CN105861720A - 特异性针对mlaa-34的引物对和探针及荧光定量rt-pcr试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种特异性检测MLAA‑34的荧光定量RT‑PCR试剂盒及其检测方法，所述试剂盒中包括特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA‑34的引物对和探针，以及检测急性单核细胞白血病分子标志物MLAA‑34所需内参基因ABL的引物对及探针；分子标志物MLAA‑34的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。利用本发明提供的快速简便、检测结果好的试剂盒，对单核细胞白血病患者体内MLAA‑34基因表达水平进行监测，填补WHO在M5分子诊断及分型的空白并为疾病的预后提供参考。

Description

特异性针对MLAA-34的引物对和探针及荧光定量RT-PCR试剂 盒和检测方法

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，涉及一种荧光定量RT-PCR试剂盒，具体涉及一种特异性针对MLAA-34的引物对和探针及荧光定量RT-PCR试剂盒和检测方法。

背景技术

急性白血病为一种恶性血液系统疾病。2001年，WHO提倡对白血病进行MICM分型(即根据细胞形态学、免疫学、遗传学、分子生物学特征分型)，MICM分型除了更深入细致地分析白血病细胞形态学和免疫学特征外，着重提出了急性白血病中非随机染色体异常及其分子改变与特定亚型的临床表现和生物学特性之间的密切联系，强调分子诊断的重要性；并已在某些白血病类型中确定了特异基因，如急性早幼粒细胞白血病的PML-RARα基因、M2的AML1-ETO基因等。根据特异基因表达、特异染色体将急性非淋巴细胞白血病分为低危、中危、高危组，不同组别应用不同方案治疗；并分别应用WT1基因、PML-RARα基因、BCR-ABL基因对急性白血病、M3、慢性粒细胞性白血病进行分子诊断、靶向治疗、判断复发及预后等。这一现象也反映了细胞遗传－分子－临床病理之间的密切联系，为临床诊断、疗效监测和微小残留病变(MRD)检测提供了可靠的指标。

急性单核细胞白血病(M5)是急性髓性白血病(AML)中较常见的类型，在我国，M5发病率仅次于M2，占AML的23.2％-26.9％，明显高于西方国家报道的8％，大多数M5患者临床上突出表现为髓外浸润、高白细胞计数、不良染色体核型比例高、完全缓解率(CR)低、易复发、无病存活时间短。M5的异质性和复杂性决定其尚缺乏分子诊断和靶向治疗的特异性肿瘤标志物。

急性单核细胞白血病新型分子标志物MLAA-34是申请人课题组实验人员鉴定出的具有特异性抗体、阳性率高的M5抗原新基因，克隆出的其基因全长cDNA序列已在GenBank登录，序列编号为AY288977.2，通过生物信息学分析发现：MLAA-34基因是功能未知基因CAB39L的一个新的剪接变体；应用RNAi技术研究发现MLAA-34基因是和急性单核细胞白血病发生相关的新的抗凋亡分子，慢病毒介导的过表达MLAA-34的U937细胞可显著抑制细胞凋亡，并增加潜在的致瘤性。免疫共沉淀，鸟枪法测序和生物信息学分析示71种蛋白质涉及细胞凋亡或增殖的生物过程和信号通路，申请人课题组已应用SYBR Green Ⅰ荧光染料法的实时荧光定量RT-PCR及Western Blot技术对急性单核细胞白血病组、非M5白血病组及正常健康组的外周血单个核细胞(PBMNCs)中mRNA表达情况进行了检测，发现MLAA-34基因的mRNA及蛋白水平在AML-M5型白血病细胞中都是特异性高表达的，在非M5白血病组及正常健康组中为低表达或不表达。

