KR20150038046A - 다중특이적 결합체의 탐지 방법 - Google Patents

다중특이적 결합체의 탐지 방법 Download PDF

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KR20150038046A
KR20150038046A KR1020157003608A KR20157003608A KR20150038046A KR 20150038046 A KR20150038046 A KR 20150038046A KR 1020157003608 A KR1020157003608 A KR 1020157003608A KR 20157003608 A KR20157003608 A KR 20157003608A KR 20150038046 A KR20150038046 A KR 20150038046A
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카이-군나르 슈투벤라우히
마르쿠스 차닥
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

샘플 중 다중특이적 항체의 탐지 방법으로서, 다중특이적 항체가 i) 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부에 결합하는 제 1 항-개별특이형 항체, 및 ii) 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 결합하는 제 2 항-개별특이형 항체에 의해 특이적으로 결합되고, 형성된 복합체가 확인되는 방법이 본원에서 보고된다.

Description

다중특이적 결합체의 탐지 방법 {METHOD FOR THE DETECTION OF A MULTISPECIFIC BINDER}
본 발명은 샘플 중 다중특이적 결합체 (multispecific binder) 의 탐지 방법으로서, 다중특이적 결합체의 상이한 결합 특이부 (binding specificities) 를 겨냥하는 항-개별특이형 항체 (anti-idiotypic antibodies) 를 사용하여 다중특이적 결합체가 탐지되는 방법에 관한 것이다.
항체를 사용하는 표준 고체-상 면역검정은 고체 상에 흡착/고정된 항체 (포획 항체 (capture antibody)), 항원, 및 효소 또는 탐지가능한 라벨과 접합된 항원의 또다른 에피토프에 대한 항체 (추적자 항체 (tracer antibody)) 사이의 복합체 (complex) 의 형성을 수반한다. 이러한 검정에서, 샌드위치가 형성된다: 고체 상/포획 항체/항원/추적자 항체. 샌드위치에 의해 촉매작용 받는 반응에서 특히 항체-접합된 효소의 활성은 인큐베이션 매질 중 항원 농도에 비례한다. 항-개별특이형 항체 검정은, 예를 들어, US 5,219,730; WO 87/002778; EP 0 139 389; 및 EP 0 170 302 에서 언급된다. Wadhwa, M. 등 (J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17) 은 치료적 생물학적 제제에 의해 유도되는 원치 않는 항체의 탐지, 측정 및 특성분석을 위한 전략을 보고한다. 항 개별특이형 항체의 생산 방법이 EP 1 917 854 에서 보고된다.
WO 2008/119353 에서 이중특이적 항체 및 그의 생산 방법이 보고된다. 단백질 및 항체 치료제의 2 가의 탐지 방법이 WO 2006/096697 에서 보고된다. WO 2008/134046 에서 강력하고, 안정적인 비-면역억제성 항-CD4 항체가 보고된다. Muller, K.M. 등은 항체의 제 1 불변 도메인 (CH1 및 CL) 이 이중특이적 미니항체에 대한 이질이합체화 도메인으로서 사용될 수 있다고 보고한다.
샘플 중 다중특이적 항체의 양을 확인하기 위한 샌드위치 면역검정에서, 다중특이적 항체의 상이한 결합 특이부에 각각 결합하는, 2 가지 항-개별특이형 항체를 포획 항체 및 추적자 항체로서 사용함으로써, 샘플 매트릭스 (예를 들어 혈청 또는 인간 혈장, 항원 등) 로 인한 영향이 최소화될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 부가적으로 더욱 민감성이고, 샘플 매트릭스에 의한 영향이 더 적고, 더욱 신속히 수행될 수 있고, 샘플 매트릭스의 최소 제거/희석을 요구하고, 포획 및/또는 추적자 항체 각각의 라벨링/유도체화/고정에 더 큰 유연성을 제공하는 검정 설정을 사용하는 것이 가능하다. 이는 하나는 이중특이적 항체의 제 1 결합 특이부를 겨냥하고, 다른 하나는 이중특이적 항체의 제 2 결합 특이부를 겨냥하는, 2 가지 항-개별특이형 항체를 사용함으로써 달성된다.
