CN110195101B - 辐射敏感基因作为辐射生物剂量计的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多个辐射敏感基因的组合作为辐射生物剂量计在辐射剂量估算中的应用。具体而言,本发明涉及5‑13个不同辐射敏感基因的组合作为辐射生物剂量计在辐射剂量估算中的应用,包括基于所述5‑13个不同辐射敏感基因的组合来制备用于对辐射剂量进行估算的试剂盒、微阵列、以及利用所述试剂盒和微阵列对辐射剂量进行估算的方法。与包括染色体畸变分析在内的传统方法相比,该辐射生物剂量计及应用方法具备简便、快速、高通量等优势,并且估算剂量的准确性较高,特别适合核事故与辐射事故下大范围人群样本的辐射剂量估算。
Description
技术领域
本发明属于放射生物剂量学领域,涉及多个辐射敏感基因的组合作为辐射生物剂量计在辐射剂量估算中的应用。具体而言,本发明涉及5-13个不同辐射敏感基因的组合作为辐射生物剂量计在辐射剂量估算中的应用,包括基于所述5-13个不同辐射敏感基因的组合来制备用于对辐射剂量进行估算的试剂盒、微阵列、以及对辐射剂量进行估算的方法和应用。
背景技术
随着核能与电离辐射的广泛应用,核事故和辐射事故时有发生,在事故发生的早期,可能会有很多人受到照射,这种情况下如何快速、准确和高通量地判断大范围人群中的人员是否受到辐射并估算人员的辐射剂量,以便制定准确的应对措施、指导突发事件的应急救援和受照人员的临床诊断和治疗,仍是当今放射生物剂量学亟待解决的重要课题之一。
目前,常用的辐射剂量估算方法包括物理测量法和生物剂量计测量法等。就前者而言,鉴于核事故和辐射事故通常具有发生突然及影响范围大等特点,难以及时为如此众多的人员配备合适的物理辐射剂量计并进行检测和分析。就后者而言,目前常用的生物剂量计有早熟凝聚染色体片段分析、微核分析、染色体畸变分析以及体细胞基因位点突变分析等,但这些技术相对复杂,需要具备专业知识并经过训练的专业人员才能够顺利开展。其中,染色体畸变分析是目前被国际IAEA认可的最可靠、稳定、灵敏的方法,被视为“金标准”。然而,染色体畸变分析仍存在试验周期长、技术要求高等缺点,不能适应短时间对大量受试者的受照状况做出准确判断的要求。因此,寻找检测方法简单、分析快速、特异性高的生物剂量计一直是放射生物学和辐射防护学领域的研究热点。
随着利用基因芯片技术对电离辐射诱导基因表达变化的研究的不断深入,已发现电离辐射能够诱导某些核基因表达发生变化,并呈现一定的剂量-效应关系和时间变化规律,因此,探索电离辐射诱导基因表达的变化作为生物剂量估算指标成为目前的研究热点。另一方面,由于基因表达水平测定可通过实时荧光PCR等现代分子生物学技术进行高通量的定量测定,非常适于核事故和辐射事故甚至恐怖袭击事故中的快速辐射剂量估算,因而辐射敏感基因的表达水平测定有着广泛的应用前景。
近年来,虽然很多研究已对一些辐射敏感基因进行了初步探索,确定了某些单基因mRNA水平变化的剂量-效应关系和时间响应范围,但由于本底变异程度大、不同实验室结果不一致、剂量响应和时间响应范围窄等原因,在实际应用中受到限制。目前还没有将辐射敏感基因表达水平用作辐射生物剂量计的全面系统的研究和验证,尚未开发出可作为辐射生物剂量计用于辐射事故现场的辐射敏感基因组合。
发明内容
为解决上述课题,本发明通过检测正常人外周血在受到电离辐射作用后其中所含基因的表达量变化情况,初步筛选出上百个存在辐射应答的基因;进而,本发明对上述初筛得到的基因进行了进一步研究,获得了在受到电离辐射作用后显示出良好的剂量-效应关系并可绘制出R2较高(拟合曲线的R2值为0.6以上)的剂量-效应曲线的13个辐射敏感基因(PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR);最后,本发明利用统计学方法,基于上述13个辐射敏感基因确定了用于作为辐射生物剂量计估算辐射剂量的辐射敏感基因组合,并通过体内实验以及体外实验证实了其估算辐射剂量的准确性,解决了现有辐射剂量估算方法中对分析技术要求高、耗时长、准确性低等问题,从而完成了本发明。
根据第一个方面,本发明提供了一种用于对辐射剂量进行估算的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含辐射敏感基因检测试剂,其中,所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;优选地,所述辐射敏感基因进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个。
根据第二个方面,本发明提供了辐射敏感基因检测试剂在制备用于对辐射剂量进行估算的试剂盒中的用途,其特征在于,所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;优选地,所述辐射敏感基因进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个。
根据第三个方面,本发明提供了一种用于对辐射剂量进行估算的微阵列,其特征在于,所述微阵列包含辐射敏感基因检测探针,其中,所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;优选地,所述辐射敏感基因进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个。