白血病MRD的残留白血病细胞数量少，一般方法难以检测，因此需要应用敏感度高的方法检测。目前，可通过检测已确定的特异分子标记物的基因表达对某些类型白血病进行分子诊断及病情监测，其特异性强、敏感度高，是MRD检测的理想分子标志。近几年发展起来的实时荧光定量PCR技术显著提高了PCR产物定量的准确性，且操作简单，在MRD检测中显示巨大的作用。实时荧光定量PCR在PCR扩增的同时检测PCR产物，因此确保在PCR扩增的指数期准确定量，且PCR后无须再对样本进行操作，极大地减少了PCR产物的污染机会。目前，临床上已广泛应用实时荧光定量PCR技术检测白血病标志分子BCR-ABL(慢性粒细胞白血病)、AML1-ETO(急性粒细胞白血病部分分化型)、PML-RARα(急性早幼粒细胞白血病)、HOX11(T细胞性急性淋巴细胞白血病)等以进行相应类型白血病的分子诊断、疗效判断及MRD检测等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性检测急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法，该试剂盒特异性好，灵敏度高，能够准确的检测人体中特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的表达水平；检测方法简单、易操作。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的引物对和探针，特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。

一种特异性检测MLAA-34的荧光定量RT-PCR试剂盒，包括特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的引物对和探针，以及检测急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34所需内参基因ABL的引物对及探针；其中：

特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ IDNO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；

内参基因ABL的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示。

试剂盒内包括：1)待检测标本；2)阴性对照品；3)阳性参考品；

4)分子标志物MLAA-34反应液；5)内参基因ABL反应液；6)2×Mix；试剂盒中的试剂量满足20人份测试使用。

1人份测试用量的目的基因荧光定量PCR反应体系包括：

cDNA模板 5ul；

MLAA-34反应液 7ul；

2×Mix 13ul；

其中，cDNA模板为提取的待检测标本逆转录反应产物；

MLAA-34反应液中包含3ul上游引物、3ul下游引物及1ul探针。

1人份测试用量的内参基因反应体包括：

cDNA模板 5ul；

内参基因ABL反应液 7ul；

2×Mix 13ul；

其中，cDNA模板为提取的待检测标本逆转录反应产物；

内参基因ABL反应液中包含3ul上游引物、3ul下游引物及1ul探针。

所述的阴性对照品采用工艺用水；所述的阳性参考品采用质粒混合液，包括1×10²～1×10⁶拷贝的MLAA-34参考品，以及1×10²～1×10⁶拷贝的ABL参考品。

利用上述特异性检测MLAA-34的荧光定量RT-PCR试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：

1)采集人体骨髓或外周血1.5～2ml，EDTA抗凝，低温冷藏备用；

2)将采集的血液标本在2h内用Trizol法及经典氯仿法抽提单核细胞RNA，DEPC水溶解，-80℃保存；

3)采用商用试剂盒对步骤2)获得的样本RNA进行逆转录反应，得到cDNA模板；

4)将cDNA模板、MLAA-34反应液及2×Mix混合后，组成反应体系，同时，cDNA模板、内参基因ABL反应液及2×Mix混合后，组成该样本的内参反应体系；再制作标准曲线，然后采用荧光定量PCR法检测样本骨髓或外周血中的分子标志物MLAA-34的相对表达量。

荧光定量PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性15s，60℃退火延伸1min，共45个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明将利用TaqMan探针，分别扩增目标基因和管家基因ABL，以管家基因作为内标对目标基因的定量结果进行校正，消除反转录以及样品制备过程产生的人为差异对定量结果的影响，建立荧光定量RT-PCR方法检测MLAA-34基因表达水平的方法。利用本发明提供的快速简便、检测结果可靠、敏感的试剂盒，对单核细胞白血病患者体内MLAA-34基因表达水平进行监测，敏感度、特异性均较高，且操作方法简单，无需跑凝胶电泳，能为急性单核细胞白血病的辅助诊断及后续治疗结果的判定提供依据。

附图说明

图1为样本RNA完整度测定结果；

图2为6例样本及标准品PCR扩增曲线；

图3为MLAA-34与内参基因标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明的特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的引物对如SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.2所示，探针如SEQ ID NO.3所示。

具体的引物、探针信息如下：

MLAA-34F:5’-GCAAGCTGTGGTTGATCAGTG-3’

MLAA-34R:5’-GATGAAGTAGCCTTTATCGTC-3'

MLAA-34P:FAM-5’-ACAACTTCTAAGGAGGCAACCTC-3-TAMRA；

检测分子标志物MLAA-34所需的内参基因ABL，其特异性引物对如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5所示，探针如SEQ ID NO.6所示。

