JP5663137B2 - ミッドカインのc−ドメインを認識する抗体 - Google Patents
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Description
N−フラグメント及びC−フラグメントのそれぞれは、主として3本の逆βシート構造からなる立体構造を持つ部分(以下、「ドメイン」といい、15〜52番目のアミノ酸からなるN−フラグメント中のドメインを「N−ドメイン」、62〜104番目のアミノ酸からなるC−フラグメント中のドメインを「C−ドメイン」という)と、ドメインの外側に位置し、特定の立体構造をとらない部分(以下、「テイル」といい、1〜14番目のアミノ酸からなるN−フラグメント中のテイルを「N−テイル」、105〜121番目のアミノ酸からなるC−フラグメント中のテイルを「C−テイル」という)より構成されている。C−ドメイン表面の塩基性アミノ酸は2つのクラスターを形成しており、それぞれ、79番目のリシン、81番目のアルギニン、102番目のリシンからなるクラスター(クラスターI)と、86番目のリシン、87番目のリシン、89番目のアルギニンからなるクラスター(クラスターII)である(例えば、非特許文献4参照)。双方のクラスターが、共に、ヘパリン結合能に関与することが知られている(例えば、非特許文献4及び非特許文献5参照)。
(1) MKの62〜104番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
(2) MKの64〜73番目及び78〜101番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
(3) MKの64〜73番目のアミノ酸、64〜69番目のアミノ酸、64〜67番目のアミノ酸、及び、84〜96番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
(4) MKの64〜66番目のアミノ酸、及び、87〜96番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
(5) MKの64番目チロシン、65番目リシン、66番目フェニルアラニン、67番目グルタミン酸、69番目トリプトファン、73番目アスパラギン酸、84番目トレオニン、86番目リシン、及び、96番グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
(6) MKの64番目チロシン、66番目フェニルアラニン、87番目リシン、90番目チロシン、及び、96番グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
(7)エピトープが立体構造エピトープである、(1)から(6)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片、
(8) 立体構造エピトープが反並行βシート構造エピトープである、(7)に記載の抗体またはその断片、
(9) 上記(1)から(8)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片であって、エピトープの少なくとも3個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片、
(10) MKの62〜104番目のアミノ酸に存在する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
(11) (10)に記載の抗体またはその断片であって、前記クラスターの少なくとも3個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片、
(12) MKの、62〜64番目のアミノ酸、66番目のアミノ酸、68〜70番目のアミノ酸、72番目のアミノ酸、79番目のアミノ酸、81番目のアミノ酸、85〜89番目のアミノ酸、102番目のアミノ酸、及び、103番目のアミノ酸から選択されるアミノ酸のうち、少なくとも1個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片、
(13) MKの、63番目リジン、79番目リジン、81番目アルギニン、86番目リジン、87番目リジン、89番目アルギニン、及び、102番目リジンから選択されるアミノ酸のうち、少なくとも1個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片、
(14) 重鎖のCDR3が、配列番号15若しくは配列番号21に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有する抗MK抗体またはその断片、
(15) 重鎖のCDR1が配列番号13若しくは配列番号19に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、重鎖可変領域のCDR2が配列番号14に若しくは配列番号20に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のCDR1が配列番号16若しくは配列番号22に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のCDR2が配列番号17若しくは配列番号23に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR3が配列番号18若しくは配列番号24に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有する、請求項5に記載のモノクローナル抗体、
(16) 重鎖のCDR3が、配列番号15若しくは配列番号21に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有する抗MKモノクローナル抗体またはその断片、
