CN105111306A

CN105111306A - 美洲短吻鳄白蛋白的分离方法

Info

Publication number: CN105111306A
Application number: CN201510540827.6A
Authority: CN
Inventors: 李泽琳; 何淼; 罗长莉; 刘伟; 曾毅
Original assignee: Beijing University of Technology
Current assignee: Beijing University of Technology
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2015-12-02

Abstract

本发明提供一种美洲短吻鳄白蛋白的分离纯化方法。所述方法是以美洲短吻鳄(American？Alligator)新鲜血液为原料，通过以下步骤提取的：将新鲜鳄鱼血液进行抗凝处理，分离血浆；硫酸铵沉淀法粗提蛋白；疏水色谱法纯化得到白蛋白；质谱仪对所得蛋白进行鉴定。本发明方法操作简便易行，成本低廉，纯化得到的鳄鱼血白蛋白纯度很高，填补了国内鳄鱼血浆蛋白成分分离纯化的空白。

Description

美洲短吻鳄白蛋白的分离方法

技术领域

本发明涉及美洲短吻鳄(AmericanAlligator)血液提取物的分离方法，属生物技术领域。

背景技术

鳄鱼是迄今发现活着的最早和最原始的动物之一。出现于三叠纪至白垩纪的中生代(约两亿年前)性情凶猛的脊椎类爬行动物，是一种科研价值、生态价值、经济价值极高的野生动物。鳄鱼血含有比当今所发现的一切抗生素都要强有力的抗菌物质，不仅可以杀伤病菌，还可以消灭霉菌或是部分种类的病毒。而白蛋白在动物体内具有多种生理作用，比如维持胶体渗透压、物质结合和转运、协调血管内皮完整性、抗氧化以及损伤修复等等。对于鳄鱼血白蛋白以及鳄鱼血液中其他组分的研究具有重要意义，是鳄鱼血抗菌抗病毒机理研究的重要组成部分。

硫酸铵能够破坏溶液中蛋白质的水化膜，可以使蛋白质发生沉淀。不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，盐析沉淀所需要的硫酸铵浓度不同，从而达到将蛋白质分离的目的。硫酸铵沉淀的优点是不会使蛋白质发生变性。

蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水色谱是利用蛋白质表面某一部分具有的疏水性，使之与也带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。

本发明操作简便易行，成本低廉；纯化得到的鳄鱼血白蛋白纯度很高，可以达到95％以上；操作过程不经过蛋白变性，白蛋白本身具有良好的活性。

目前国内有关鳄鱼血液成分蛋白分离纯化的专利仍然是一个空白，国内国外也从未有过鳄鱼血白蛋白分离提取的相关报道。本发明是发明人通过大量实验，针对目标蛋白的结构与空间构象，不断优化得到的最简单高效的鳄鱼血白蛋白纯化方法，为同类蛋白的纯化提取提供了一个崭新的思路。

发明内容

本发明目的在于提供一种美洲短吻鳄白蛋白的分离纯化方法。

本发明目的是通过以下技术方案实现的。

本发明是以美洲短吻鳄(AmericanAlligator)新鲜血液为原料，通过以下步骤提取的：

a.将新鲜鳄鱼血液进行抗凝处理，分离血浆；

b.硫酸铵沉淀法粗提蛋白；

c.疏水色谱法纯化得到白蛋白；

d.质谱仪对所得蛋白进行鉴定。

所述步骤a可按如下方法操作：

事先以肝素钠溶液润湿容器，以20IU/ml肝素钠的终浓度将其与鳄鱼血液混合，静置1h；将静置后的血液进行离心，3000rpm4℃5min，吸出上清保存，得到鳄鱼血浆。如需长时间保存，需放置于-20℃或-80℃冰箱。

所述步骤b硫酸铵沉淀法按如下方法操作：

1)将鳄鱼血浆置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至鳄鱼血浆中硫酸铵浓度达到30％，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm4℃离心20min，收集上清液；

2)将步骤1)中的上清液置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至硫酸铵浓度达到50％，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm4℃离心20min，收集上清液；