具体的引物、探针信息如下：

ABL F:5'-CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3'

ABL R:5'-GCCTTGGCCATTTTGGTT-3'

ABL P:FAM5'-TGGTGTGAAGCCC-3'TAMRA。

所述试剂盒的统一浓度及1人份测试用量的统一标准为：

该荧光定量RT-PCR检测方法包括如下步骤：

1)血液标本的收集：采集人体骨髓或外周血1.5-2ml，EDTA抗凝，低温冷藏；

2)标本RNA的提取：标本采集后2h内用Trizol法及经典氯仿法抽提单核细胞RNA，DEPC水溶解，-80℃保存；

3)逆转录反应：采用商用试剂盒对步骤2)获得的样本RNA进行逆转录反应，得到cDNA模板，具体每个样本RNA用量为10ul，按照试剂盒说明书进行；

4)荧光定量PCR法检测样本骨髓或外周血中新型分子标志物MLAA-34的相对表达量。

5)统计分析：检测599例样本，包括骨髓血样本385例(初发M5 42例、初发M4 31例、初发AML 44例、初发ALL 32例、其他恶性肿瘤36例、其他非肿瘤疾病41例、完全缓解M5 33例、复发M5 27例，完全缓解M4 32例、完全缓解其他类型AML 34例、完全缓解ALL33例)及外周血样本214例(初发M5 32例、完全缓解M5 30例，复发M5 22例，初发M4 34例、初发其他类型AML 31例、初发ALL 34例、其他非肿瘤疾病31例)后对检测结果行ROC曲线分析后发现对于骨髓标本，当MLAA-34相对表达量≥1.27E-3时，可诊断为初发M5，此时诊断的敏感度为1，特异度为0.815；当骨髓单个核细胞MLAA-34表达量≤2.015E-5时，可判断为为M5CR，此时诊断的敏感度为0.833，特异度为0.733；当骨髓单个核细胞MLAA-34表达量≥2.535E-3时，可诊断为M5复发，此时诊断的敏感度为0.929，特异度为0.918，诊断准确度较高。对于外周血标本，当单核细胞MLAA-34相对表达量≥1.265E-3时，可诊断为初发M5，此时该检验方法的敏感度为0.917，特异度为0.8；当患者外周血单个核细胞MLAA-34表达量≤2.014E-5时，可诊断为M5CR，诊断的敏感度为0.833，特异度为0.725；当患者外周血单核细胞MLAA-34相对表达量≥2.411E-3时，可诊断为M5复发，此时诊断试剂盒的敏感度为0.96，特异度为0.88。

具体的，荧光定量PCR反应体系：

特异性针对急性单核细胞白血病新型分子标志物MLAA-34的荧光定量PCR反应体系及内参基因ABL反应体系均为：

取步骤3)所述的逆转录反应产物5u，2×Mix13ul，上下游引物各3ul(5uM)，探针1ul(5uM)，体系共25ul，另取浓度分别为1×100拷贝/ul、1×1000拷贝/ul、1×10000拷贝/ul、1×100000拷贝/ul、1×1000000拷贝/ul的MLAA-34标准品5u，2×Mix13ul，上下游引物各3ul(5uM)，探针1ul(5uM)，体系共25ul，分别加样进行PCR反应，内参基因反应体系同上。

取如下各种反应液及Mix，室温融化并震荡混匀后，短暂离心数秒。MLAA-34反应液、内参反应液体系1人份均按表1所示，各反应液成分如表2所示。

表1扩增试剂需求表

表2试剂主要成分表

PCR扩增：适用于各种拥有实时荧光定量功能、具有FAM通道的PCR仪，扩增条件如表3所示：

表3 PCR反应扩增参数

基线的确定：

软件默认设定3-15个循环的平均荧光信号为基线。在实验中，一般选择曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，可根据实际情况自行酌情调整。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经有明显增长的地方。根据实验曲线走势的不同，一般start值可选择在3-8之间；stop值选择以起点与终点之间最好能间隔8个循环以上为原则，以更好满足统计基线标准偏差的数学要求。阈值的确定：在阴性对照物扩增的情况下，阈值设定在无扩增曲线样本的最高点，即高于无扩增增长曲线(即在结果分析“Component”栏中无拐点出现)的最高点，切阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。