(17) 重鎖のCDR1が配列番号13若しくは配列番号19に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR2が配列番号14に若しくは配列番号20に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR1が配列番号16若しくは配列番号22に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のCDR2が配列番号17若しくは配列番号23に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR3が配列番号18若しくは配列番号24に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有する、請求項5に記載のモノクローナル抗体またはその断片、
(18)重鎖のCDR1が配列番号13の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR2が配列番号14に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR3が配列番号15に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR1が配列番号16に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR2が配列番号17に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR3が配列番号18に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有する、抗MKモノクローナル抗体またはその断片、
(19) 重鎖のCDR1が配列番号19の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR2が配列番号20に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR3が配列番号21に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR1が配列番号22に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR2が配列番号23に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR3が配列番号24に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と95%以上の相同性示すアミノ酸配列を有する、抗MKモノクローナル抗体またはその断片、
(20) 重鎖のCDR1が配列番号13の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR2が配列番号14に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR3が配列番号15に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR1が配列番号16に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR2が配列番号17に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR3が配列番号18に記載のアミノ酸配列を有する、抗MKモノクローナル抗体またはその断片、
(21) 重鎖のCDR1が配列番号19の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR2が配列番号20に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR3が配列番号21に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR1が配列番号22に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR2が配列番号23に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR3が配列番号24に記載のアミノ酸配列を有する、抗MKモノクローナル抗体またはその断片、
(22) (14)〜(21)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体が認識するMK上のエピトープを認識する抗体またはその断片。
(23)MKと特異的に結合する、(1)から(22)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片、
(24) MKがヒトMKである、(1)から(23)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片、
(25) 抗体が、モノクローナル抗体である、(1)から(24)のいずれか1項に記載の抗体、
(26) 抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、または、ヒト抗体である、(1)から(25)のいずれか1項に記載の抗体、
(27) 抗体断片が、F(ab’)2、Fab’、Fab、一本鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合Fv(dsFv)若しくはこれらの重合体、二量体化V領域(Diabody)、または、CDRを含むペプチドから選択される抗体断片である、(1)から(26)のいずれか1項に記載の抗体の断片、
(28) (1)から(27)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片をコードするDNA、
(29) (28)のDNAを含有する組み換えベクター、
(30) (29)の組み換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞、
(31) (1)から(27)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片を産生する細胞、
(32) ハイブリドーマ細胞系である、(30)または(31)に記載の細胞、