따라서, 하기 단계를 포함하는 샘플 중 다중특이적 결합체의 양의 (면역학적) 확인 방법이 본원에서 보고된다:
- 복합체를 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부와 상이한, 다중특이적 결합체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체와 함께 인큐베이션하고,
그에 의해 샘플 중 다중특이적 결합체의 양을 확인함으로써
i) 다중특이적 결합체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체, 및
ii) 다중특이적 결합체
사이에 형성된 복합체의 양을 확인하는 단계.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체는 고체 상에 접합되어 있다.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체는 탐지가능한 라벨에 접합되어 있다.
하나의 구현예에서 샘플은 (인간) 혈청 또는 (인간) 혈장을 포함하고/거나, 세포 용해물이고/거나, 다중특이적 결합체의 하나 이상의 항원을 포함한다. 하나의 구현예에서 샘플은 (인간) 혈청 또는 (인간) 혈장이다.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체는 항체, 항체 또는 항체 분절 및 비-항체 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 항체 또는 항체 분절 및 가용성 수용체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 항체 또는 항체 분절 및 펩티드 결합 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체는 항체이다. 하나의 구현예에서 항체는 이중특이적 항체, 또는 삼중특이적 항체, 또는 사중특이적 항체, 또는 오중특이적 항체, 또는 육중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서 항체는 이중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서 결합 특이부는 결합 자리 또는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체는 비오티닐화 (biotinylated) 되어 있고, 고체 상은 스트렙타비딘 (streptavidin) 코팅되어 있다. 하나의 구현예에서 고체 상은 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드 (paramagnetic bead) 또는 스트렙타비딘 코팅된 세파로스 비드 (sepharose bead) 이다.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체는 디그옥시게닐화 (digoxigenylated) 되어 있다.
하나의 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 형성된 복합체 중 탐지가능한 라벨의 확인에 의해
i) 다중특이적 결합체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체,
ii) 다중특이적 결합체, 및
iii) 다중특이적 결합체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하고 탐지가능한 라벨을 포함하는 항-개별특이형 항체
사이에 형성된 복합체의 양을 확인하는 단계.
하나의 구현예에서 항-개별특이형 항체의 그것의 접합 파트너에 대한 접합은 약물 항체의 아미노산 백본의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기 (라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노 기, 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기 및/또는 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다.
하나의 구현예에서 항-개별특이형 항체는 고체 상에 둘 이상의 상이한 아미노 기를 통해 접합된 항-개별특이형 항체를 포함하는 혼합물이다. 상이한 아미노 기를 통한 그러한 커플링은 제 1 단계에서 화학적 보호제를 사용하는 ε-아미노 기의 일부의 아실화에 의해, 예를 들어 시트라코닐화에 의해, 수행될 수 있다. 제 2 단계에서 남은 아미노 기를 통해 접합이 수행된다. 후속적으로 시트라코닐화는 제거되고, 항체는 남은 자유 아미노 기를 통해 고체 상에 접합되며, 즉 수득된 항체는 시트라코닐화에 의해 보호되지 않은 아미노 기를 통해 고체 상에 접합된다. 적합한 화학적 보호제는 보호되지 않은 측쇄 아민에서 결합을 형성하고, N-말단에서의 결합과 상이하고, 그보다 덜 안정적이다. 많은 그러한 화학적 보호제가 알려져 있다 (예를 들어 EP 0 651 761 참고). 하나의 구현예에서 화학적 보호제는 시클릭 디카르복시산 무수물 예컨대 말레산 또는 시트라코닐산 무수물을 포함한다.
하나의 구현예에서 항-개별특이형 항체는 수동적 흡착에 의해 고체 상에 접합되어 있다. 수동적 흡착은 예를 들어 Butler, J.E., "Solid Phases in Immunoassay" (1996) 205-225 및 Diamandis, E.P., 및 Christopoulos, T.K. (편집자), "Immunoassays" (1996) Academic Press (San Diego) 에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서 항-개별특이형 항체는 특이적 결합 쌍을 통해 접합 (고정) 된다. 하나의 구현예에서 그러한 결합 쌍 (제 1 성분/제 2 성분) 은 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원 (예를 들어, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) 참고), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 항-개별특이형 항체는 비오틴에 접합되고, 고정은 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다.
