく、50mM酢酸ナトリウム、6%スクロース、0.03%ポリソルベート20、pH5.5の組成を選択してもよく、除菌ろ過工程は、0.22umPES膜を用いて実施した。
Claims (9)
- 次のように実施され、陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー法を適用し、pH6.0~8.3の範囲の等電点を有するアフリベルセプトの精製方法:
(a)pH4.5~6.6の緩衝液で平衡化された陽イオン交換樹脂に、アフリベルセプト混合物を装填する工程;
(b)pH4.5~6.6の条件で0~40mM濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄する工程;および
(c)pH4.5~6.6の条件で工程(b)過程よりも高い濃度で、かつ40~120mM濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で溶出し、pH6.0~8.3の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを採取する工程。 - カラムの平衡化、洗浄及び溶出の工程に用いられる緩衝液は、酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムである請求項1に記載のアフリベルセプトの精製方法。
- 陽イオン交換樹脂のリガンドは、カルボキシメチル(CM)基である請求項1に記載のアフリベルセプトの精製方法。
- 以下のように実施される、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー法を適用して、pH6.0~8.3の範囲の等電点を有するアフリベルセプト(aflibercept)の精製方法:
(a)pH7.5~9.0の緩衝液で平衡化された陰イオン交換樹脂にアフリベルセプト混合物を装填する工程;
(b)pH7.5~9.0の条件で0~20mM濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄する工程;および
(c)pH7.5~9.0の条件で工程(b)よりも高い濃度であり、かつ20mM~150mMの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で溶出し、pH6.0~8.3の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを採取する工程。 - カラムの平衡化、洗浄及び溶出の工程に用いられる緩衝液は、リン酸ナトリウムまたはトリス(Tris)である請求項4に記載のアフリベルセプトの精製方法。
- 陰イオン交換樹脂のリガンドは、第四級アンモニウム(Q)基である請求項4に記載のアフリベルセプトの精製方法。
- アフリベルセプトタンパク質の混合物に対してイオン交換クロマトグラフィーを行う前に、プロテインA アフィニティクロマトグラフィー、ミックスモード(mixed-mode)またはマルチモーダル(Multimodal)クロマトグラフィー、脱塩限外濾過工程からなる群から選択される一つ以上の方法を適用する請求項1または4に記載のアフリベルセプトの精製方法。
- 請求項1に記載の陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー方法と請求項4に記載の陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー法を併用することにより、pH6.0~8.3の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを精製する方法。
- アフリベルセプト最終精製物を硝子体内注射(intravitreal injection)に適合するように次の3つのいずれか1つの組成物に配合する方法:
(a)10mM酢酸ナトリウム、7%スクロース、0.03%ポリソルベート20、pH5.5の組成、
(b)10mM酢酸ナトリウム、6.5%スクロース、15mM塩化ナトリウム、0.03%ポリソルベート20、pH5.5の組成、
(c)50mM酢酸ナトリウム、6%スクロース、0.03%ポリソルベート20、pH5.5の組成。
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