3)将步骤2)中的上清液置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至硫酸铵浓度达到70％，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm4℃离心20min，弃去上清液，收集沉淀蛋白。

4)将70％硫酸铵沉淀蛋白溶解于一定体积0.01M,pH＝7的PBS缓冲液，以备后用。

所述步骤c疏水色谱法按如下方法操作：

本纯化方法所用仪器为AKTA蛋白纯化系统，色谱柱选择GE公司的HiTrapOctylFF,1ml疏水色谱柱。

事先将步骤b所述的70％硫酸铵沉淀蛋白与含有2M硫酸铵的0.01M,pH＝7的PBS缓冲溶液进行等体积混合，保证其硫酸铵浓度约为1M；使用含有1M硫酸铵的0.01M,pH＝7的PBS缓冲溶液平衡色谱柱，设置流速为0.5-1ml；待仪器各条曲线稳定后，将混有硫酸铵的70％硫酸铵沉淀蛋白溶液上样，流穿色谱柱；以1-0M硫酸铵的线性梯度PBS缓冲溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，即为所得。

由图2SDS-PAGE电泳图可得，洗脱部分蛋白纯度很高，可以达到95％以上。至后质谱仪分析蛋白，确定为鳄鱼血白蛋白成分。

本发明的意义在于

1.以前国内没有鳄鱼血浆成分分离纯化方面的专利，本发明填补了国内鳄鱼血浆蛋白成分分离纯化的空白；

2.本发明方法操作简便易行，成本低廉，纯化得到的鳄鱼血白蛋白纯度很高，由图2可以看出，白蛋白纯度可以达到95％以上。

附图说明

图1为硫酸铵沉淀法分离美洲短吻鳄血浆蛋白样品SDS-PAGE电泳图：

1为ThermoPageRulerPrestainedProteinLadder，上样量5ul，货号26616；

2为30％硫酸铵沉淀蛋白，浓度500ug/ml，上样量20ul；

3为50％硫酸铵沉淀蛋白，浓度500ug/ml，上样量20ul；

4为70％硫酸铵沉淀蛋白，浓度500ug/ml，上样量20ul；

5为鳄鱼血浆原蛋白，浓度500ug/ml，上样量20ul。

图2为疏水色谱法分离70％硫酸铵沉淀蛋白SDS-PAGE电泳图：

1为ThermoPageRulerPrestainedProteinLadder，上样量5ul，货号26616；

2为蛋白流穿部分，浓度200ug/ml，上样量20ul；

3为ThermoPageRulerPrestainedProteinLadder，上样量5ul，货号26616；

4为蛋白洗脱部分，浓度200ug/ml，上样量20ul。

图3为疏水色谱法洗脱部分蛋白质谱分析结果，结果显示所测成分为鳄鱼血白蛋白。

实施方式

1.血浆准备

本鳄鱼血浆购自广州番禺某鳄鱼养殖场，鳄鱼种类为美洲短吻鳄(AmericanAlligator)。

采血前事先在无菌容器内加入肝素钠溶液，并不断翻倒容器以使肝素钠溶液与容器壁充分接触。宰杀鳄鱼后迅速将新鲜鳄鱼血液灌入容器，并轻轻晃动容器以使肝素钠溶液与鳄鱼血液充分混匀。鳄鱼血液加入不能过多，须保证肝素钠比重大于20IU/ml。灌装鳄鱼血液后，不能剧烈晃动容器，避免血细胞破裂造成凝血。

离心鳄鱼血液，3000rpm4℃5min，小心吸出上清，即为鳄鱼血清。立即置于-20℃或者-80℃冰箱冷藏，以干冰制冷密封运输。

2.硫酸铵沉淀法分离鳄鱼血浆蛋白

1)将鳄鱼血浆置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至鳄鱼血浆中硫酸铵浓度达到30％，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm4℃离心20min，收集上清液，并保留鳄鱼血30％硫酸铵沉淀蛋白；

2)将步骤1)中的上清液置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至硫酸铵浓度达到50％，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm4℃离心20min，收集上清液，并保留鳄鱼血50％硫酸铵沉淀蛋白；