(33) (30)から(32)のいずれか1項に記載の細胞を培養し、培養物中に抗体またはその断片を生成させ、培養物から抗体またはその断片を抽出することを特徴とする、(1)から(30)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片の製造方法。
(34) (1)から(27)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片を有効成分として含有する、医薬組成物、
(35) (1)から(27)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片を有効成分として含有する、MK関連疾患の予防または治療のための医薬組成物、
(36) MK関連疾患が、細胞遊走に起因する疾患である、(35)に記載の医薬組成物、
(37) 細胞遊走に起因する疾患が癌(若しくは癌の転移)又は炎症性疾患である、(36)に記載の医薬組成物、
(38) MK関連疾患が、自己免疫疾患である、(37)に記載の医薬組成物、
(39) 自己免疫疾患が、多発性硬化症である、(38)に記載の医薬組成物、
(40) (1)から(27)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片を含有する、MK関連疾患の診断薬、並びに、
(41) (1)から(27)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片が結合するMK上のエピトープに結合する物質をスクリーニングする方法であって、
(i)MKに被検化合物及び(1)から(27)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片を接触させる工程、及び、
(ii)(1)から(27)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片とMKとの結合を測定する工程を備える方法。
F(ab’)2は、IgGをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Fab’は、該F(ab’)のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。sdFvは、1本のVHと1本のVLがペプチドリンカーで連結された抗原結合活性を有するポリペプチドである。dsFvは、VH及びVL中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合している抗原結合活性を有する断片である。Diabodyは、scFvが二量体化した断片である。本発明のDiabodyは、モノスペシフィックでもよいし、バイスペシフィック(多重特異性抗体)でもよい。二量体化しているscFvは、同一であっても良いし、異なっていても良い。CDRを含むペプチドは、重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3並びに軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、及び、CDR3から選択される少なくとも1つのCDRのアミノ酸配列を含むペプチドのことである。
また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgYのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはIgGである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。
本発明の抗体は、例えば、MK、または、MKの64〜104番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、MKの64〜73番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、64〜69番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、64〜67番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、MKの64〜66番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、MKの78〜101番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、84〜96番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、及び/若しくは、MKの87〜96番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド等のMKの一部を有するペプチド(以下、「MKの一部を有するペプチド」という)を、必要に応じて免疫賦活剤(例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、または、フロインドの不完全アジュバント等)とともに、非ヒト哺乳動物または鳥類に免疫することにより作製することができる。本発明の抗体は、好ましくは、MKをMKノックアウトマウスに免疫することにより作製することができる(特開2002−85058号公報、Nakamura, E. et al. :Genes Cells 3, p.811-822.参照)。
(1)ヒト型キメラ抗体
本発明のヒト型キメラ抗体は、MKと結合し、MKの機能を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のVH及びVLをコードするDNAを調製し、これをヒト由来免疫グロブリンの定常領域cDNAと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる(Morrison, S.L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984)。
