JPH03118462A - 電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は電気泳動装置に関し、さらに詳しくは核酸等生
体物質の分取、分析に好適の電気泳動装置に関する。

〔従来の技術〕

ヒト細胞に由来する遺伝子を用いる診断や分子生物学分
野の研究には、核酸等の生体高分子を分子量の差を利用
して分離、分取、定量する作業が不可欠である。上記目
的には電気泳動法が多く用いられてきている。従来、電
気泳動装置は、Ｅうボマニュアル遺伝子工学」　（村松
正實編、丸善社昭和６３年刊）１９〜２８真に記載のご
とく、泳動槽中に正負２つの電極が設けられ、それらの
間に電気泳動用担体としてポリアクリルアミドゲルやア
ガロースゲル等が用いられている。上記装置においては
、核酸等の分離対象分子が上記ゲル中を該分子の有する
電荷により、泳動する。上記分子のゲル中での泳動速度
はその分子量等分子の性質により変化するため、複数種
の分離対象分子はゲル中で分離し、分取が可能となる。

上記従来の電気泳動装置には泳動用担体としてゲルが用
いられるため、ゲルを調製する必要があるが、ゲル重合
度等が泳動条件に影響を与えることから結果の再現性は
必ずしも良好ではない。また、電気泳動後、目的の分子
を確認、定量するためには、たとえばゲルを色素染色し
分子量マーカーとの目視による比較、又はデンシトメー
タによる読み取りを必要とする。

さらに、目的の分子を回収するためには、目的分子を含
むゲルを切り出し、その後再び電気泳動等によりゲルか
らとり出す操作を必要とする。そして回収した分子を定
量するためには、該分子の溶液の吸光度や蛍光の測定を
必要とする。

〔発明が解決しようとする課題〕

前記のごと〈従来の電気泳動装置を使用した場合、得ら
れる結果の再現性、及び操作の煩雑さに問題があり、解
決が望まれた。

上記問題の解決のため、たとえば特公昭６２−１１５３
５３号公報には、チューブ上記絶縁体の１つの開口末端
を半透膜で閉塞することを主要な特徴とする電気泳動装
置が開示されているが、ここでは目的分子の分子量より
大きい分子量を有する分子、又は小さな分子量を有する
分子のいずれか一方を分離、分取するのみであり、同時
に複数種の分子を分離することはできない。また、分画
分子量の異なる２枚の膜を使用する遠心分離方式限外濾
過器が市販されている。

しかしながら、上記装置は遠心分離方式によるものであ
り、遠心分離器のロータ内で操作が行われること、さら
に濾過にともない液量の減少が生じやすいことなどから
目的分子の迅速な定量は困難である。

したがって、本発明の目的は、良好な再現性が簡便かつ
迅速な操作により得られる核酸等の分子量分画、定量、
及び回収に好適な電気泳動装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕′ 本発明者らは鋭意検討の結果、本発明の前記目的が下記
の手段により達成されることを見出した。

すなわち、本発明は、少なくとも１つの正極、少なくと
も１つの負極、及び泳動槽を有する電気泳動装置におい
て、該正極と負極との間に形成される電気泳動路中に少
なくとも２枚の分子量分画膜が分画分子量の大きい膜か
ら順に、又はその逆の順に設けられ、かつ酸膜により前
記電気泳動路が区画されていることを特徴とする。

本発明に使用される上記分子量分画膜は、好ましくは分
画可能な分子量がそれぞれ異なる少なくとも２枚の膜で
ある。

該分画膜は、異なる複数の分離対象物の分子量とその成
分内容に応じて使用されるべき種類と枚数とが適宜選択
される。

本発明においては、３種以上の異なる分子量成分を含む
混合物を分離するのに好適に使用される。

とくに、上記分子量分画膜が３枚以上使用される場合、
本発明の効果は顕著に奏される。上記分画膜は泳動槽中
で分画分子量の大きい順、又は必要に応じその逆の順に
並ぶよう配置される。また酸膜により前記泳動槽中に形
成される電気泳動路はすき間な（区画される。