根据第四个方面,本发明提供了辐射敏感基因检测探针在制备用于对辐射剂量进行估算的微阵列中的用途,其特征在于,所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;优选地,所述辐射敏感基因进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个。
根据第五个方面,本发明提供了辐射敏感基因作为辐射生物剂量计对辐射剂量进行估算的用途,其特征在于,所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;优选地,所述辐射敏感基因进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个。
根据第六个方面,本发明提供了一种利用辐射敏感基因作为辐射生物剂量计对辐射剂量进行估算的方法,其特征在于,所述方法包括检测人外周血中辐射敏感基因的表达水平的步骤,其中,所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;优选地,所述辐射敏感基因进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个。
有益效果
本发明建立的用于快速估算辐射剂量的作为辐射生物剂量计的辐射敏感基因组合的优点在于可通过分子生物学方式(例如实时荧光定量PCR技术)批量检测多个辐射敏感基因的相对表达水平,利用所确定的辐射敏感基因组合可以在可能受照人群血样收集后快速准确地估算出辐射剂量。与包括染色体畸变分析在内的传统方法相比,该辐射生物剂量计及应用方法具备简便、快速、高通量等优势,并且估算辐射剂量的准确性较高,特别适合核事故与辐射事故下大范围人群样本的辐射剂量估算。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式中详细说明。
附图说明
图1A-图1M分别示出了13个辐射敏感基因(PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR)在照射后24h的相对表达情况。
图2A-图2E分别示出了利用5个辐射敏感基因(PCNA、CDKN1A、TNFSF4、ASTN2和FDXR)进行单基因辐射剂量估算所得到的估算辐射剂量与真实辐射剂量的比较。
图3A和图3B分别示出了利用本发明建立的基于不同性别的辐射敏感基因组合(图3A)与染色体畸变分析(图3B)所得到的估算辐射剂量与真实辐射剂量的比较。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
本发明所涉及的可作为辐射生物剂量计使用的“辐射敏感基因”是指存在辐射应答且在受照后可显示出良好的剂量-效应关系的基因。
在本发明的实施方式中,所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;在本发明的优选实施方式中,所述辐射敏感基因进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个,例如,所述辐射敏感基因可进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或全部8个。
当涉及利用辐射敏感基因的组合作为辐射生物剂量计对不同性别人群的辐射剂量进行估算时,在本发明一些优选的实施方式中,所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2和PHPT1;在本发明另一些优选的实施方式中,所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR。然而,本发明并不限于此。
在利用本发明的辐射敏感基因组合对辐射剂量进行估算时,可通过如下方式进行:(1)按照常规方法培养离体细胞(例如来自人外周血的细胞),将离体细胞置于已知辐射强度的环境中接受辐照,然后在两个以上时间点采集辐射照射后的离体细胞,测定其中的辐射敏感基因的表达水平,获得该离体细胞的接受的辐照剂量和各辐射敏感基因的表达水平的关系的标准曲线;以及(2)收集接受了待测剂量的辐射照射的离体细胞(例如来自人外周血的细胞),测定其辐射敏感基因的表达水平,根据步骤(1)获得的标准曲线计算得到该离体细胞所接受的辐射剂量。在根据本发明的实施方式中,所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;优选地,所述辐射敏感基因进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个,例如,所述辐射敏感基因可进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或全部8个。在根据本发明的一些优选实施方式中,所述辐射敏感基因可包括上文所详细列举的组合。
在根据本发明的一些优选实施方式中,所述离体细胞可来源于人外周血。获得此类离体细胞的方法是本领域技术人员所公知的。