本発明のヒト化抗体は、MKと結合し、MKの細胞遊走活性を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のVH及びVLのCDRをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のVH及びVLのFRに移植したV領域をコードするDNAを構築し、構築したDNAをヒト由来免疫グロブリンの定常領域cDNAと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる(L. Rieohmannら, Nature, 332, 323, 1988; Kettleborough, C. A.ら, Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M., Immunol. Today., 21, 397-402, 2000参照)。
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる(富塚ら, Nature Genet., 15, 146-156(1997))。
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の抗MK抗体作成方法に準じて抗原を免疫することにより、抗MKヒト抗体を得ることができる。
本発明の抗体の断片(F(ab’)2、Fab’、Fab、scFv、dsFv若しくはこれらの重合体、Diabody、または、CDRを含むペプチド)は、以下の方法により作製することができる。
本発明のC-ドメイン認識抗体等は、上述の方法により得られた抗体またはその断片のうち、所望のエピトープを認識する抗体等を選択することにより得ることができる。また、本発明のC−ドメイン認識抗体は、上述の抗MK抗体作製方法において、抗原として所望のエピトープ配列を有するペプチドを投与することにより得ることができる。
本発明の抗体を医薬として使用する場合、投与部位としては、経口投与、口腔内投与、気道内投与、皮下投与、筋肉内投与、血管内(静脈内)投与等を挙げることができる。また、製剤としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤、貼布剤、軟膏等を挙げることができる。本発明の抗体は、単独で投与しても良いし、薬理学的に許容される単体(「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」APhA Publications社参照)と共に投与されてもよい。
本発明の診断薬は、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ELISA(Catty, Raykundalia, 1989)、ラジオイムノアッセイ(Catty, Murphy, 1989)、免疫組織化学的方法(Heiderら、1993)、または、ウェスタンブロット等を挙げることができる。本発明の診断薬の検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、MKの免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明の診断薬による分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
1.MK遺伝子ノックアウトマウスの作製
MK遺伝子ノックアウトマウスは、公知の方法(特開2002−85058号公報、Nakamura, E. et al. :Genes Cells 3, p.811-822.)により作製した。
2−1.抗原の作製
ヒトMKmRNAを、ウイルムス腫瘍由来の培養株細胞G−401より調製した(Tsutsui, J. ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 792-797, 1991)。プライマーとして、制限酵素EcoRIに認識される配列(5'-GAATTC-3')を含むように設計した、センスPCRプライマー:5'-GCGGAATTCATGCAGCACCGAGGCTTCCTC-3'(配列番号:3)、及び、アンチセンスPCRプライマー:5'-GCGGAATTCCTAGTCCTTTCCCTTCCCTTT-3'(配列番号:4)を用い、ヒトMKmRNAを鋳型として、93℃→37℃→72℃の温度変化を1サイクルとする30サイクルのPCR(Polymerase Chain Reaction)を行い、MKコーディング領域の両端にEcoRI認識部位をもつヒトMKcDNAを調製した。
抗原をMKノックアウトマウスに免疫した。抗原の調製はマウス1匹あたり10μgを生理食塩水で0.1mlに希釈したものを抗原溶液とし、FCA0.1mlと混合し乳化させマウスの背皮に皮下投与した。2週間毎に8回免疫操作をした。8回目の免疫は抗原溶液のまま10μgを生理食塩水0.1mlに溶解し、マウス尾静脈に静脈注射した。
マウスを捕定し胸部をアルコール綿で拭き、2.5mlのシリンジと23Gの針を用いて心臓採血を行った。採血した後、マウスを消毒用アルコール20mlの入ったビーカーに3分間程度入れた。採血した血液は1.5mlチューブに入れ37℃で1時間放置した後、4℃で一晩放置し、3,000rpmで10分間遠心分離した。血清を他の1.5mlチューブに移し0.05%アジ化ナトリウムを加え4℃で保存した。
細胞融合から10日後、96well培養プレートの上清を使用しELISA法にて優位に吸光度の高い12wellをクローニング用サンプルとした。ハイブリドーマの細胞数を数え、96well培養プレートの3列に5 cells/well、3列に1 cell/well、2列に0.5 cells/wellとなるようにハイブリドーマ細胞を播種した。また、各wellにフィダー細胞を1×106 cells/wellとなるように播種した。クローニング後5日目にコロニーカウントを行い、コロニーが1個であるwellを確認し、2〜3日毎に培地を交換し、コロニーがwellの1/3をしめてきたところでELISA法を用いてコロニーが1個で陽性反応を示すwellを選択し、コロニー1個でELISAにおいて陽性であり、かつ細胞の状態が良好な2種類のwellから得られた細胞をハイブリドーマCSM−1、ハイブリドーマCSM−4と名付け、樹立株とした。得られたハイブリドーマを用い、ヌードマウスでの腹水化法により抗体を作製し、プロテインGカラムで精製した。