도 1 혈청 및 세포 샘플 중 이중특이적 항체의 농도의 확인을 위한 도해적 약물동력학적 ELISA 검정 원리 (항-개별특이형 항체 기반 ELISA).
도 2 항-VEGF/ANG2 항체의 탐지를 위한 항원-기반 샌드위치 ELISA. 재조합 인간 안지오포이에틴 2 가 미세 역가 플레이트에 직접 코팅되었다. 그와 병행하여, 항-VEGF/ANG2 항체를 함유하는 샘플이 디그옥시게닌-라벨링된 재조합 VEGF 와 함께 예비-인큐베이션되었다. 코팅 후에, 플레이트가 세정되었고, 예비-인큐베이션된 혼합물과 함께 인큐베이션되었다. 항-VEGF/ANG2 항체 및 디그옥시게닌-라벨링된 VEGF 의 복합체는 미세 역가 플레이트 표면 위의 ANG2 에 결합한다. 결합된 디그옥시게닌-라벨링된 VEGF 는 항-디그옥시게닌 항체-HRP 접합체 및 ABTS 로 탐지되었다.
도 3 이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체의 탐지를 위한 항원-기반 ELISA (A) 및 항-개별특이형 항체 기반 ELISA (B) 에 대해 수득된 보정 곡선의 비교.
도 4 5 %, 10 % 및 20 % 인간 혈청의 존재 하의 항-개별특이형 항체 기반 ELISA 및 항원-기반 ELISA 의 보정 곡선의 비교.
전임상 및 임상 샘플 중 다중특이적 결합체, 예컨대 이중특이적 항체/약물의 양의 시험관내 확인 방법이 본원에서 보고된다.
샘플 매트릭스에 의한 영향을 최소화하고 샘플 중 다중특이적 결합체의 양의 면역학적 확인의 설정 및 수행에 있어서 더 큰 정도의 유연성을 허용하기 위해 다중특이적 결합체의 상이한 결합 특이부에 결합하는 2 가지 항-개별특이형 항체를 사용함으로써 샘플 중 다중특이적 결합체가 탐지되어야 한다는 것이 밝혀졌다.
하기에서 본원에서 보고되는 방법이 다중특이적 결합체의 구현예로서의 다중특이적 항체를 사용하여 예시된다.
용어 "항체" 는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 요망되는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 분절을 포함하나 그에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 망라한다.
특정 구현예에서, 다중특이적 결합체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 둘 이상의 상이한 자리에 대한 결합 특이부를 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이부 중 하나는 제 1 항원에 대한 것이고, 다른 하나는 상이한 제 2 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원의 2 가지 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 분절로서 제조될 수 있다. 하나의 구현예에서 항체는 제 1 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서 이중특이적 항체는 i) 제 1 항원 또는 항원 위의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 특이부, 및 ii) 제 2 항원 또는 동일한 항원 위의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이부를 갖는다. 하나의 구현예에서 동일한 항원 위의 제 2 에피토프는 비-중첩 에피토프이다.
다중특이적 항체는 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 또는 WO 2010/145793 에 기재되어 있다.
용어 "항체 분절" 은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 분절의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 분절로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
항체의 "클래스" 는 그것의 중쇄에 의해 보유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 항체의 5 가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 가 존재하고, 이들 중 여럿은 서브클래스 (동형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 호칭된다.
용어 "자유 항원" 은 항체의 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합될 수 있으나 현재 이러한 결합 특이부에 결합되어 있지 않은 항원을 의미한다. 하나의 구현예에서 자유 항원은 항체 결합되지 않은 항원 또는 항체 복합체화되지 않은 항원이다.
본원에서 용어 "Fc-영역" 은 일부 이상의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 것으로 사용된다. 상기 용어는 선천 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226, 또는 Pro230 에서부터 중쇄의 카르복실-말단까지 이른다. 그러나 Fc-영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재 또는 부재할 수 있다. 본원에서 다르게 명시되지 않는 한, Fc-영역 또는 불변 영역에서의 아미노산 잔기의 번호지정은 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 에 기재된 바와 같은 EU Index 로도 호칭되는 EU 번호지정 시스템에 따른다.