对辐射敏感基因的表达水平进行高通量测定的方法主要有基因芯片、深度测序和qRT-PCR等。这三种方式各有其优势和劣势:例如,基因芯片是固定在固体基片上的大量DNA序列的微阵列,通过探针与靶序列杂交的荧光信号进行分析,但通过基因芯片进行表达谱分析存在假阳性率比较高的可能;深度测序能够解决上述问题,但该方法需要的RNA量大,需要大量体液来进行RNA提取,同时其花费大,需要进行比较复杂的数据分析,耗时较长,会限制多样本在发现期的纳入;qRT-PCR是三种方法中耗时最短且准确度相对较高的方式,该方法需要合适的内参进行校正。在根据本发明的一些实施方式中,由于本发明证实了β-actin基因和B2M基因的表达水平不受辐射作用影响,可保持稳定的表达水平,因而选择β-actin基因和B2M基因作为qRT-PCR方法中的内参基因。
本发明的试剂盒和微阵列用于对辐射剂量进行估算,所述试剂盒和微阵列包含辐射敏感基因检测试剂(例如但不限于辐射敏感基因检测引物和辐射敏感基因检测探针),所述辐射敏感基因包括PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;优选地,所述辐射敏感基因进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个,例如,所述辐射敏感基因可进一步包括DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或全部8个。在根据本发明的一些优选实施方式中,所述辐射敏感基因可包括上文所详细列举的组合。
不受限制地,可将辐射敏感基因检测引物或辐射敏感基因检测探针用于制备本发明的对辐射剂量进行估算的试剂盒或微阵列,例如,本领域技术人员可基于表1中所示的引物序列来制备本发明的试剂盒或微阵列,但本发明并不限于此。本领域技术人员可容易地获得可对本发明的辐射敏感基因的表达水平进行检测的合适试剂。另外,本发明的用于对辐射剂量进行估算的试剂盒和微阵列中还可包含对内参基因(例如β-actin基因和B2M基因)进行检测的试剂。同样,本领域技术人员可容易地获得可对本发明的内参基因的表达水平进行检测的合适试剂。
此外,本发明的试剂盒可进一步包含DNA纯化试剂(如NucleonTM试剂盒、裂解缓冲液、蛋白酶溶液等);PCR试剂(如反应缓冲液、热稳定聚合酶、dNTP等),但本发明并不限于此。用于对辐射敏感基因进行检测的探针可用不同的可检测工具来标记。这种可检测工具是指可缀合、连接或附加至探针以提供可定量的指标(如密度、浓度、数量等)的化合物、生物分子或仿生材料。可检测工具的实例包括荧光标记物、发光材料、生物发光材料和放射性同位素,但本发明并不限于此。可检测工具的详细信息和选择对本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例
以下将通过实施例详细描述本发明提供的多个辐射敏感基因的组合作为辐射生物剂量计在辐射剂量估算中的应用。除非特别说明,以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品,所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均按常规方案进行。例如,可按Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))所记载的进行。以下实施例仅为说明目的而提供,并不旨在对本发明的范围进行限制。
实施例1:辐射敏感基因的初步筛选
利用基因芯片技术检测正常人外周血在受到电离辐射作用后其中所含基因的表达量变化情况,初步筛选出上百个存在辐射应答的基因。进而,对上述初步筛选得到的基因进行进一步研究,获得了在受到电离辐射作用后显示出良好的剂量-效应关系并可绘制出R2较高的剂量-效应曲线的13个辐射敏感基因(即,PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR)。
上述初步筛选中对这13个辐射敏感基因所做研究的详情如下:
1.引物设计与合成
根据GenBank数据库中的基因信息,设计13个辐射敏感基因(PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR)和两个内参基因(β-actin和B2M)的跨外显子引物序列(SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.30),并由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列及其它相关信息见表1。
表1.辐射敏感基因信息及引物序列
2.血样采集与照射
在签署知情同意书的前提下,采集30例健康人外周血,男女各半(其中20~29岁8人;30~39岁8人;40~49岁8人;50岁以上6人),每人收集静脉血样12ml,平均分装至8个6ml肝素锂抗凝真空采血管内备用,于室温下进行60Coγ照射,剂量率为1Gy/min,剂量点分别为0、0.5、1、2、3、4、6和8Gy。照后将每个剂量点的血样接种于含有8ml 10%胎牛血清的RPMI1640培养瓶中(每瓶约含1.5ml全血),置于37℃恒温培养箱中培养24h。
3.细胞总RNA提取与cDNA合成
照后预定时间点收集细胞,按照RNAprep Pure血液总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)产品说明书提取总RNA,测定纯度(A260/A280为1.8~2.0)并定量。应用高容量反转录试剂盒(美国Thermo Fisher公司)合成cDNA,取100ng-200ng RNA,加入20μl反应体系中,经25℃10min、37℃120min、85℃5min后终止反应,-20℃冰箱保存。