结果判定：

阳性参考品1-5在MLAA-34和内参反应中分别设定为：1×10⁶，1×10⁵，1×10⁴，1×10³，1×10²，在扩增结束后，用获得的相应两条标准曲线，分别得到各标本MLAA-34的检测浓度(A)和内参基因ABL的检测浓度(B)，报告为MLAA-34的检测浓度(A)和内参基因的检测浓度(B)的比值即(A/B)×100％。

实施例1

本实施例中提供特异性针对单核细胞白血病新型分子标志物MLAA-34检测试剂盒用于检测患者骨髓血或外周血6例未知样本的操作步骤。

1、试剂准备：

根据待测样本数量，取11份(6人份待测样本+5份MLAA-34阳性标准品)×7ul(77ul)MLAA-34反应液与11人份×13ul 2×MIX液(143ul)充分预混成PCR-mix1(220ul)，同理11份(6人份待测样本+5份内参标准品)×7ul(77ul)内参反应液与11人份×13ul 2×MIX液(143ul)充分预混成PCR-mix2(220ul)，分别瞬时离心后备用。

2、样本处理和加样：

1)采集20人份骨髓或外周血1.5-2ml，EDTA抗凝，低温冷藏；

2)Trizol法提取样本中单核细胞RNA：取和样本等体积的冷藏淋巴细胞分离液加入离心管静置至室温，缓慢小心吸取骨髓/外周血标本距离淋巴细胞分离液液面1cm高度缓慢滴加，注意上下液面勿混匀；2200rpm离心20min；小心吸取中间的白膜层于EP管中；加入足量的PBS液吹打混匀，1200rpm离心5min，弃去上清液，重复此步骤2-3遍；加入1mL Trizol吹打混匀后于-80℃保存；

3)取上述-80℃保存的RNA提取液100ul，加入300ulRNA抽提液用力彻底混匀，加入200-400ul氯仿，混匀，室温放置5分钟。15000rpm离心10分钟，离心后吸取无色上清液200-300ul，并转移到1.5ml离心管中。在上述装有上清液的1.5ml离心管中加入1-1.5倍体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀后室温放置10分钟。15000rpm离心10分钟，吸弃上清；在上述离心管中，加入700ul预冷的无水乙醇，15000rpm离心10分钟，吸弃上清。室温10分钟，使乙醇挥发。加入50ul DEPC-ddH₂O混匀溶解，以此作为相关PCR反应的模板；

4)将上述样本RNA经紫外分光光度计检测，结果如表4所示，所测A260/280比值均在1.8到2.0之间，表示RNA纯度良好，无明显有机溶剂及蛋白质、DNA残留。

用Trozil试剂经典法提取的样本RNA经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色后电泳产物28s 18s 5s条带清楚无弥散，28s/18s约等于2：1，最上方无DNA污染条带，RNA完整性良好，无明显降解及DNA污染，如图1所示。

表4样本RNA纯度测定表

4)取上述PCR反应模板10ul，按逆转录试剂盒(购于上海源奇生物科技有限公司)说明书进行逆转录反应；

5)分别取上述同一逆转录反应产物5ul/人份加入2个不同PCR反应管中，取重组MLAA-34阳性标准品及ABL标准品(浓度梯度依次为1×10²～1×10⁶拷贝/ul)各5ul分别加入5个不同PCR反应管中，取阴性对照物5ul加入2个PCR反应管中，静置10min；

6)将上述两管相同逆转录反应产物PCR反应管及阴性对照物PCR反应管中分别加入20ul PCR-mix1与PCR-mix2，同理在MLAA-34阳性标准品及ABL标准品反应管中分别加入20ul PCR-mix1与PCR-mix2，吸打混匀2-3次，盖上管盖(去除气泡)，2000rpm离心30s。

3、在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增：

1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称；

2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reporter:FAM，Quencher:None)检测MLAA-34与ABL表达量；参比荧光设置为none；

