SE450205B - Sett att fraktionera en immunglobulinhaltig vattenlosning med kontinuerlig flodeselektrofores - Google Patents

Description

450 205 och 8,4, så att både den vandrande lösningen och bärarlösnin- gen är buffrade, och ett konstant elektriskt fält anbringas över den resulterande blandningen så att annorlunda förflytt- ning alstras hos komponenterna i immunglobulinet relativt varandra och relativt eventuella andra huvudbeståndsdelar i lösningen vinkelrätt mot bärarlösningens flödesriktning och (3) de erhållna speciella fraktioner, som innehål- ler en eller flera komponenter av immunglobulinet, uppsam- las.

Fraktionerna kan därefter, om så önskas, koncentre- ras t.ex. med koncentrerande anordningar med ihåliga fiber- membran, och därefter frystorkas. Fraktionerna kan återupp- rättas i en liten volym vätska. Analys av sådana återupprät- tade fraktioner av IgG-, IgM-, IgA-, IgD- och IgE-kompo- nenter visar att vissa fraktioner kan innehålla speciella relativa proporti/oner av sådana komponenter, och dessa frak- tioner kan vara av specifikt värde för immunisering mot be- stämda infektioner. Ytterligare detaljer återges i beskriv- ningens utföringsexempel.

Steg (2) utföres lämpligen såsom allmänt beskrives i det amerikanska patentet 3 616 453, som beskriver ett för- farande och en anordning där stabilisering av flödande ström- mar i kontinuerlig flödeselektrofores åstadkommes med en vin- kelhastighetsgradient. Vid förfarandet enligt uppfinningen kan sålunda fraktioneringen utföras i en ringformig separa- tionskammare, definierad mellan en central stationär cylin- der (en stator) och en yttre roterande cylinder (en rotor), som, tvärs över den ringformiga kammaren, resulterar i en vinkelhastighetsgradient, som ger laminärt flöde vid höga genomflöden.

Det konstanta elektriska fältet anbringas däref- ter över den ringformiga kammaren för att alstra den diffe- rentierade förflyttningen av immunglobulinkomponenterna i den vandrande lösningen. Förbättringar och/eller modifie- ringar av anordningen enligt det amerikanska patentet 3 616 Q53 beskrives i de brittiska patentskrifterna 450 205- 3 1 431 887 och l 431 888 (motsvarande de amerikanska patenten 3 844 926). _ pH-värdet hos den vandrande lösningen och bärarlös- ningen i steg (2) ligger, såsom angivits, mellan 7 och 8,4.

Mycket effektiv fraktionering har visat sig äga rum i detta intervall, vilket även möjliggör att faktor VIII och albumin, om sådant föreligger, kan fraktioneras samtidigt, t.ex. när vattenlösningen innehåller blodplasma. Separation av faktor VIII med kontinuerlig flödeselektrofores beskrives i PCT- ansökningen GB78/00038, inlämnad den 10 november 1978, som inter alia beskriver ett förfarande för rening av en vatten- lösning, innehållande faktor VIII, vilket förfarande känne- tecknas av att (l) jonstyrkan hos lösningen reduceras till en nivå så att lösningen kan utsättas för elektrofores, . (2) lösningens pH-värde justeras inom ett inter- vall, där stabiliteten av faktor VIII inte påverkas nega- tivt, _ (3) produkten från steg (2) utsättes för konti- nuerlig flödeselektrofores genom att lösningen injiceras som en vandrande lösning in i en andra vattenlösning, som laminärt flödar i en ringformig separationskammare såsom bärarlösning för den vandrande lösningen, och som är stabi- liserad med en vinkelhastighetsgradient, och ett konstant elektriskt fält anbringas över den erhållna blandningen så att en annorlunda förflyttning åstadkommes hos faktor VIII- komponenten i den vandrande lösningen i förhållande till de andra huvudbeståndsdelarna i lösningen vinkelrätt mot skiktets ' flöaesrikrning och _ (4) den separerade faktor VIII-komponenten upp- samlas. _ Det är förvånande att förfarandet enligt uppfin- ningen fungerar så bra, när den migrerande lösningen har ett pH-värde på 7,5. Immunglobuliners isoelektriska punkt är hög (mellan cirka pH 7,5 och pH 8,5), och under betingelser _för elektrofores vid pH 7,5 kan man vänta sig att immunglo- .bulinerna inte skulle röra sig eller att de skulla röra sig 450 205 in i membranet i den anordning, som beskrives i de brittiska patentskrifterna 1 431 887 och l 431 888. Detta händer emel- lertid erfarenhetsmässigt inte.

En lämplig buffert för den vandrande lösningen är triscitrat, och det föredrages att dess elektriska kondukti- vitet ligger i intervallet 0,75 till l msenfl, mätt via 2o°c.