4.实时定量PCR检测
反应体系为20μl:10μl 2×SYBR green I,2μl cDNA模板,上下游引物共0.5μl和7.5μl双蒸水。反应条件:95℃预变性10min后进行下述40个循环:95℃变性15s,60℃退火和延伸共1min。每个样品设置3个平行样,在每次实时定量PCR反应后进行熔解曲线分析,以排除引物二聚体的影响,同时设立无引物空白对照组,重复3次实验。
5.PCR数据处理
利用Applied Biosystems 7500Sequence Detection Software(SDS)进行结果分析。用2-ΔΔCt法,以β-actin基因和B2M基因为内参基因,相对定量经8个剂量点辐照并培养24h后各辐射敏感基因的相对表达变化情况。其中,内参基因基因相对表达量以表示,采用SPSS 25.0软件进行数据分析,并进行多元线性逐步回归和曲线拟合分析,P<0.05表示差异有统计学意义(图1)。
由图1可知,PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR这13个辐射敏感基因的相对表达水平在受到电离辐射作用后均显示出良好的剂量-效应关系(拟合曲线的R2值均为0.6以上),初步表明这13个辐射敏感基因具备作为辐射生物剂量计对辐射剂量进行估算的潜力。
实施例2:作为辐射生物剂量计估算辐射剂量的辐射敏感基因组合
1.引物设计与合成
使用与实施例1中相同的针对13个辐射敏感基因以及2个内参基因的引物(如表1所示)。
2.血样采集与照射采用与实施例1相同的方式。
3.细胞总RNA提取与cDNA合成采用与实施例1相同的方式。
4.实时定量PCR检测采用与实施例1相同的方式。
5.PCR数据处理采用与实施例1相同的方式。
6.辐射敏感基因组合的建立
应用多元逐步回归法建立辐射敏感基因组合,其基本原理是:按自变量对因变量作用大小,由大到小依次逐个引入回归方程;每引入一个自变量,都对回归方程中每一个(包括刚被引入的)自变量的作用进行显著性检验;当发现一个或多个自变量的作用无显著性意义时,即行剔除;每剔除一个自变量后,也还要对仍留在回归方程中的自变量逐个进行显著性检验;如果发现回归方程中还存在作用无显著性意义的自变量时,再予以剔除,直至没有自变量可引入回归方程中并且也没有自变量可以从回归方程中剔除为止(表2)。
表2.逐步回归法建立的基于不同性别的辐射敏感基因组合的相关系数
注:“—”表示无数据;
回归系数b、标准误差Sb、t值和P值是对各自变量与因变量之间是否存在线性关系,即对各自变量的回归系数b是否等于0进行t检验;表中各自变量的检验P值均小于0.05,认为各回归系数均不为0;标准化偏回归系数β是将模型中自变量对因变量贡献大小进行比较,可以减少在拟合回归模型中计算求解时的截断误差,从而提高模型的拟合精度。
由表2可知,在所得辐射敏感基因组合中,PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4这5个辐射敏感基因无论是对于男性还是女性受照人员而言均能够显示出良好的贡献度(标准化偏回归系数绝对值),而DDB2、ASTN2和PHPT1(男性)以及GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR(女性)则显示出一定的性别特异性。该发现在先前未有任何报道。
具体地,对于不同性别的人群,由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4这5个辐射敏感基因建立的基因组合表达回归方程的决定系数R2超过0.75,基本满足作为辐射生物剂量计的要求。进而,在PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4这5个辐射敏感基因基础之上进一步引入DDB2、ASTN2和PHPT1以及GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个,可进一步提高所得基因组合表达回归方程的决定系数R2。特别地,本发明首次发现,对于男性受照人员而言,PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2和PHPT1这8个辐射敏感基因建立的基因组合表达回归方程显示出最佳的决定系数R2;对于女性受照人员而言,PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR这10个辐射敏感基因建立的基因组合表达回归方程显示出最佳的决定系数R2(表3),所得到的决定系数R2高达0.85,充分满足作为辐射生物剂量计的要求。
表3.基于不同性别的基因组合表达回归方程
注:y为辐射剂量;基因名称为照后24h该基因的相对表达量;F和P为模型方差分析的统计量;决定系数R2表示因变量y的总变异中可由回归模型中自变量解释的部分所占的比例,R2越大越好。
实施例3:双盲法体外实验进行辐射敏感基因组合的验证
1.血样采集与照射
在签署知情同意书的前提下,采集10例健康人外周血,男女各半,每人收集静脉血样8ml,平均分装至两个4ml肝素锂抗凝真空采血管内备用,于室温下进行60Coγ照射(双盲法),剂量率为1Gy/min,剂量点分别为0.8、1.5、2.5、3.5、4.5和5Gy。照后将每个剂量点血样中的2ml接种于含有8ml 10%胎牛血清的RPMI 1640培养瓶中,置于37℃恒温培养箱中培养24h;另外2ml全血分别加入两个含有4ml RPMI 1640(含20%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.2mg/ml PHA,10μg/ml秋水仙素)的培养瓶中充分摇匀,置于37℃培养54h收获细胞。
