CN112794913B - 白血病检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及白血病检测试剂盒，涉及生物检测和治疗技术领域。该检测试剂盒包含抗MLAA‑34抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该抗MLAA‑34抗体可以特异性识别结合MLAA‑34蛋白，可用于通过免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)以及流式细胞术(FACS)等手段检测样品中的MLAA‑34蛋白，也可以用于MLAA‑34蛋白在细胞中的定性、定量和定位检测。

Description

白血病检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测和治疗技术领域，具体而言，涉及一种白血病检测试剂盒。
技术背景
急性白血病(acute leukemia，AL)是由于造血干/祖细胞在增殖发育过程中发生了一系列基因的异常改变、于分化过程的不同阶段发生分化阻滞、凋亡障碍和恶性增殖而引起的一组异质性的造血系统恶性肿瘤。疾病发展迅速、凶猛，因此白血病的早期快速确诊与分型对挽救患者生命是十分关键的。但由于白血病属造血干细胞异常的克隆性疾病，具高度异质性、分化差异性大等特点，传统的细胞形态学分型法仅能使70％左右的AL得以准确分型。随着细胞免疫学的深入研究、流式细胞仪的应用以及分子生物学的不断进展，将细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学相结合而形成的现代MICM分型诊断法已成为诊断急性白血病(AL)的重要手段。其中白血病的免疫学分型是利用单克隆抗体检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原以分析其表型，了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
急性单核细胞白血病(M5)是急性髓性白血病中较常见的类型，病情进展快，预后差。此前由于缺乏M5相关的特异性分子标志物，对于大多数M5患者仅能通过临床特征进行分层和预后判断。现有研究鉴定出具有特异性抗体、阳性率高的M5抗原新基因MLAA-34。
MLAA-34是CAB39L基因的新型剪接突变体，编码一个含有337个氨基酸残基的蛋白质，其主要定位于细胞膜和胞膜下。MLAA-34是一个表达在细胞膜表面的与M5发病及预后相关的新的白血病抗凋亡基因，发挥类似癌基因的功能，可作为M5早期检查和靶向治疗的潜在分子标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗MLAA-34抗体，其可特异性结合MLAA-34蛋白，具有较高的特异性，可用于通过免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)以及流式细胞术(FACS)等手段检测样品中的MLAA-34蛋白，也可以用于MLAA-34蛋白在细胞中的定性、定量和定位检测。
本发明的另一目的在于提供一种抗MLAA-34的抗体片段，其具有与上述抗MLAA-34抗体等同的效果，可特异性结合MLAA-34蛋白，具有较高的特异性。
本发明的另一目的在于提供上述抗MLAA-34抗体以及抗MLAA-34的抗体片段的在检测和治疗中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述抗MLAA-34抗体的制备方法，所制得的抗MLAA-34抗体效价高，特异性好。
本发明的另一目的在于提供一种检测MLAA-34蛋白的试剂盒。
本发明提供以下技术方案：
一种抗MLAA-34单克隆抗体，其包含轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4和5所示；此外还包含重链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、7和8所示。
在一些实施方案中，本发明所述的抗MLAA-34抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一些实施方案中，本发明所述的抗MLAA-34抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的抗体可以是全长抗体，所述全长抗体包含恒定区，所述全长抗体轻链恒定区进一步包含鼠源κ、λ链序列。所述全长抗体重链恒定区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3或IgA或IgM序列。
在一些实施方案中，本发明所述MLAA-34抗体轻链恒定区进一步优选为κ链。所述抗体重链恒定区进一步优选为IgG1。
在一些实施方式中，本发明的抗MLAA-34抗体是由上述的抗MLAA-34抗体或抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗MLAA-34抗体在检测生物样品中MLAA-34蛋白中的应用。
一种检测MLAA-34抗蛋白的试剂盒，其含有上述的抗MLAA-34抗抗体或上述的抗MLAA-34抗的抗体片段。
有益效果
本发明的有益效果主要体现在：提供一种新的抗MLAA-34抗体，其可特异性结合MLAA-34蛋白，具有较高的特异性，可用于通过免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)以及流式细胞术(FACS)等手段检测样品中的MLAA-34蛋白，也可以用于MLAA-34蛋白在细胞中的定性、定量和定位检测。为急性单核细胞白血病(M5)患者的早期诊断及预后判断、疗效观察提供了一种有效工具。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1小鼠单克隆抗体亚型鉴定
图2抗MLAA-34抗体特异性鉴定
图3流式细胞术(FACS)检测样品中的MLAA-34蛋白
具体实施方式
以下所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1.抗MLAA-34抗体制备及鉴定