Steg (31 kan utföras såsom beskrives i de brittiska patentskrifterna 1 431 887 och l 431 888. Om sålunda förfa- randet utföres säsom beskrives.i dessa patentskrifter är den vandrande lösningens vandringsriktning centrifugal, och' injektionen därav sker följaktligen vid innersidan av bärar- lösningens flöde. Flödets riktning är i allmänhet uppåt och har spiralformigt mönster på grund av effekten av rotorns rotation. Speciella fraktioner kan då samlas upp med hjälp av ett avförande system, placerat i statorn och bestående av en serie parallella labyrintplattor med avståndsbrickor. En speciell fraktion kan då passera igenom en eller flera spe- ciella labyrintplattor och sålunda in i ett eller flera upp- samlande rör. ' Uppfinningen skall nu närmare beskrivas med följan- de utföringsexempel.

Exempel Frusen human blodplasma (250 ml) med utgånget da- tum tinades snabbt och dialyserades över natt mot en vatten- haltig tris-citratlösning (l0L, pH 7,5, konduktivitet l mScmfl) vid 4° C för att sänka plasmans saltkoncentration.

Den dialyserade plasman späddes därefter cirka 1,5 gånger med en vattenhaltig tris-citratlösning så att en produkt med ett pH-värde av 7,5 och en elektrisk konduktivitet på 1,0 msenfl via 2o° c erhölls.

Ovanstående produkt värmdes därefter till 20° C och utsattes för elektrofores, såsom en vandrande lösning, med användning av en kontinuerligt elektroforetiskt separe- rande anordning av det slag, som allmänt beskrives i de brit- tiska patentskrifterna 1 431 887 och 1 431 888. Anordningen hade 29 utloppsöppningar, en statorradie på 40 mm, en rotor- U V13 4: 450 205 5 radie på 45 mm så att ett ringformigt gap om 5 mm bildades, och elektroderna var 304 mm långa. En bärarlösning med en temperatur av 20 C, bestående av vattenhaltig tris-citrat- lösning (pH 7,5, elektrisk konduktivitet ons msenfl 20° C) passerades uppåt genom den ringformiga gapet med en hastighet av 500 ml/minut, och flödet stabïliserades genom rotation av rotorn. Den vandrande lösningens injicerades in i det ringformiga gapet med en hastighet av 10 ml/minut.

Elektroforesen utfördes vid 35 amper och 27 volt, vilket gav en temperaturstegring hos bärarlösningen om 20° C, d.v.s. från 2° C.till 220 C. Elektrolyterna var ammonium- acetat (lM, pH 7,5) för katoden och samma volym av en bland- ning (pH 7,5) av ammoniumcitrat (0,2 M) och amoniumfosfat (0,l5 M) för anoden. _De speciella fraktionerna uppsamlades var och en och koncentrerades med en koncentrerande anordning med ihå- ligt fibermembran och frystorkades därefter. Varje fraktion återupprättades i en liten volym destillerat vatten och ana- lyserades med avseende på immunoglobulinkomponenterna IgG, IgM, IgA, IgD och IgE med kvantitativ immunelektrofores.