2.细胞总RNA提取与cDNA合成采用与实施例1相同的方式。
3.染色体标本的制备
(1)低渗:细胞混合培养后,1000rpm/min离心10min,弃上清,使用0.075mol KCl 3~5ml低渗10~20min;
(2)预固定:向含有低渗处理细胞的低渗液中加入1ml固定液预固定,混匀后立即1000rpm/min离心10min,弃上清;
(3)固定:加入8ml固定液固定2次,每次固定15~20min后1000rpm/min离心10min,弃上清;最后将细胞悬于0.5~1ml固定液中;其中固定液是甲醇与冰醋酸按体积比为3:1配制;
(4)滴片:根据细胞浓度加入适量的固定液,用吸管轻轻吹吸混匀,滴在湿冷的玻片上,用火焰或蒸气干燥法制片。
4.实时定量PCR检测采用与实施例1相同的方式。
5.PCR数据处理采用与实施例1相同的方式。
6.辐射剂量估算
辐射剂量估算方法(1):利用实施例1中得到的剂量-效应关系较好的5个辐射敏感基因(PCNA、CDKN1A、TNFSF4、ASTN2和FDXR)分别进行单基因辐射剂量估算;
辐射剂量估算方法(2):根据受照人员性别,利用实施例2中得到的基于不同性别的辐射敏感基因组合(表3)进行辐射剂量估算;
辐射剂量估算方法(3):利用被视为“金标准”的染色体畸变分析进行辐射剂量估算,其中,按照公式要求对足够的有丝分裂相进行分析(n=[(1-p)×96.01]/p),式中p为双着丝粒+环畸变细胞率,n为应分析的细胞数,p可在计数分析到一定数量畸变细胞后求出。然后,应用染色体畸变的剂量-效应曲线y=6.9491×10-2x2+3.4967×10-2x(y为辐射剂量,x为每个细胞中双着丝粒+环畸变数)进行辐射剂量估算。
然后,将三种方法得到的估算辐射剂量与真实辐射剂量进行比较,确定本发明所得到的辐射敏感基因及其组合在估算辐射剂量中的准确性。
结果如图2和图3所示。
由图2可知,应用5个单基因(PCNA、CDKN1A、TNFSF4、ASTN2和FDXR)的剂量-效应曲线分别估算验证样本的辐射剂量时,与真实辐射剂量相比,只有应用PCNA和FDXR估算的平均辐射剂量较接近于真实辐射剂量(R2分别为0.959和0.933),但存在着估算剂量个体之间标准差较大的缺点,这主要与个体的辐射敏感性不同有关。因此,单个辐射敏感基因在估算辐射剂量时具有很大的局限性。
由图3可知,与单基因辐射剂量估算相比,根据受照人员性别应用相应的辐射敏感基因组合估算的平均辐射剂量的准确性有了较大程度的提高,甚至高于业内作为“金标准”的染色体畸变分析估算的结果,R2值达到0.994,并且个体间差异的影响明显降低。
实施例4:体内实验进行辐射敏感基因组合的验证
1.血样采集与照射
在签署知情同意书的前提下,收集4例无放疗史、计划进行全身均匀照射的病人(肿瘤患者)外周血2ml;然后在病人全身照射第一次特定剂量后24h取病人外周血2ml(肝素抗凝)。
2.细胞总RNA提取与cDNA合成采用与实施例1相同的方式。
3.实时定量PCR检测采用与实施例1相同的方式。
4.PCR数据处理采用与实施例1相同的方式。
5.辐射剂量估算
根据病人性别,利用实施例2中得到的基于不同性别的辐射敏感基因组合(表3)对样本进行辐射剂量估算。
由表4可知,由本发明的辐射敏感基因组合估算得到的全身放疗患者的辐射剂量比较接近于真实辐射剂量,说明本发明构建的用于估算辐射剂量的基因组合可以用于肿瘤患者放疗效果的评估与监测。
表4.辐射敏感基因组合估算放疗患者的辐射剂量
由实施例3和实施例4的结果可知,当利用本发明的辐射敏感基因组合作为辐射生物剂量计对辐射剂量进行估算时,无论是体外应用还是体内应用,均可快速准确地估算出辐射剂量。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (26)
1.一种用于对辐射剂量进行估算的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含辐射敏感基因检测试剂,其中,
所述辐射敏感基因由如下基因组成:
(1)PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;以及
(2)DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2和PHPT1组成。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR组成。
4.如权利要求1~3中任一项所述的试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包含内参基因检测试剂,所述内参基因包括β-actin和B2M。
5.如权利要求1~3中任一项所述的试剂盒,其中,所述试剂盒包含序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.30所示的引物。
6.辐射敏感基因检测试剂在制备用于对辐射剂量进行估算的试剂盒中的用途,其特征在于,所述辐射敏感基因由如下基因组成:
(1)PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;以及