"골격" 또는 "FR" 은 과가변 영역 (HVR) 잔기 외의 가변 도메인 잔기를 호칭한다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 하기의 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인간 항체" 는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원에서 유래하거나 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 이러한 인간 항체의 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 의미한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 1 개 이상, 전형적으로 2 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 것들에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체에서 유래하는 항체 불변 영역의 일부 이상을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 겪은 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열에서 과가변이고/이거나 구조적으로 규정된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 각각 호칭한다. 일반적으로 선천 4 개 사슬 항체는 6 개의 HVR 을, 3 개는 VH (H1, H2, H3) 에, 3 개는 VL (L1, L2, L3) 에 포함한다. HVR 은 일반적으로 과가변 루프 및/또는 "상보성 결정 영역 (CDR)" 으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 상보성 결정 영역은 서열 가변성이 최고이고/거나 항원 인지에 관여한다. 예시적 과가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) 에서 발생한다 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). 예시적 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 24-34, L2 의 아미노산 잔기 50-56, L3 의 아미노산 잔기 89-97, H1 의 아미노산 잔기 31-35B, H2 의 아미노산 잔기 50-65 및 H3 의 아미노산 잔기 95-102 에서 발생한다 (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). VH 에서의 CDR1 은 제외하면, CDR 은 일반적으로 과가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR 은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이부 결정 잔기 (specificity determining residue)" 또는 "SDR" 을 포함한다. SDR 은 단축-CDR 또는 a-CDR 로 호칭하는 CDR 의 영역 내에 함유된다. 예시적 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 31-34, L2 의 아미노산 잔기 50-55, L3 의 아미노산 잔기 89-96, H1 의 아미노산 잔기 31-35B, H2 의 아미노산 잔기 50-58 및 H3 의 아미노산 잔기 95-102 에서 발생한다 (Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). 다르게 명시되지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 상기 Kabat et al. 에 따라 번호지정된다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생성 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함) 를 제외하고는, 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프) 를 겨냥하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 위의 단일 결정자를 겨냥한다. 따라서, 수식어 "모노클로날" 은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특질을 나타내고, 임의의 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되면 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 그에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 그러한 모노클로날 항체 제조 방법 및 기타 예시적 방법이 본원에 기재된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 선천 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들어, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 페이지 91 참고). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다 (예를 들어, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628 참고).
용어 "항-개별특이형 항체" 는 결합 특이부 예컨대 부모 항체의 결합 자리에 특이적으로 결합하는 항체, 즉 예를 들어 부모 항체의 항원 결합 자리를 겨냥하는 항체를 의미한다. 하나의 구현예에서 항-개별특이형 항체는 부모 항체의 하나 이상의 CDR 에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서 부모 항체는 치료용 항체이다. 하나의 구현예에서 부모 항체는 다중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서 부모 항체는 이중특이적 항체이다.
고정된 항체 및 가용성 항원, 또는 그 반대를 사용하는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정에 의해, 의문의 에피토프의 농도 20-50 nM, 에피토프 중첩이 탐지되어야 하는 항체의 농도 100 nM 일 때 50% 이상, 하나의 구현예에서 75% 이상의 신호 감소가 탐지되는 경우, 2 개의 에피토프가 중첩된다. 대안적으로 동일한 항원에 결합하는 2 개 항체의 에피토프 중첩이 경쟁적 시험 시스템을 사용하여 확인되는 방법이 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어 재조합 항원 에피토프를 발현하는 세포를 이용하는 세포-기반 효소 면역검정 (ELISA) 으로, 에피토프 중첩이 탐지되어야 하는 항체가 고정된 항원에 대한 결합에서 다른 항체와 경쟁하는지 여부가 시험한다. 이러한 목적을 위해, 고정된 항원이 라벨링된 형태의 항체 및 에피토프 중첩이 확인되어야 하는 항체의 과잉량과 함께 인큐베이션된다. 결합된 라벨링의 탐지에 의해, 에피토프 중첩이 용이하게 확인될 수 있다. 에피토프 중첩이 확인되어야 하는 항체 (알려진 항체로 언급됨) 가 105-배 초과인 경우에, 70% 초과, 하나의 구현예에서 80% 초과 (동일한 농도에서) 의 신호 감소, 또는 80% 초과, 하나의 구현예에서 90% 초과 (더 높은 농도에서) 의 변위 (displacement) 가 확인되는 경우, 이때 에피토프 동일성 또는 중첩이 존재하고 두 항체 모두가 동일한 항원 위의 동일한 또는 중첩하는 에피토프에 결합한다.