本発明の前記分子量分画膜はチューブに設置されること
が好ましく、該分画膜はチューブの先端を密閉、又はチ
ューブ内部をすき間なく区画するように装着される。上
記チューブは少な（とも２本泳動槽内に設けられ、かつ
内部に電極が設けられる。

さらに前記チューブは、径の異なる少なくとも２本のそ
れが、より小さい径のチューブがより大きい径のチュー
ブの内部に位置するように設けられることが好ましい。

そして少な（とも２本の電極が、上記いずれか、好まし
くはより小さいチューブ内部と前記泳動槽内部とに設け
られる。

前記泳動槽又はチューブの少なくとも一部、好ましくは
全部は光透過性の材質で形成されていることが光学測定
手段による迅速な操作を行うために好ましい。

上記光透過性の材質は石英ガラスであることがと（に好
ましい。

〔作　用〕

本発明に使用される少なくとも２枚の分子量分画膜はそ
れぞれ固有の分画分子量を有する。すなわち、上記固有
の分画分子量により小さい分子量を有する分子は上記膜
を透過し、より大きい分子量を有する分子は透過しない
。このことにより、目的とする分子の分離、分取が可能
となる。

以下、第１図により本発明の作用をさらに説明する。

電気泳動装置１は、泳動槽４、分子量分画膜５、分子量
分画膜６、電極２．電極３、電源１４よりなる。泳動槽
４は、分子量分画膜５と分子量分画膜６により第１室４
ａ、第２室４ｂ、第３室４Ｃに分けられる。分子量分画
膜５と分子量分画膜６の表の面は、それぞれ第１室４ａ
、第２室４ｂに面している。

ここで、分子量分画膜５の分画分子量は、目的とする分
子８の分子量よりも大きく、分子量分画膜６の分画分子
量は、目的とする分子８の分子量よりも小さい。分子量
分画膜の枚数はここでは２枚であるが、目的とする分子
の種類の数に応じて変更される。第１室４ａ、第２室４
ｂ、第３室４Ｃには泳動用バッファー液７を満たしてお
く。異なる分子量の分子の混合物である試料を第１室４
ａに入れる。このバッファー液７中で試料中の分離目的
分子は正負いずれかの電荷を持つ。目的とする分子が泳
動されるように電極２、電極３に電源１４を接続し電場
をかける。例えば、負の電荷を持つ分子を泳動するとき
は、電極２を負に電極３を正に接続する。第１室４ａ中
にある分子は電極２から電極３の方向へ泳動される。電
極２から電極３の方向へ泳動されている分子のうち分子
量分画膜５の分画分子量よりも小さいものだけが分子量
分画膜５を通過し第２室４ｂへと移動する。同様に第２
室４ｂに泳動された分子のうち分子量分画膜６の分画分
子量よりも小さいものだけが分子量分画膜６を通過し第
３室４ｃへと移動する。その結果、目的とする分子８は
第２室４ｂに単離される。分子量分画膜５の分画分子量
よりも大きい分子９は第１室４ａに残り、分子量分画膜
６の分画分子量よりも小さい分子１０は第３室４ｃに移
動するので目的とする分子と分子量が異なる他の分子と
が分離される。

また、泳動槽４の壁が光透過性の材質で構成されている
場合、第１図中矢印１１の方向から入射した光は泳動槽
４の壁を通過する。光は矢印１２の方向へ通過するので
この光の強度を測定することにより第２室４ｂにある物
質の吸光度が測定される。

また、矢印１３の方向の光の強度を測定すれば、第２室
４ｂにある物質の蛍光が測定される。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によりする。

