CN104075924A

CN104075924A - 一种适用于反刍动物骨骼肌全蛋白制备及双向电泳技术

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Publication number: CN104075924A
Application number: CN201410336583.5A
Authority: CN
Inventors: 张德权; 何凡; 陈立娟; 陈丽; 王振宇; 杨扬; 倪娜; 夏安琪; 刘越
Original assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Current assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date: 2014-07-15
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2034-07-15
Also published as: CN104075924B

Abstract

本发明涉及一种反刍动物骨骼肌的总蛋白质提取及双向电泳方法，属于生物技术领域。是针对反刍动物，特别是羊的骨骼肌中全蛋白采用双向电泳技术分离和分析，采用本技术方案对羊骨骼肌进行的实验取得了较优效果。经过反复实验证明，采用双向电泳方法对其进行分离，分离所得蛋白点多，重复性好、图谱清晰，无横纵纹现象，蛋白点规则，重复性好，是一套适用于反刍动物骨骼肌总蛋白组分析的双向电泳方法。

Description

一种适用于反刍动物骨骼肌全蛋白制备及双向电泳技术

技术领域

本发明涉及一种反刍动物骨骼肌的全蛋白制备及双向电泳技术，该技术可直接应用于羊及其他反刍动物的蛋白质组学研究。

背景技术

由于生长环境、饲喂方式等条件的不同，羊肉的品质特性与猪肉、牛肉存在差异。羊肉的粗蛋白含量(12.8％-18.6％)低于牛肉(16.2％-19.9％)，高于猪肉(13.5％-16.4％)。粗脂肪含量(16％-37％)低于猪肉(25％-37％)，高于牛肉(11％-28％)。蛋白质和脂肪含量的差异，决定了羊骨骼肌双向电泳的技术条件。

本发明的突破点就是建立羊骨骼肌的双向电泳技术体系，利用该技术可对羊骨骼肌进行蛋白质组学研究分析，也可延伸至其他反刍动物肉品质特性的研究。

发明内容

本发明目的在于提供一种反刍动物骨骼肌的全蛋白提取及双向电泳技术，是针对反刍动物蛋白采用双向电泳技术制备，该技术经反复实验证明样品制备全、重复性好、图谱清晰，是一套适用于反刍动物骨骼肌蛋白质组分析的双向电泳技术。

本发明所述的一种反刍动物骨骼肌的蛋白质双向电泳技术，按下列步骤进行：

采集反刍动物骨骼肌，液氮速冻后运回实验室，-80℃以下保存备用；

a)取出-80℃条件下保存的肌肉组织，冰冻状态下称取1g放入研钵中，加入适量液氮研磨至粉末状；

b)分装至离心管中，加入10倍体积裂解液(7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS、40mM Tris、40mM DTT、1mmol/L蛋白酶抑制剂)；

c)辅以超声破碎10s，4℃孵育2h后于10000×g低温4℃离心机中离心1h；

d)撇去上层脂肪层后将上清液分装；

e)蛋白质定量：Bradford法，测定浓度后于-80℃保存；

f)第一向等电聚焦电泳：测定蛋白质浓度后，用水化液定量调整样品浓度为1mg/mL，定量蛋白用样品水化液溶解样品，吸取450μL样品溶液加入胶条槽中。胶条(pH3-10、pH4-7)剥去保护膜后胶面向下放入胶条槽中，确保没有气泡后覆盖一层矿物油防止等电聚焦时尿素析出等。胶条采取被动水化12-16h后，置于Ettan IPGphor3等电聚焦仪中，按设定的两种不同程序等电聚焦，控制温度为20℃。每根胶条限流50μA；

g)胶条平衡：等电聚焦结束后胶条先在10mL含1％DTT的平衡缓冲液I(6M尿素、75mM Tris-HCl、29.3％甘油、2％SDS)中平衡15min，之后换用10mL含2.5％碘乙酰胺的平衡缓冲液II(6M尿素、75mM Tris-HCl、29.3％甘油、2％SDS)中平衡15min；

h)第二向SDS-PAGE电泳：将胶条转移至12％的分离胶上端，用0.5％低熔点琼脂糖封顶，以最大电压(600V)、电流(400mA)进行二向电泳。电泳参数设置为：初始功率1W/胶，运行1h后将功率提至8W/胶，直至溴酚蓝染料迁移胶底边缘后结束电泳；