상이한 면역검정의 원리가 예를 들어 Hage, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R) 에 의해 기재되어 있다. Lu, B. 등 (Analyst 121 (1996) 29R-32R) 은 면역검정에서 사용되는 항체의 방향성 있는 고정화를 보고한다. 아비딘-비오틴-매개되는 면역검정은 예를 들어 Wilchek, M., 과 Bayer, E.A. 에 의해 Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469 에서 보고된다.
모노클로날 항체 및 그의 불변 도메인은 결합 파트너, 예컨대 표면, 단백질, 중합체 (예를 들어 PEG, 셀룰로오스 또는 폴리스티롤), 효소, 또는 결합 쌍의 일원에 대한 커플링을 위해 다수의 반응성 아미노산 측쇄를 포함한다. 아미노산의 화학적 반응성 기는 예를 들어 아미노 기 (라이신, 알파-아미노기), 티올기 (시스틴, 시스테인 및 메티오닌), 카르복시산 기 (아스파르트산, 글루탐산) 및 당-알코올 기이다. 이러한 방법은 예를 들어 Aslam M., 및 Dent, A. 에 의해 "Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, pp. 50-100 에 기재되어 있다.
단백질의 가장 흔한 반응성 기 중 하나는 아미노산 라이신의 지방족 ε-아민이다. 일반적으로, 거의 모든 항체가 풍부한 라이신을 함유한다. 라이신 아민은 pH 8.0 초과에서 상당히 양호한 친핵체이고 (pKa = 9.18) 그러므로 여러가지 시약과 쉽고 완전하게 반응하여 안정한 결합을 형성한다. 아민-반응성 시약은 주로 라이신 및 단백질의 α-아미노 기와 반응한다. 반응성 에스테르, 특히 N-히드록시-숙신이미드 (NHS) 에스테르가 그 중에서도 가장 흔히 이용되는 아민기 개질용 시약이다. 수성 환경에서의 반응에 최적인 pH 는 pH 8.0 내지 9.0 이다. 이소티오시아네이트는 아민-개질 시약이고, 단백질과 티오우레아 결합을 형성한다. 그들은 수용액 (최적으로 pH 9.0 내지 9.5 에서) 중에서 단백질 아민과 반응한다. 알데히드는 약한 수성 조건 하에 지방족 및 방향족 아민, 히드라진 및 히드라지드와 반응하여 이민 중간체 (쉬프 (Schiff) 염기) 를 형성한다. 쉬프 염기는 약한 또는 강한 환원제 (예컨대 나트륨 보로히드리드 또는 나트륨 시아노보로히드리드) 로 선택적으로 환원되어 안정적 알킬 아민 결합을 유도할 수 있다. 아민을 개질하는데 사용되어 온 기타 시약은 산 무수물이다. 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA) 은 2 개의 아민-반응성 무수물 기를 포함하는 이관능성 킬레이트제이다. 그것은 단백질의 N-말단 및 ε-아민 기와 반응하여 아미드 연결을 형성할 수 있다. 무수물 고리는 열려서, 배위 착물 중 금속에 단단히 결합할 수 있는 다가, 금속-킬레이트 암 (arm) 을 생성한다.