3)将步骤2)中的上清液置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至硫酸铵浓度达到70％，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm4℃离心20min，弃去上清液，收集鳄鱼血70％硫酸铵沉淀蛋白；

4)将鳄鱼血30％硫酸铵沉淀蛋白、50％硫酸铵沉淀蛋白、70％硫酸铵沉淀蛋白分别溶解于一定体积0.01M,pH＝7的PBS缓冲液。以紫外分光光度计测定蛋白浓度，分别稀释至500ug/ml浓度，进行SDS-PAGE电泳，每孔上样20ul蛋白与5ul5xSDSLoadingBuffer(混合后须先置于开水中煮5分钟)，得到结果如图1所示。

3.疏水色谱法纯化鳄鱼血白蛋白

事先将70％硫酸铵沉淀蛋白与含有2M硫酸铵的0.01M,pH＝7的PBS缓冲溶液进行等体积混合，保证其硫酸铵浓度约为1M；使用含有1M硫酸铵的0.01M,pH＝7的PBS缓冲溶液平衡色谱柱，设置流速为0.5-1ml；待仪器各条曲线稳定后，将混有硫酸铵的70％硫酸铵沉淀蛋白溶液上样，流穿色谱柱，收集流穿液；以1-0M硫酸铵的线性梯度PBS缓冲溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液。

以紫外分光光度计测定蛋白流穿液和蛋白洗脱液的蛋白浓度，分别稀释至200ug/ml，进行SDS-PAGE电泳，每孔上样20ul蛋白与5ul5xSDSLoadingBuffer(混合后须先置于开水中煮5分钟)，得到结果如图2所示。

由图2SDS-PAGE电泳图可得，洗脱部分蛋白纯度很高，可以达到95％以上。至后质谱仪分析蛋白，确定为鳄鱼血白蛋白成分，质谱分析结果如图3所示。

Claims

1.一种美洲短吻鳄血浆白蛋白的分离方法，其特征是以美洲短吻鳄(AmericanAlligator)新鲜血液为原料，分离步骤如下：

a.将新鲜美洲短吻鳄血液进行抗凝处理，分离血浆；

b.硫酸铵沉淀法粗提蛋白；

c.疏水色谱法纯化得到白蛋白；

d.质谱仪对所得蛋白进行鉴定。

2.如权利要求1所述的分离方法，所述步骤a具体为：

事先使用肝素钠溶液润湿容器，以20IU/ml肝素钠的终浓度将其与鳄鱼血液混合，静置1h；将静置后的血液进行离心，3000rpm4℃5min，吸出上清保存，得到鳄鱼血浆。

3.如权利要求1所述的分离方法，所述步骤b具体为：

1)将鳄鱼血浆置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至硫酸铵浓度达到50％，冰上静置1h，5000rpm4℃离心20min，收集上清液；

2)将步骤2)中的上清液置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至硫酸铵浓度达到70％，冰上静置，每15min震荡15s，震荡4次，5000rpm4℃离心20min，弃去上清液，收集沉淀蛋白；

3)将70％硫酸铵沉淀蛋白溶解于定量0.01M,pH＝7的PBS缓冲溶液，以备后用。

4.如权利要求3所述的分离方法，所述步骤c具体为：

将所述的70％硫酸铵沉淀蛋白溶液与含有2M硫酸铵的0.01M,pH＝7的PBS缓冲溶液进行等体积混合，保证其硫酸铵浓度约为1M；使用AKTA蛋白纯化系统连接疏水色谱柱GEHiTrapOctylFF,1ml进行纯化，使用含有1M硫酸铵的0.01M,pH＝7的PBS缓冲溶液平衡色谱柱，设置流速为0.5-1ml；待仪器各条曲线稳定后，将混有硫酸铵的70％硫酸铵沉淀蛋白溶液上样，流穿色谱柱；以1-0M硫酸铵的线性梯度PBS缓冲溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，即可得到纯度很高的鳄鱼血白蛋白。