i)染色：电泳结束后卸下胶板，取出胶进行染色。分别用改良考马斯亮蓝G-250染色法，银染两种方法进行染色。

j)脱色：G-250染色结束后水洗脱至背景无色透明后扫描胶图，银染用5％的乙酸洗胶。

前述的方法，其特征在于，所述的渐进式升压，初始电压为50V，然后在不少于9h的时间内缓慢的升压到500V。

前述的方法，其特征在于，所述的渐进式升压，初始电压为50V，保持6h，然后再升压至200V，再升压到500V。

前述的方法，其特征在于，所述的渐进式升压，初始电压为50V，保持6h，然后再升压至200V，保持1h，再升压到500V。

前述的方法，其特征在于，整个过程的溶液配制均需用超纯水。

前述的方法，其特征在于，样品提取阶段需要全程冰上操作或进行适当冰浴。

前述的方法，其特征在于，整个过程所需的DTT均需现用现加。

前述的方法，其特征在于，所述的反刍动物为羊。

附图说明

图1为直接升压后考马斯亮蓝染色得到胶图；

图2为渐进式升压后银染所得到的胶图。

具体实施方式

实施例1

采用Neofuge15R型台式高速冷冻离心机和美国GE双向电泳系统；

a)于屠宰场采集羊肉样品，液氮速冻运回，-80℃保存；

b)解冻后称取1g羊肉样品，去除脂类、筋膜后用加入液氮粉碎样品；

c)加入10倍体积裂解液，用细胞破碎仪超声破碎10s，4℃孵育2h后于10000×g低温4℃离心机中离心1h；

d)离心后漂去上层脂质，吸取适量清液分装备用，若脂肪过多可吸取上清液进行二次离心，以提高蛋白质的提取率；

e)蛋白质定量：采用考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量；使用T6系列紫外可见分光光度计，将蛋白质定量标准梯度稀释后用考马斯亮蓝G-250染色，波长595nm测定吸收度，用BSA做标准曲线，并测定蛋白质含量；

f)第一向等电聚焦电泳：测定蛋白质浓度后，用水化液定量调整样品浓度为1mg/mL，定量蛋白用样品水化液溶解样品，吸取500μL样品溶液加入胶条槽中。胶条(pH3-10、pH4-7)剥去保护膜后胶面向下放入胶条槽中，确保没有气泡后覆盖一层矿物油防止等电聚焦时尿素析出等。胶条采取被动水化12-16h后，置于Ettan IPGphor3等电聚焦仪中，按表1设定的程序进行等电聚焦，控制温度为20℃。

g)表1IEF参数设置：

程序步骤	模式	电压/V	时间/V
				1	Step	250	1h
2	Step	500	1h
				3	Step	1000	1h
4	Grad	10000	2h
				5	Step	10000	80000Vh
6	Step	500	任意时间

h)胶条平衡：等电聚焦结束后胶条先在10mL含1％DTT的平衡缓冲液I(6M尿素、75mM Tris-HCl、29.3％甘油、2％SDS)中平衡15min，之后换用10mL含2.5％碘乙酰胺的平衡缓冲液II(6M尿素、75mM Tris-HCl、29.3％甘油、2％SDS)中平衡15min；

i)第二向SDS-PAGE电泳使用垂直电泳，将十二烷基硫酸钠凝胶储液为30％丙烯酰胺、0.8％甲叉双丙烯酰胺，1.5mol/L pH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tirs-碱)，10％十二烷基硫酸钠(SDS)，10％过硫酸铵(APS)和1％四甲基乙二胺(TEMED)分别进行配制，然后混合，按体积比水∶丙烯酰胺∶Tirs∶SDS∶APS∶TEMED＝5∶1.6∶2∶0.3∶0.05∶0.05∶0.002配置12％的浓缩胶；

j)一向电泳结束后，进行胶条平衡，胶条转移至胶版，进入第二向电泳。电泳槽下层倒入1×电极缓冲液(1％SDS，250mM Tris，1.92M甘氨酸)，再将胶版放入，上层加入2×电极缓冲液，以最大电流和电压进行电泳，2w/胶进行1h后调整为8.5w/胶至电泳结束，整个过程以循环水，将环境温度控制在12℃；

k)再按照改良的考马斯亮蓝G-250进行染色(见图1)。

实施例2

采用Neofuge15R型台式高速冷冻离心机和美国GE双向电泳系统；

a)于屠宰场采集羊肉样品，液氮速冻运回，-80℃保存；

f)第一向等电聚焦电泳：测定蛋白质浓度后，用水化液定量调整样品浓度为1-1.5mg/mL，定量蛋白用样品水化液溶解样品，吸取500μL样品溶液加入胶条槽中。胶条(pH3-10、pH4-7)剥去保护膜后胶面向下放入胶条槽中，确保没有气泡后覆盖一层矿物油防止等电聚焦时尿素析出等。胶条采取被动水化12-16h后，置于Ettan IPGphor3等电聚焦仪中，按表2的程序等电聚焦，控制温度为20℃。

g)表2IEF参数设置：

程序步骤	模式	电压/V	时间/V
				1	Step	50	6h
2	Step	200	1h
				3	Step	500	2h
4	Grad	1000	2h
				5	Grad	3000	3h
6	Grad	5000	4h
				7	Grad	10000	4h
8	Step	10000	50000Vh