1.MK固相化チャンバーの作製
ポアサイズ8μmの24穴プレート用ケモタキセル(倉敷紡績社製)の底面を上に向け、精製水に溶解したMK(20μg/ml)を30μl/チャンバーとなるように滴下し、チップの先端で均一となるよう塗布した。室温で1時間静置した後、PBS(リン酸バッファーサリン)で2回洗浄した。
10%FCS DMEM(4,500mg/ml glucose Dulbecco's Modified Eagle's medium、シグマ社製、D5796)に懸濁したラット骨芽細胞様細胞UMR106(ATCC No.CRL1661)を直径10cmディッシュ(TPP社製、#93100、販売元:BM機器)に1×106cells/10ml medium/dishとなるように播種し、37℃、5%CO2で2日間培養した。培養後、培地を除去し、0.25%トリプシン−EDTA(ギブコ(GIBCO)社製、25200-056)を3ml加え、37℃、5%CO2で2分間静置した。ディッシュを軽くたたいて細胞を剥がし、10%FCS DMEM(4,500mg/ml glucose Dulbecco's Modified Eagle's medium、シグマ社製、D5796)を7ml加えて懸濁させ、遠心管に回収した。回収した細胞懸濁液の一部を採取して細胞数を測定した。培養後の細胞数は4〜8×106cells/dishであった。残りの細胞懸濁液を1200rpm(260Xg)で3分間遠心分離を行い、沈殿物を0.3%BSA DMEMに懸濁して回収した。細胞濃度が、1×106cells/mlとなるように0.3%BSA DMEMを加えて懸濁させた。
上記2.で作製した細胞懸濁液(1×106cells/ml)を上記1.でセットしたケモタキセルの内層に200μl/チャンバー(2×105cells/チャンバー)となるよう加え、37℃、5%CO2、で4時間培養した。培養後、ケモタキセルの内側の細胞を培地と共に除去し、PBS200μlで2回洗浄し、チャンバーの底面の角にペーパータオルを当てて水分を除去した。24wellプレートに−20℃冷凍庫で冷却した100%メタノールを500μl/well添加し、ケモタキセルをセットした。室温で20分間静置した後、ケモタキセルの内面を綿棒でこすって洗浄した。24wellプレートに1%クリスタルバイオレット水溶液を100μl/wellとなるよう添加し、チャンバーの外面のみが色素と接触するようケモタキセルをセットした。室温で30分間静置後、チャンバーの底面の角にペーパータオルを当てて色素を除去した後、チャンバーを500mlビーカーに満たした水に浸して洗浄した。室温で一晩静置して乾燥させた後、24wellプレートに1%SDS、1%Triton X-100を200μl/wellとなるよう添加し、ケモタキセルをセットした。室温で1時間振とうさせた後、150μlを96wellプレート(NUNC社製、#469957)に移し、OD590nm(POWERSCAN HT、大日本住友製薬)を測定した。抗体未添加サンプル(コントロール)のOD値に対する抗体添加サンプルのODの割合(%)を算出し抗体の活性を評価した。
(表1)UMR106細胞浸潤(% of control)
――――――――――――――――――――――――――――――――――
CSM−1 CSM−4
――――――――――――――――――――――――――――――――――
平均値±標準偏差 41.0±22.1 31.5±1.7
――――――――――――――――――――――――――――――――――
1.インサート作製
pcDNA3.1(−)(インビトロジェン社製、V795-20)にヒトMKのコード領域をクローニングしたプラスミドを鋳型として、センスPCRプライマー:5'-AAAAAGAAAGATAAGGTGAAGAAGGGCGGCCCG-3'(配列番号5)、5'-AAGAAGGGCGGCCCGGGGAGCGAGTGC-3'(配列番号6)、5'-TGCGCTGAGTGGGCCTGGGGG-3'(配列番号7)、5'-TGCAAGTACAAGTTTGAGAACTGGGGT-3'(配列番号8)、及び、ヒスチジン(His×6)タグ配列、終止コドン、及び制限酵素XhoIに認識される配列(5'-CTCGAG-3')を付加した、アンチセンスPCRプライマー:5'-AGTTCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGTCCTTTCCCTTCCCTTT-3'(配列番号9)、5'-AGTTCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGTCGGCTCCAAACTCCTT-3'(配列番号10)、5'-AGTTCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGGGCACCCTGCACCGGAT-3'(配列番号11)、5'-AGTTCTCGAGTCA ATGATGATGATGATGATGGCAGGGCTTGGTGACGCG-3'(配列番号12)を使用して、94℃→55℃→72℃の温度変化を1サイクルとする30サイクルのPCRによりMK_1-121(MK全長)、MK_1-61(N―フラグメント+ループ)、MK_7-51、MK_15-61(N―ドメイン+ループ)、MK_15-51(Cys52を除いたN-ドメイン)、MK_62-121(C―フラグメント)、MK_62-104(C-ドメイン)のインサートを作製した(ここで、「MK_a-b」とは、MKのa番目のアミノ酸からb番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするDNAを示す)。
次に、pGEX−6P−2(GEヘルスケアバイオサイエンス社製、27-4598-01)プラスミドベクターを制限酵素 Sma I(東洋紡社製、SMA-111T) および Xho I で処理した。処理後のベクター(Sma I 切断部位は平滑末端)に、1.で作製した各インサートを、DNAライゲーションキットVer. 1(タカラバイオ社製、6025)を用いて挿入し、MK配列の前に開始コドン及びGSTコーディング領域を有するプラスミドベクターを作製した。