3)荧光定量PCR反应条件为：

94℃预变性3min，94℃变性15s，60℃退火延伸1min，共45个循环；

4)结果分析：

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线和阈值线的交点，称为Ct值(即cycle threshold,指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)，扩增曲线如图2所示，标准曲线如图3所示。

使用仪器自带的软件分别对MLAA-34与内参基因ABL的标准品绘制标准曲线，同时计算样本MLAA-34与ABL基因表达量并导出到EXCEL表格中，MLAA-34表达量设为a，ABL表达量设为b，计算a/b值，结果设为c，即为样本MLAA-34相对表达量，结果如表5所示。

表5样本MLAA-34相对表达量测定

对所测之值进行如下判定：

对于骨髓标本，样本1目的基因相对表达量≥1.27E-3，可诊断为初发或复发M5，样本2、3、4、5、6均为非M5。

本发明通过Taqman探针荧光定量PCR法对人体内单核细胞白血病新型分子标志物MLAA-34表达水平进行检测，对于骨髓血标本，当此试剂盒用于M5临床诊断时，诊断的敏感度为1，特异度为0.815；当此试剂盒用于判断M5疗效时，诊断的敏感度为0.833，特异度为0.733；当此试剂盒用于判断M5复发时诊断的敏感度为0.929，特异度为0.918，诊断准确度较高。对于外周血标本，当此试剂盒用于M5临床诊断时，该检验方法的敏感度为0.917，特异度为0.8；当此试剂盒用于判断M5疗效时，诊断的敏感度为0.833，特异度为0.725；当此试剂盒用于判断M5复发时，诊断的敏感度为0.96，特异度为0.88。此试剂盒检测敏感度、特异度较高且操作方法简单，能为急性单核细胞白血病的辅助诊断及后续治疗结果的判定提供依据。

Claims (8)

1.一种特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的引物对和探针，其特征在于，特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种特异性检测MLAA-34的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的引物对和探针，以及检测急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34所需内参基因ABL的引物对及探针；其中：

特异性针对急性单核细胞白血病分子标志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；

内参基因ABL的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示。

3.如权利要求2所述的特异性检测MLAA-34的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，试剂盒内包括：1)待检测标本；2)阴性对照品；3)阳性参考品；4)分子标志物MLAA-34反应液；5)内参基因ABL反应液；6)2×Mix；试剂盒中的试剂量满足20人份测试使用。

4.如权利要求3所述的特异性检测MLAA-34的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，1人份测试用量的目的基因荧光定量PCR反应体系包括：

cDNA模板 5ul；

MLAA-34反应液 7ul；

2×Mix 13ul；

其中，cDNA模板为提取的待检测标本逆转录反应产物；

MLAA-34反应液中包含3ul上游引物、3ul下游引物及1ul探针。

5.如权利要求3所述的特异性检测MLAA-34的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，1人份测试用量的内参基因反应体包括：

cDNA模板 5ul；

内参基因ABL反应液 7ul；

2×Mix 13ul；

其中，cDNA模板为提取的待检测标本逆转录反应产物；

内参基因ABL反应液中包含3ul上游引物、3ul下游引物及1ul探针。

6.如权利要求3所述的特异性检测MLAA-34的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照品采用工艺用水；所述的阳性参考品采用质粒混合液，包括1×10²～1×10⁶拷贝的MLAA-34参考品，以及1×10²～1×10⁶拷贝的ABL参考品。

7.利用权利要求3～6中任意一项所述的特异性检测MLAA-34的荧光定量RT-PCR试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取采集的人体骨髓或外周血1.5～2ml，用EDTA抗凝，低温冷藏备用；

2)将采集的血液标本在2h内用Trizol法及经典氯仿法抽提单核细胞RNA，DEPC水溶解，-80℃保存；

3)采用商用试剂盒对步骤2)获得的样本RNA进行逆转录反应，得到cDNA模板；

4)将cDNA模板、MLAA-34反应液及2×Mix混合后，组成反应体系，同时，cDNA模板、内参基因ABL反应液及2×Mix混合后，组成该样本的内参反应体系；再制作标准曲线，然后采用荧光定量PCR法检测样本骨髓或外周血中的分子标志物MLAA-34的相对表达量。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性15s，60℃退火延伸1min，共45个循环。