Resultaten framgår av tabell I nedan och uttryckes i form av den procentuella aktiviteten per minut per uttag. vid 450 205 6 Tabe11 I Fraktion nr. IgG IgM IgA IgD IgE 1 0,9 0,1 2 3,1 0,3 3 7,4 0,6 0,2 4 8,6 1,9 0,4 5 6,5 4,0 0,4 0,6 6 ~ 6,8 5,7 0,1 1,2 0,5 7 6,8 “ 5,9 0,2 1,7 0,8 8 10,1 9,0 0,7 5,2 1,4 9 14,1 17,5 3,4 15,6 5,2 10 10,0 16,1 6,6 20,3 7,8 11 9,6 16,4 15,0 23,4 20,2 12 6,7 9,0 17,9 12,7 24,0 13 4,5 6,4 20,0 10,8 15,6 14 3,2 4,5 21,1 5,8 15,0 15 1,9 2,7 l5,0_ 2,8 8,5 Det framgår att bortsett från IgG, som visar en bred spridning över cirka 15 fraktionsnummer, föreligger hu- vudmängden av de återstående immunglobulinkomponenterna i cirka 6 fraktionsnummer, i synnerhet 8 till 13. Det framgår även att vid pH-värdet i detta exempel (7,5) är immunglobu- linkomponenternas rörligheter tillräckligt olika för att fraktioner skall kunna uppsamlas så att andelen av vilken speciellt komponent som helst maximeras. Den sjunkande rör- ligheten är i ordningsföljd IgA, IgE, IgD, IgM och IgG. Ta- bell II nedan visar hur fraktioner kan förenas så att man erhåller blandningar av immunglobulinkomponenter med olika sammansättningar. 0)' 450 205 7 'Tabell II Förenade fraktionsnummer immunoglobulin totalt % IgG 40 1 “ 7 :gm zo IgG 45 . IgM 60 8 - ll ' IgA 25 IgD 65 IgE_ 35 IgG 15 . IgM _ 20 12 - 15 IgA 75 IgD I _ 35 IgE 65 Vissa av de erhållna fraktionerna förenades och analyserades med avseende på specifika antikroppar, nämligen anti-tetanus, anti-mässlings-, anti-rubella- och anti-po1io- 'vurs typ III. Den använda analystekniken var radialimmun- diffusion för anti-tetanus-antikroppar, hemaglutinations- inhiberingstester för anti-mässlings- och anti-rube1la-anti- kroppar och tester med vävnadskulturneutralisation för anti- polio-virus typ III-antikroppar. Resultaten framgår av ta- bell III nedan. 450 205 8 Tabell III Förenade specifika antikroppar (%/fraktion) .fraktions . _ ..... “.... .. ._ .. ..... nummer I tetanus ' mässling rubella poliovirus ' ....., . . . . . . . . . .. ... . typ III 1, 2 17,7 ' 16,6 17,5 22,6 3, 4 31,5 44,2 51,1 30,2 5, 6 23,5 17,4 20,2 16,9 7, 8 13,8 -12,5 7,2 - 12,3 » 9, 10 1 9,4 5,0 2,9 9,7 11, 12 4,1 4,4 1,2 8,4 Det framgår att antikropparna i princip föreligger i de tidiga fraktionerna upp till fraktion 6. Dessa tidiga fraktioner innehåller huvudsakligen IgG- och IgM-komponen- terna (se tabell I). Genom att kombinera speciella fraktio- ner i en pool kan sålunda beredningar av antikroppar med mycket specifik aktivitet lätt framställas, varvid de andra fraktionerna utelämnas för annat bruk. Vidare har IgM, som är ett immunglobulin med hög molekylvikt, en tendens att ha bra antibakteriella egenskaper, och fraktioner innehållande- detta immunglobulin kan användas vid behandling, där huvud- syftet är att erhålla immunitet mot vissa bakterieinfek- tioner.

Det skall framhållas att de erhållna fraktionerna inte nödvändigtvis var rena. Från fraktionsnumren 8 till 10 och uppåt förelåg sålunda andra plasmaproteiner inkluderande fibrinogen, som kan avlägsnas med andra metoder. Men detta har troligen ingen större praktisk betydelse. Albumin, det mest förekommande plasmaproteinet, var emellertid väl sepa- rerat, och alla fraktionerna var fria från albumin. å»

Claims (6)

g: 10 15 25 30 35 450 205 Patentkrav

1. Sätt att fraktionera en immunglobulinhaltig vattenlösning med elektrofores, k ä n n e t e c k n a t av att 7 (l) vattenlösningens pH-värde justeras till mellan 7 och 8,4, och dess elektriska konduktivitet till mellan l och 2 mScm_l, mätt vid 20°C, (2) produkten från steg (l) utsättes för kontinuerlig flödes- elektrofores genom att den injiceras såsom en vandrande lösning in i en andra vattenlösning, som flödar laminärt i en ringformig separationskammare såsom en bärarlösning för den vandrande lösningen, och som är stabiliserad med en vinkelhastighetsgradient, vilken bärarlösning har ett pH-värde mellan 7 och 8,4, så att både den vandrande lös- ningen och bärarlösningen är buffrade och ett konstant elek- triskt fält anbringas över den erhållna blandningen för att alstra olika förflyttning av immunglobulinkomponenterna rela- tivt varandra och relativt eventuella andra huvudbestândsde- lar i lösningen vinkelrätt mot bärarlösningens flödesriktning och de erhållna speciella fraktioner, som innehåller en eller flera av immunglobulinkomponenterna, uppsamlas.

2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att i steg (l) justeras vattenlösningens pH-värde till 7,5, och dess elekt- riska konduktivitet till 1 mscm"l, mätt via 2o°c.

3. Sätt enligt krav l och/eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att den vandrande lösningen har en elektrisk konduktivitet i intervallet 0,75 - l mscm'1, mätt vid 2o°c. _

4. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att de erhållna fraktionerna koncentreras.

5. SQ Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att den immunglobulinhaltiga vatten- lösningen innehåller blodplasma.

6. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a.t av att faktor VIII och/eller albumin fraktioneras samtidigt som de speciella fraktioner, som innehåller en eller flera immunglobulinkomponenter.