항체 내의 또다른 흔한 반응성 기는 황-함유 아미노산 시스틴 및 그것의 환원 산물 시스테인 (또는 하프 시스틴) 으로부터의 티올 잔기이다. 시스테인은 자유 티올 기를 함유하며, 이는 아민보다 더욱 친핵성이고 일반적으로 단백질에서 가장 반응성인 관능기이다. 티올은 일반적으로 중성 pH 에서 반응성이고, 그러므로 아민의 존재시 다른 분자에 선택적으로 커플링될 수 있다. 자유 술프히드릴기는 비교적 반응성이므로, 이들 기를 갖는 단백질은 이들 기를 종종 디술피드 기 또는 디술피드 결합과 같은 산화 형태로 보유한다. 이러한 단백질에서, 반응성 자유 티올을 생성하기 위해, 디티오트레이톨 (DTT) 과 같은 시약에 의한 디술피드 결합의 환원이 필요하다. 티올-반응성 시약은 단백질 위의 티올 기와 커플링되어 티오에테르-커플링 산물을 형성할 것이다. 이들 시약은 약 산성 내지 중성 pH 에서 신속히 반응하고, 그러므로 아민 기의 존재시 선택적으로 반응될 수 있다. 문헌은 트라우트 (Traut) 시약 (2-이미노티올란), 숙신이미딜 (아세틸티오) 아세테이트 (SATA), 및 술포숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오) 프로피온아미도] 헥 사노에이트 (술포-LC-SPDP) 와 같은 여러 티올화 가교 시약을 사용하여 반응성 아미노 기를 통해 다수의 술프히드릴 기를 효율적으로 도입하는 방식을 제공하는 것을 보고한다. 할로아세틸 유도체, 예를 들어 요오도아세트아미드는 티오에테르 결합을 형성하고, 또한 티올 개질을 위한 시약이다. 추가로 유용한 시약은 말레이미드이다. 말레이미드와 티올-반응성 시약과의 반응은 요오도아세트아미드와의 반응과 본질적으로 동일하다. 말레이미드는 약 산성 내지 중성 pH 에서 신속히 반응한다.
항체 내의 또다른 흔한 반응성 기는 카르복시산이다. 단백질은 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄 내에 및 C-말단 위치에서 카르복시산 기를 함유한다. 물에서의 카르복시산의 비교적 낮은 반응성은 통상적으로 이들 기를 사용하여 단백질 및 기타 생체분자를 선택적으로 개질하는 것을 곤란하게 만든다. 이것이 수행될 때, 카르복시산 기는 통상적으로 수용성 카르보디이미드를 사용하여 반응성 에스테르로 전환되고, 친핵성 시약 예컨대 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 반응된다. 라이신의 더욱 강한 염기성인 ε-아민의 존재 하에 활성화된 카르복시산과 선택적으로 반응하여 안정적 아미드 결합을 형성하기 위해, 아민-함유 시약은 약 염기성이어야 한다. pH 가 8.0 초과로 상승되었을 때, 단백질 가교가 일어날 수 있다.
나트륨 페리오데이트 (periodate) 가 사용되어, 항체에 부착된 탄수화물 모이어티 내의 당의 알코올 부분을 알데히드로 산화시킬 수 있다. 각각의 알데히드 기는 카르복시산에 대해 기재한 바와 같이 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 반응될 수 있다. 탄수화물 모이어티는 항체의 결정성 (crystallizable) 절편 (Fc) 영역에서 우세하게 발견되므로, 접합은 항원-결합 자리에서 떨어져 있는 탄수화물의 자리-지정 수식을 통해 달성될 수 있다. 쉬프 염기 중간체가 형성되고, 이는 나트륨 시아노보로히드리드 (온화하고 선택적) 또는 나트륨 보로히드리드 (강함) 수용성 환원제에 의한 중간체의 환원을 통해 알킬 아민으로 환원될 수 있다.
용어 "샘플" 은 생물 또는 예전 생물로부터의 임의의 양의 물질을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 이러한 생물은 인간, 마우스, 원숭이, 랫트, 토끼 및 기타 동물을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서 샘플은 원숭이, 특히 시노몰구스 원숭이 (cynomolgus monkey), 또는 토끼, 또는 마우스 또는 랫트로부터 수득된다. 그러한 물질은 하나의 구현예에서 임상 일상에서 가장 널리 사용되는 샘플 공급원인 개체로부터의 전혈, 혈청, 또는 혈장을 포함하나 그에 제한되지 않는다.