用DMEM培养基培养稳定表达MLAA-34的CHO细胞，将107个CHO-MLAA-34+细胞与弗氏完全佐剂一起注射到雌性Balb/c小鼠腹膜内，进行初次免疫，随后每2周再以107个CHO-MLAA-34+细胞注射到上述雌性Balb/c小鼠腹膜内，继续免疫。最后在与骨髓瘤细胞融合前3天进行末次免疫，末次免疫以107个CHO-MLAA-34+细胞静脉内免疫。取免疫后的Balb/c小鼠脾细胞，将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用含有10％血清的Iscove培养基(0.1mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷)稀释，稀释至适宜浓度后，加入96孔板内进行培养。10天后，取细胞上清，高通量ELISA法检测上清中与MLAA-34+细胞表现出阳性反应的原代培养物。再将此孔内的杂交瘤细胞进行稀释进行亚克隆，同样以ELISA方法进行筛选，最终获得阳性杂交瘤细胞株。扩大培养后，冻存杂交瘤细胞。
实施例2.抗MLAA-34抗体亚型鉴定
根据亚类测定试剂(sigma公司)对间接ELISA筛选出的阳性鼠单克隆细胞株进行亚类测定。试剂盒中提供的酶标板上已经预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、kappa轻链、lambda轻链的特异性抗体，将实施例1中纯化的抗MLAA-34抗体样品加入样品孔中，每孔50μl，无需孵育。将1X羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔中，每孔50μl，轻轻混匀后，孵育1h。扣去孔中液体加入1XPBST洗孔3次，吸水纸吸干多余水分。加入显色液，每孔100μl，室温避光显色15min。加入100μl终止液，终止显色反应。结果显示，本发明的单克隆抗体为IgG1型鼠单克隆抗体，命名为M34-107。
实施例3.单克隆抗体的纯化
取BALB/c小鼠，在接种杂交瘤细胞前1周，经腹腔注射降植烷，0.5ml/只。1周后，每只小鼠经腹腔接种约1X106个杂交瘤细胞；7～10d后，收集腹水。将腹水经10000×g离心30min后，弃沉淀，用50％硫酸铵盐析粗提,PBS溶解，流水透析5h；用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)透析平衡过夜；上样，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱杂蛋白，用不同pH值的柠檬酸盐洗脱液洗脱，分段收集洗脱峰，浓缩后，经10％SDS-PAGE分析纯化单抗的纯度，间接ELISA法测定效价。经间接ELISA检测，抗MLAA-34抗体M34-107的效价均可达1∶108。
实施例4.单克隆抗体序列确定
从液氮中取出M34-107杂交瘤细胞细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm，5min离心去除冻存液，置于100mm孔板，培养至占培养板约80％，加入1ml Trizol试剂(Thermo公司)，并依据说明书提取杂交瘤细胞总RNA。
取2.5μg上述总RNA，加入DECP水，使体积达到11μl，加入1.0μL oligo(dT)(10μM)，加入1μL dNTPs(10mM)，混合均匀，65℃孵育5分钟后置冰上1分钟，然后加入4μL RT buffer(5×)，1.0μL DTT(100mM)，1μL Ribonuclease Inhibitor及1μL逆转录酶(takara公司)，50℃反应10min。80℃孵育10分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。设计特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补，采用常规PCR方法扩增目的基因。其中，引物序列的设计按照文献(Bodo Brocks.Species-Crossreactive scFv Against the Tumor Stroma Marker“Fibroblast ActivationProtein”Selected by Phage Display From an Immunized FAP-/-Knock-Out Mouse)进行。
测序结果显示,本发明所述的抗MLAA-34抗体M34-107的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；该抗体的重链可变区3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示；轻链可变区3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。
实施例5.抗MLAA-34抗体与MLAA-34结合能力测定
通过ELISA实验评估上述获得的抗MLAA-34抗体与MLA-34蛋白在50％有效浓度时(EC50)的结合亲和力。同时通过CN105801700B专利获得抗MLAA-34抗体-#10(其轻重链可变区序列参见该专利说明书第20页)的序列且通过重组构建的方法获得对照抗体#10。将稳定表达MLAA-34的CHO细胞传至96孔板中，细胞培养箱中过夜培养。弃去培养基并加入90ul新鲜培养基。将上述抗体分别从2000ng/ml开始,进行2倍梯度稀释,共11个浓度,稀释液(1％BSA-PBS)作对照,4℃孵育2h，吸出培养基，加入戊二醛室温孵育10min，用PBS洗涤3次后加入100ul抗鼠IgG抗体，室温孵育2h。用PBS洗涤3次后加入50μl显色液，室温避光孵育15min，加入终止液终止显色反应，用酶标仪检测样品在450nm波长处的吸光度值，并用620nm波长处的吸光度值校正。处理数据，最终确定各样品EC50值，结果见下表。
表一抗MLAA-34抗体与MLAA-34结合能力测定
名称 EC50(ng/ml)
M34-107 13.2
#10 28.7
实施例6.抗体特异性鉴定
选择高表达MLAA-34的阳性细胞株U937，用免疫印迹法检测本发明的鼠单克隆抗体的识别特异性。同时用MLAA-34阴性细胞株A549和作为对照。蛋白上样100μg，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用电转移系统(湿转，Tanon公司)将凝胶蛋白带转移到0.22μm的PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于封闭液(含1％BSA的TBS-T)中4℃，12h。加入单克隆抗体M34-107，室温孵育12h。用TBS-T洗膜后，加入1：10000稀释的羊抗鼠二抗(HRP标记，北京全式金生物技术有限公司)，室温孵育1h。TBS-T洗膜，加入ECL显色液(Thermo公司)，WesternBlot凝胶成像分析系统(Tanon公司)采集图像数据。结果如图2所示，本发明提供的单克隆抗体M34-107可特异性识别U937中分子量大小约为40kDa的条带，具有很高的特异异性反应。