全長MK、部分MK(MK_1-61、MK_15-61、MK_7-51、MK_15-51、MK_62-121、及び、MK_62-104)、並びに、MK_1-61及びMK_62-121のアラニンミュータント3.5μlを12%ポリアクリルアミドゲル2枚に同じパターンでロードして電気泳動をおこなった。1枚目のゲルは、CBB(Coomassie Brilliant Blue)染色し、各タンパク質の発現量が同程度であるかを確認した。2枚目のゲルは、セミドライ方式(6V、2.5h)でPVDF膜に転写した。このPVDF膜を5% スキムミルク-0.05% Tween 20-PBSにて室温で2時間ブロッキングした後、実施例1で取得したマウスモノクローナル抗MK抗体2μg/mlを含有する0.05% Tween 20-PBSを添加し、4℃で一晩静置した。0.05% Tween 20-PBSで10分、3回洗浄後、1/10,000 Anti-Mouse IgG Peroxidase Conjugated(ピアス(PIERCE)社製、31452)-0.05% Tween 20-PBSを添加し、室温で1時間静置した。さらに、0.05% Tween 20-PBSで10分、3回洗浄後、TMB Membrane Peroxidase Substrate System(キルケガードアンドペリーラボラトリーズ(Kirkegaard & Perry Laboratries:KPL)社製、50-77-00)にて発色させた。
当業者周知の方法(Johanssonら,J.Exp.Med.,180,pp.1873-1888(1994)及びOrlandiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,pp.3833-3837(1989)参照)により、実施例1で得られたマウス抗ヒトMKモノクローナル抗体CSM−1及びCSM−4のCDR配列を解析した。その結果、CSM−1は、重鎖のCDR配列が、CDR1:DYFLH(配列番号13)、CDR2:RIDPEDSETKYAPKFQG(配列番号14)、CDR3:NYGGGGFAY(配列番号15)であり、軽鎖のCDR配列が、CDR1:KASQDVSTAVA(配列番号16)、CDR2:SASYRYT(配列番号17)、CDR3:QQHYSSPFT(配列番号18)であった。また、CSM−4は、重鎖のCDR配列が、CDR1:SYWMN(配列番号19)、CDR2:MIHPSDSETILNQKFKD(配列番号20)、CDR3:WSAKRGDF(配列番号21)であり、軽鎖のCDR配列が、CDR1:RASESISNNLH(配列番号22)、CDR2:YASQSIS(配列番号23)、CDR3:QQSNSWPLT(配列番号24)であった。
1.Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG)エマルジョンの調整
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55(MOG、東レリサーチセンター、配列:MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)10mgを純水5mLに溶解して2mg/mLのMOGペプチド溶液を調整した。Heat-killed Mycobacterium tuberculosis H37Ra(MTB)1mg/mL含有Complete Freund's adjuvant(CFA、SIGMA)に、MTB(Difco)を加え、MTBを3mg/mL含有するMTB CFA溶液を調製した。MOGペプチド溶液に等量のMTB CFA溶液を加え、エマルジョン化するまで混合した。ビーカーに入れた水の上に混合物を一滴滴下し、分散しないことでエマルジョン化を確認した。
2.MOG感作
マウスは、メス7週齢のC57BL/6JJcl(日本クレア、富士生育場)を使用した。入荷後、8日間飼育し、外見及び行動に異常がないことを確認した。8週齢となったマウスに、生理食塩水で5倍に希釈したソムノペンチル(ペントバルビタールナトリウム、共立製薬)を100μL腹腔内投与し、麻酔した。マウスの背から腰の部分の毛を刈り、1.で作成したMOGエマルジョン各50μLを4箇所、皮下に注入した。マウスが麻酔から回復した後、終濃度が2μg/mLとなるよう生理食塩水で100倍に希釈した0.2mg/mL Pertussis toxin 50%グリセロール溶液(PTX、SIGMA)100μLを腹腔内投与した。また、MOG感作日を0日目として、2日後にPTXを同量、腹腔内に投与した。
3.抗体の投与
MOG感作及びPTX投与後、マウスの体重を測定し、体重が均等に分散するようにコントロール群、各抗体投与群に、各4匹を群分けした。CSM−1及びCSM−4の各抗体は生理食塩水(大塚製薬)で1mg/mLとなるよう希釈し、マウスの体重20gにつき200μLを腹腔内に投与した(10mg/kg体重)。投与は、MOG感作日を0日目として、0、4、7、11、14日目に計5回行った。コントロール群には、抗体を含まない生理食塩水をマウスの体重20gにつき200μLとなるよう投与した。
4.病態観察
感作後、毎日マウスの病態について観察を行った。病態の判定は、以下の臨床スコアにより行った。
臨床スコア
0:症状なし
0.5:尾がやや垂れる
1:尾が完全に垂れる
2:裏返せる、傾いて少しふらふら歩く
3:尻を床に着けて歩く、裏返すとなかなか戻れない
4:胸を床に着けて歩く、前足も弱い、時々くるくる回って歩く
5:完全に後足が伸びきって動かない
6:瀕死、または死亡
5.結果
抗体としてCSM−1を投与した結果を図4に、抗体としてCSM−4を投与した結果を図5に示す。図に示すとおり、CSM−1及びCSM−4のいずれを投与した場合にも、EAEモデルマウスにおける発症が抑制されていた。EAEモデルマウスは多発性硬化症のモデルとして用いられることから、本実験結果より、CSM−1及びCSM−4が、多発性硬化症の治療及び予防効果を有することが示された。