용어 "고체 상" 은 비-유체 물질을 의미하며, 중합체, 금속 (상자성, 강자성 입자), 유리, 및 세라믹과 같은 재료로 제조된 입자 (미세입자 및 비드를 포함); 실리카, 알루미나, 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리, 및/또는 세라믹으로 제조될 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 물질; 전극; 미세역가 플레이트; 고체 스트립; 및 큐벳, 튜브 또는 기타 분광계 샘플 용기를 포함한다. 고체 상 성분은, "고체 상" 이 샘플 중 물질과 상호작용할 것이 의도되는 하나 이상의 모이어티를 그것의 표면 위에 함유하는 점에서 불활성 고체 표면과 구별된다. 고체 상은 튜브, 스트립, 큐벳 또는 미세역가 플레이트와 같은 정치 (stationary) 성분일 수 있거나, 비드 및 미세입자와 같은 비-정치 성분일 수 있다. 단백질 및 기타 물질의 비-공유적 또는 공유적 부착을 가능하게 하는 여러가지 미세입자가 사용될 수 있다. 그러한 입자는 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 와 같은 중합체 입자; 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자와 같은 세라믹 입자를 포함한다. 예를 들어 Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A, 또는 Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23 을 참고한다.
하나의 구현예에서, 탐지가능한 표지는 색소원 (형광 또는 발광 기 및 염료), 효소, NMR-활성 기, 금속 입자, 또는 합텐, 예컨대 디그옥시게닌으로부터 선택된다. 탐지가능한 표지는 또한 광활성가능 가교기, 예를 들어 아지도 또는 아지린 기일 수 있다. 전기화학발광법에 의해 탐지될 수 있는 금속 킬레이트는 또한 하나의 구현예에서 신호-방사 기이고, 루테늄 킬레이트, 예를 들어 루테늄 (비스피리딜)3 2+ 킬레이트가 특히 바람직하다. 적합한 루테늄 라벨링 기는 예를 들어 EP 0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 및 WO 92/14138 에 기재되어 있다.
용어 "치료적 다중특이적 결합체" 는 인간에서 사용할 것이 의도되는 다중특이적 결합체이다. 하나의 구현예에서 다중특이적 결합체는 다중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서 다중특이적 또는 이중특이적 항체는 모노클로날 항체이다. 하나의 구현예에서 다중특이적 항체 또는 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화된 모노클로날 항체이다.
용어 "실험 동물" 은 가축 및 농장 동물을 포함하는 임의의 포유동물 뿐만 아니라 더욱 고등 영장류를 의미하나, 인간은 배제한다. 하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 방법은 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 개, 고양이, 및 영장류 예컨대 여우원숭이, 원숭이, 마모셋, 및 유인원을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 실험 동물로부터 수득되는 샘플을 사용하여 수행된다. 실험 동물이 인간에 가장 근친인 작은 유인원인 경우, 큰 유인원, 특히 침팬지, 보노보, 고릴라 및 오랑우탄의 그룹이 배제된다.
용어 "총 치료적 다중특이적 결합체" 는 치료적 다중특이적 결합체의 활성 (즉, 그것의 하나 이상의 결합 파트너와 여전히 반응성), 비활성, 및/또는 결합 파트너 복합체화 여부와 무관하게, 실험 동물의 샘플에 존재하는 임의의 치료적 다중특이적 결합체를 의미한다.
용어 "활성 치료적 다중특이적 결합체" 는 하나 이상의 그것의 결합 파트너에 여전히 결합할 수 있는 실험 동물의 샘플에 존재하는 치료적 다중특이적 결합체를 의미한다.
용어 "결합 파트너-복합체화된 치료적 다중특이적 결합체" 는 하나 이상의 결합 특이부가 그것의 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 실험 동물의 샘플에 존재하는 치료적 다중특이적 결합체를 의미한다.
샘플 중 다중특이적 결합체의 양의 면역학적 확인 방법이 본원에서 보고된다.
면역학적 확인은 포획 분자, 추적자 분자, 및 탐지 분자를 사용하는 가교 검정으로서 수행된다.