实施例7.流式细胞术(FACS)检测样品中的MLAA-34蛋白
选取高表达MLAA-34阳性细胞系THP1细胞系，应用流式细胞荧光光分选技术(Fluorescence activated Cell Sorting，FACS)检测样品中MLAA-34蛋白。分离正常人外周血中PBMC细胞作为阴性对照。首先制备生物素化的抗MLAA-34抗体，用无水DMSO配制lOmg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液。用pH 8.0的碳酸盐缓冲液将抗MLAA-34抗体M34-107配制为lmg/mL。按1:2.5～20＝生物素：抗体的比率将生物素溶液加入到抗体溶液中。混匀，室温避光孵育4h。用超滤管12000g离心10分钟洗涤抗体，重复5次，即制得生物素化MLAA-34抗体。各样品孔中加入1x106个细胞，每孔中继续加入10μl生物素化抗体，混匀，室温避光孵育30min。水平离心机1800rpm低温离心4min，吸去上清，用180μL预冷PBS重悬细胞，洗涤2次。每孔中加入50μl SA-PE，混匀，室温避光孵育15min。水平离心机1800rpm低温离心4min，吸去上清，用180μL预冷PBS重悬细胞，洗涤2次。每孔中加入150ul上样液，将样品孔中液体移至Falcon管中，上样流式细胞仪检测。其中THP-1细胞中MLAA-34阳性率极显著高于PBMC细胞，PBMC细胞中几乎未检测到MLAA-34,因此结果表明抗MLAA-34抗体M34-107能与THP1细胞特异性结合，而不与正常人外周血PBMC细胞结合。
序列表
<110> 北京瀚梅生物科技有限公司
<120> 白血病检测试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Ile
20 25 30
Lys Gly Pro Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Cys Thr Glu Pro Asn Gly Phe Lys Tyr Ala Ser Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Val Gly Leu Glu Asn Lys Ile Arg Pro Leu Lys Trp Gly
100 105 110
Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Asp Ala Gly Pro Leu Val Cys Lys Glu
20 25 30
Leu Gly Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Met Ala Gly Asn Lys Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Trp Leu Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<211> 5
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1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Ile Asn Cys Thr Glu Pro Asn Gly Phe Lys Tyr Ala Ser Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Val Gly Leu Glu Asn Lys Ile Arg Pro Leu Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
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<400> 6
Asp Ala Gly Pro Leu Val Cys Lys Glu Leu Gly Ser
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Gly Asn Lys Ala Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Arg Asp Gly Trp Leu Pro Ile Thr
1 5

Claims (8)

1.一种抗MLAA-34抗体，其包含重链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4和5所示；和轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、7和8所示。
2.根据权利要求1所述的抗MLAA-34抗体，其包含如SEQ ID NO:1所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区序列。
3.根据权利要求1-2任一项所述的抗MLAA-34抗体，其特征在于：所述抗体还包含选自鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA或IgM的重链恒定区和包含选自鼠源kappa或Lambda 亚型的轻链恒定区。
4.根据权利要求3所述的抗MLAA-34抗体，其特征在于：所述抗体重链恒定区为IgG1，抗体轻链恒定区为kappa。
5.权利要求1或2所述的抗MLAA-34抗体在制备检测生物样品中MLAA-34蛋白的试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物样品为白血病患者血液。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述白血病为急性单核细胞白血病M5。
8.一种检测MLAA-34蛋白的试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1或2所述的抗MLAA-34抗体。
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