実施例１ 前記第１図の電気泳動装置を使用し、下記の操作を行っ
た。

分子量分画膜５にはアミコン社製、ＸＭ３００メンブレ
ン、（分画分子量３０万）、分子量分画膜６には、アミ
コン社製ＹＭ３０メンブレン（分画分子量３万）を使用
した。泳動槽内に泳動用バッファー液（４０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ、　２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１＋＋＋Ｍ
　ＥＤＴＡ　（ｐＨ９））を入れる。第１室４ａに試料
を加える。試料はヒトゲノムＤＮＡのＰｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅＣｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　（ＰＣＲ）による
増幅反応産物で、ヒトゲノムＤＮＡ、１２１塩基対の２
本鎖ＤＮＡ、２種の２０ｍａｒのプライマー、及びｄＮ
ＴＰなどを含む。

電極２を正に、電極３を負になるように電源１４を接続
し泳動開始する。濃度分極を防止するために、１０分に
１回１０秒程度正負を入れ替え、逆方向に電圧をかけて
泳動する。９０分後床動を停止する。膜に付着している
ＤＮＡを回収するため再度ＩＯ秒間程度逆方向に泳動す
る。電気泳動の方向と逆の方向の拡散による再混合を防
止するために、泳動後た°たちに第２室４ｂ中の液を回
収する。この液を２−ブタノールにより抽出、濃縮した
後、フェノール抽出、エタノール沈澱の操作によりＤＮ
Ａを精製、濃縮する。このＤＮＡの分子量を確認するた
めに、８％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させ、
エチジウムブロマイドで染色した。その結果、Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　（ＰＣ
Ｒ）増幅の目的産物である１２１塩基対のバンド１本の
みが認められ、ヒトゲノムＤＮＡやプライマーは認めら
れなかった。

本実施例において、ヒトゲノムＤＮＡのＰｏｌｙ−ｍｅ
ｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　（ＰＣＲ）
による増幅反応産物混合物のような、敵方塩基対よりも
大きい巨大ＤＮＡと、１００塩基対程度のＤＮＡと、プ
ライマーのような２０ｍｅｒ程度のＤＮＡとｄＮＴＰ等
の混合物の中から目的とする１００塩基対程度のＤＮＡ
をゲルを用いることなく単離できた。

第１図の構成にて、分子量分画膜をｎ枚（ｎ≧２）にす
ることで、（ｎ＋１）の成分を分離、分取することがで
きる。また、分子量分画膜が３枚以上の場合、試料を電
極のある区画の隣の区画に入れることにより、電極から
発生する泡による液の対流の影響を防ぐこともできる。

実施例２ 第２図及び第３図の電気泳動装置を使用して下記の操作
を行った。

電気泳動装置２２は、四面透明石英ガラスセルからなる
泳動槽１５と分子量分画膜１６を先端につけたチューブ
１７、分子量分画膜１８を先端につけたチューブ１９、
電極２０、電極２１からなる。

本実施例において分離法は実施例１と同様である。本実
施例では、チューブ１７、泳動槽１５、チューブ１９は
それぞれ実施例１の第１室４ａ、第２室４ｂ、第３室４
ｃに相当する。チューブ１７中の試料の分子のうち分子
量分画膜１６の分画分子量よりも小さい分子が泳動槽１
５へ移動し、さらに分子量分画膜１８の分画分子量より
も小さい分子がチューブ１９へ移動する。その結果、分
子量分画膜１６の分画分子量よりも小さく、分子量分画
膜１８の分画分子量よりも大きい分子が泳動槽１５に単
離される。