9

Step

500

任意时间

k)先用考马斯亮蓝染色，用银染法进行二次染色：50％甲醇、5％乙酸固定20min后，用50％甲醇、超纯水各洗10min，加入0.02％硫代硫酸钠溶液敏化1min，倒入预冷的0.1％硝酸银溶液于4℃孵育20min，迅速水洗后加入0.04％福尔马林进行显影，整个过程严格控制时间，脱色后进行扫描(见图2)。

从图1、图2的效果看，由于银染法灵敏度高，所得到的点较多，且点较为清晰完整，通过Image Master进行分析，银染法所得到的胶图上的点显著多于考马斯亮蓝G250法。

等电聚焦程序中表1为直接升压，表2则是渐进式升压。水化后对不同等电聚焦程序确定蛋白质的分离情况进行对比，表1为250v开始升压，另一组为50v起缓慢升压。250v组电压变化较快，各电压区间升压幅度大，盐分清除不完全，导致蛋白质分离情况较差；而从50v起缓慢升压，设置多步低电压，至500v已达到9小时，便于蛋白向IPG胶条内转移，有助于盐离子的清除，除盐效果明显。同时缓慢升至高压也有助于蛋白质的分离。

采用本技术方案羊肉的实验取得了成功，目前，经反复实验，证明实验重复性好，结果可靠，可为羊等反刍动物蛋白质组学研究提供技术范例。

Claims

1.一种反刍动物骨骼肌蛋白双向电泳方法，其特征在于按下列步骤进行：

1)采集反刍动物骨骼肌样品，用液氮罐装运回，在实验室-80℃以下保存备用；

2)称取1g反刍动物骨骼肌解冻后放入研钵中，加入液氮研磨，直到研磨成粉末状，转入预冷-20℃的15ml离心管；

3)加入10倍体积预冷的蛋白质裂解液(7M尿素、2M硫脲、40mMTris、质量体积比4％3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、1mM蛋白酶抑制剂、2％IPG buffer)，充分混合后，放在辅以超声破碎10s；

4)4℃孵育2h后于10000×g、低温4℃离心机中离心1h；

5)离心后漂去上层脂质，吸取适量清液分装备用，若脂肪过多可吸取上清液进行二次离心，以提高蛋白质的提取率；

6)蛋白质定量：采用Bradford法测定其蛋白浓度；

7)第一向等电聚焦电泳：按上样量450μg，上样体积450μL，对已定量好的蛋白样品进行稀释，上样水化液同步骤3)中的裂解液，将样品加入固相pH梯度IPG胶条聚焦盘内后，再将pH4-7，pH3-10，24cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液间的气泡，用2ml矿物油/条，覆盖胶条，进行等电聚焦电泳；所述的等电聚焦电泳中采用渐进式升压；

8)胶条平衡：将聚焦好后的固相pH梯度IPG胶条进行平衡I、II，每次平衡时间为15min，平衡缓冲液配制如下：

胶条平衡缓冲液母液：6M尿素，2％(w/v)十二烷基磺酸钠SDS，75mMpH8.8的Tris-HCl，29.3％的87％甘油，溶剂为水。

胶条平衡缓冲液I：每10ml胶条平衡缓冲液母液加入0.1g DTT；

胶条平衡缓冲液II：每10ml胶条平衡缓冲液母液加入0.25g碘乙酰胺；

9)第二向SDS-PAGE电泳：将平衡好的胶条置于胶浓度为质量体积比12％的SDS-PAGE胶上，用质量体积比0.5％、含有质量体积比0.002％溴酚蓝的低熔点琼脂糖封胶液封住顶部，按如下参数进行电泳：12℃恒温下，最大电流电压下，先用1w/胶，1.5h；再用8.5w/胶至电泳结束；

10)染色方法：采用考马斯亮蓝法和银染法进行染色。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的渐进式升压，初始电压为50V，然后在不少于9h的时间内缓慢的升压到500V。

3.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，所述的渐进式升压，初始电压为50V，保持6h，然后再升压至200V，再升压到500V。

4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述的渐进式升压，初始电压为50V，保持6h，然后再升压至200V，保持1h，再升压到500V。

5.根据权利要求1-4所述的方法，其特征在于，整个过程的溶液配制均需用超纯水。

6.根据权利要求1-5所述的方法，其特征在于，样品提取阶段需要全程冰上操作或进行适当冰浴。

7.根据权利要求1-6所述的方法，其特征在于，整个过程所需的DTT均需现用现加。

8.根据权利要求1-7所述的方法，其特征在于，所述的反刍动物为羊。