(2)DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个。
7.如权利要求6所述的用途,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2和PHPT1组成。
8.如权利要求6所述的用途,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR组成。
9.如权利要求6~8中任一项所述的用途,其中,所述试剂盒进一步包含内参基因检测试剂,所述内参基因包括β-actin和B2M。
10.如权利要求6~8中任一项所述的用途,其中,所述试剂盒包含序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.30所示的引物。
11.一种用于对辐射剂量进行估算的微阵列,其特征在于,所述微阵列包含辐射敏感基因检测探针,
其中,所述辐射敏感基因由如下基因组成:
(1)PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;以及
(2)DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个。
12.如权利要求11所述的微阵列,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2和PHPT1组成。
13.如权利要求11所述的微阵列,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR组成。
14.如权利要求11~13中任一项所述的微阵列,其中,所述微阵列进一步包含内参基因检测探针,所述内参基因包括β-actin和B2M。
15.辐射敏感基因检测探针在制备用于对辐射剂量进行估算的微阵列中的用途,其特征在于,所述辐射敏感基因由如下基因组成:
(1)PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;以及
(2)DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个。
16.如权利要求15所述的用途,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2和PHPT1组成。
17.如权利要求15所述的用途,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR组成。
18.如权利要求15~17中任一项所述的用途,其中,所述微阵列进一步包含内参基因检测探针,所述内参基因包括β-actin和B2M。
19.辐射敏感基因作为辐射生物剂量计对辐射剂量进行估算的用途,其特征在于,所述辐射敏感基因由如下基因组成:
(1)PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;以及
(2)DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个,
其中,所述用途用于非诊断目的。
20.如权利要求19所述的用途,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2和PHPT1组成。
21.如权利要求19所述的用途,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR组成。
22.一种利用辐射敏感基因作为辐射生物剂量计对辐射剂量进行估算的方法,其特征在于,所述方法包括检测人外周血中辐射敏感基因的表达水平的步骤,其中,所述辐射敏感基因由如下基因组成:
(1)PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC和TNFSF4;以及
(2)DDB2、ASTN2、PHPT1、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR中的一个或多个,
其中,所述方法用于非诊断目的。
23.如权利要求22所述的方法,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、DDB2、ASTN2和PHPT1组成。
24.如权利要求22所述的方法,其中,所述辐射敏感基因由PCNA、CCNG1、CDKN1A、XPC、TNFSF4、GDF15、TNFRSF10B、BBC3、BAX和FDXR组成。
25.如权利要求22~24中任一项所述的方法,其中,所述方法进一步包括检测人外周血中内参基因的表达水平的步骤,所述内参基因包括β-actin和B2M。
26.如权利要求22~24中任一项所述的方法,其中,所述方法包括以下步骤:
(1)培养源自人外周血的离体细胞,将所述离体细胞置于已知辐射强度的环境中接受辐照,然后在两个以上时间点采集辐射照射后的离体细胞,测定其中的辐射敏感基因的表达水平,获得该离体细胞的接受的辐照剂量和各辐射敏感基因的表达水平的关系的标准曲线;以及
(2)收集接受了待测剂量的辐射照射的源自人外周血的离体细胞,测定其辐射敏感基因的表达水平,根据步骤(1)获得的标准曲线计算得到该离体细胞所接受的辐射剂量。
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