本実施例では泳動中、あるいは泳動後に泳動槽１５に検
出用の光を入射し、透過光あるいは蛍光を測定し、泳動
槽１５中の目的物を定量することができた。

本実施例では泳動中あるいは泳動後に泳動槽から目的物
を取り出すことなく光学的測定が行える。

実施例３ 第４図、第５図の電気泳動装置を用い下記の操作を行っ
た。

電気泳動装置２３は泳動槽２４と分子量分画膜２５を先
端につけたチューブ２６、分子量分画膜２７を先端に装
着したチューブ２８、電極２９、電極３０からなる。

チューブ２８はチューブ２６の中に、チューブ２６は泳
動槽２４の中に入っており、入れ子構造になっている。

ここではチューブ２６は石英ガラス製である。

本実施例において分離法は実施例１と同様である。泳動
槽２４、チューブ２６、チューブ２８はそれぞれ実施例
１の第１室４ａ、第２室４ｂ、第３室４Ｃに相当する。

泳動槽２４中の試料の分子のうち分子量分画膜２５の分
画分子量よりも小さい分子がチューブ２６内へ移動し、
さらに分子量分画膜２７の分画分子量よりも小さい分子
がチューブ２８内へ移動する。その結果、分子量分画膜
２５の分画分子量よりも小さく、分子量分画膜２７の分
画分子量よりも大きい分子がチューブ２６に単離される
。泳動後にチューブ２６を取り出し、さらにチューブ２
８を取り出したのちチューブ２６に検出用の光を入射し
、透過光あるいは蛍光を測定することでチューブ２６中
の分子を定量できた。

本実施例では泳動槽にサンプリングチューブ等の容器を
用いることができるので、電気泳動装置に適用するため
に試料をあらかじめ入っていた容器から取り出す必要が
無い。またチューブ２６は光学セルを構成しているので
泳動後に泳動槽２４からチューブ２６を取り出し、さら
にチューブ２８を取り出すことにより、液体を移し換え
ることなくチューブ２６中の物質の光学的計測ができた
。

〔発明の効果〕

本発明によれば、泳動用担体にゲルを用いる必要がない
ので、ゲルを調製する費用、時間、労力が省ける。目的
とする分子を回収するためにゲルを切り出したり、再泳
動する操作が不要になる。

目的とする分子を水溶液の状態で回収することができる
。また、分子量分画膜を用いているので泳動分離後の分
子の位置が一定しており再現性が良くなる。泳動時間が
長すぎても目的とする分子がゲルから流失しない。泳動
後の分子の位置の検出のために染色の操作をする必要が
ない。泳動後の分子の位置の検出のための装置を必要と
しない。

また、泳動槽が光学セルの機能を付与することにより泳
動後の分子を泳動槽から取り出すことなく光学的方法に
より検出することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の全体構成図を示す。 第２図は実施例２で使用した装置の断面図。 第３図は実施例２で使用した装置の見取り図。 第４図は実施例３で使用した装置の断面図。 第５図は実施例３で使用した装置の見取り図。 ５・・・分子量分画膜、６・・・分子量分画膜、１５・
・・光学セル。 第 図 １】 第２図 第３図 第４図

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１つの正極、少なくとも１つの負極、及
   び泳動槽を有する電気泳動装置において、該正極と負極
   との間に形成される電気泳動路中に少なくとも２枚の分
   子量分画膜が分画分子量の大きい膜から順に、又はその
   逆の順に設けられ、かつ該膜により前記電気泳動路が区
   画されていることを特徴とする電気泳動装置。
2. ２．前記分子量分画膜が、前記泳動槽内に少なくとも２
   本設けられたチューブの先端を密閉、又は内部を区画す
   るように装着されており、さらに該チューブ内部に電極
   が設けられている請求項１記載の電気泳動装置。
3. ３．前記分子量分画膜が、前記泳動槽内に少なくとも２
   本設けられたそれぞれ径の異なるいずれかのチューブの
   先端を密閉、又は内部を区画するように装着されており
   、かつより径の小さいチューブがより径の大きいチュー
   ブの内部に配設され、さらに少なくとも２本の電極が前
   記いずれかのチューブ内部と前記泳動槽内部に設けられ
   ている請求項１記載の電気泳動装置。
4. ４．前記泳動槽、又は前記チューブの少なくとも一部が
   光透過性の材質で形成されている請求項１、２又は３記
   載の電気泳動装置。
5. ５．前記光透過性の材質が石英ガラスである請求項４記
   載の電気泳動装置。