プロテイン・データ・バンクよりMKの立体構造を入手し、Pymol(ver.0.99)を使用してMKの静電ポテンシャルを計算した。計算された静電ポテンシャルと、実施例3で得られたCSM−1及びCSM−4のエピトープとの関係を検討した結果、いずれも62〜64番目のアミノ酸、66番目のアミノ酸、68〜70番目のアミノ酸、72番目のアミノ酸、79番目のアミノ酸、81番目のアミノ酸、85〜89番目のアミノ酸、102番目のアミノ酸、及び、103番目のアミノ酸により形成される高静電ポテンシャル部位のうち3個のアミノ酸を認識していることが示された。また、これらの高静電ポテンシャル部位のうち、特に正電荷をもつアミノ酸である、63番目リジン、79番目リジン、81番目アルギニン、86番目リジン、87番目リジン、89番目アルギニン、及び、102番目リジンのうち1個のアミノ酸を認識していることが示された。これらの結果から、上述のCSM−1及びCSM−4の効果は、MKの高静電ポテンシャル部位と結合することにより発揮されていることが示された。
Claims (8)
- 単離された抗ミッドカイン抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖CDR1は配列番号13に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖CDR2は配列番号14に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖CDR3は配列番号15に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR1は配列番号16に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR2は配列番号17に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR3は配列番号18に記載のアミノ酸配列を有する、重鎖CDR1ないし3及び、軽鎖CDR1ないし3を全て含むことを特徴とする前記抗体またはその抗原結合性断片。
- 単離された抗ミッドカイン抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖CDR1は配列番号19に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖CDR2は配列番号20に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖CDR3は配列番号21に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR1は配列番号22に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR2は配列番号23に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR3は配列番号24に記載のアミノ酸配列を有する、重鎖CDR1ないし3及び、軽鎖CDR1ないし3を全て含むことを特徴とする前記抗体またはその抗原結合性断片。
- 請求項1又は2に記載の抗体またはその抗原結合性断片を産生するin vitro細胞系。
- 請求項1又は2に記載の抗体またはその抗原結合性断片を有効成分として含む、医薬組成物。
- ミッドカイン関連疾患の予防または治療のための、請求項1又は2に記載の抗体またはその抗原結合性断片を有効成分として含む、医薬組成物。
- 請求項1又は2に記載の抗体またはその抗原結合性断片が結合するミッドカイン上のエピトープに結合する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程:
(i)ミッドカインに被検化合物及び請求項1又は2に記載の抗体またはその抗原結合性断片を接触させる工程;及び、
(ii)請求項1又は2に記載の抗体またはその抗原結合性断片とミッドカインとの結合を測定する工程;
を含み、
ここで被検化合物の存在下での請求項1又は2に記載の抗体またはその抗原結合性断片とミッドカインとの結合が被検化合物の非存在下での結合と比べて減少することが、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片が結合するミッドカイン上のエピトープに被検化合物が結合して、請求項1又は2に記載の抗体またはその抗原結合性断片がミッドカイン上のエピトープに結合するのを阻害することを意味する、
前記方法。 - 単離された抗ミッドカイン抗体であって、重鎖CDR1は配列番号13に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖CDR2は配列番号14に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖CDR3は配列番号15に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR1は配列番号16に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR2は配列番号17に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR3は配列番号18に記載のアミノ酸配列を有する、前記抗体。
- 単離された抗ミッドカイン抗体であって、重鎖CDR1は配列番号19に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖CDR2は配列番号20に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖CDR3は配列番号21に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR1は配列番号22に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR2は配列番号23に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR3は配列番号24に記載のアミノ酸配列を有する、前記抗体。
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