포획 분자는 하나의 구현예에서 고체 상에 결합되어 있다. 포획 분자는 다중특이적 결합체의 결합 파트너 (예를 들어 이중특이적 항체의 항원 중 하나), 다중특이적 결합체의 일반적 복합체화제 (예를 들어 전장 항체의 경우에 Fc-수용체, 또는 전장 항체의 경우에 항-Fc-영역 항체), 또는 다중특이적 결합체가 결합 쌍의 제 2 파트너로 유도체화되어 있는 경우 결합 쌍의 제 1 파트너, 또는 다중특이적 결합체의 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체 중 임의의 것일 수 있다.
추적자 분자는 다중특이적 결합체의 결합 파트너 (예를 들어 이중특이적 항체의 항원 중 하나 그러나 하나의 항원이 포획 분자로서 사용되는 경우 상이한 항원이 추적자 분자로서 사용되어야 함), 다중특이적 결합체의 일반적 복합체화제 (예를 들어 전장 항체의 경우 Fc-수용체, 다만 이러한 분자는 이미 포획 분자로서 사용되지 않음, 또는 전장 항체의 경우 항-Fc-영역 항체, 다만 동일한 종류의 항체가 또한 포획 분자로서 사용되는 경우 이러한 항체는 상이한 에피토프에 결합함), 또는 다중특이적 결합체가 결합 쌍의 제 2 파트너로 유도체화되어 있는 경우 결합 쌍의 제 1 파트너 (다만, 포획 분자를 고정시키는데 사용된 것과 상이한 결합 쌍이 사용됨), 또는 다중특이적 결합체의 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체 (다만 이것은 포획 분자로서 사용되는 항-개별특이형 항체와 상이한 결합 특이부에 결합함) 중 임의의 것일 수 있다.
샘플 중 다중특이적 결합체의 양을 확인하기 위해 다중특이적 결합체의 상이한 결합 특이부에 결합하는 항-개별특이형 항체를 포획 분자 및 추적자 분자로서 사용하는 것이 유리하다고 현재 밝혀졌다.
샘플 중 다중특이적 항체의 면역학적 확인 방법에서 항-개별특이형 항체를 포획 분자 및 추적자 분자로서 사용함으로써 상기 방법은 다중특이적 결합체의 항원을 포획 및 추적자 분자로서 사용하는 방법에 비해 i) 샘플 매트릭스 중 물질에 관하여 더욱 견고하고 더 적은 간섭을 경험하고, ii) 더욱 적은 샘플 희석을 요구하고, iii) 더욱 신속히 수행될 수 있고, iv) 포획 및/또는 추적자 항체의 라벨링/유도체화/고정에 관하여 더욱 유연하다.
샘플 중, 특히 실험 동물로부터 수득된 혈청 또는 인간 혈장 함유 샘플 중 다중특이적 결합체의 양의 면역학적 확인은, 다중특이적 결합체의 항원이 포획 및 추적자 분자로서 사용되는 경우 샘플 매트릭스에 의해 크게 영향을 받는 것으로 밝혀졌다.
샘플이, 예를 들어 약물동력학적 연구가 수행되는, 실험 동물로부터 수득되는 경우, 샘플은 다중특이적 결합체 외에도 또한 실험 동물에서 유래하는 기타 밀접하게 관련되는 성분을 함유할 것이다. 예를 들어 샘플이 실험 동물의 혈액으로부터 수득된 혈청인 경우, 그것은 또한 다중특이적 결합체 (예를 들어 다중특이적 항체의 항원) 의 하나 이상의 결합 파트너 (예를 들어 수용체 또는 셰드 (shed) 수용체 분자의 가용성 리간드), 상이한 서브클래스의 면역글로불린을 다중특이적 결합체, 비-특이적 복합체화 분자 등보다 많은 또는 적은 양으로 함유할 것이다. 이들 분자는 전부 면역학적 확인 방법에서 간섭할 수 있다.
예를 들어 이중특이적 항체의 경우 샘플은 이중특이적 항체 외에도 또한 이중특이적 항체의 항원 중 하나 또는 둘다를 포함한다. 이는 자유 이중특이적 항체, 하나의 항원과 복합체화된 이중특이적 항체, 2 개의 항원과 복합체화된 이중특이적 항체 및 기타 혈청 또는 인간 혈장 성분과 비-특이적으로 복합체화된 위에 열거된 분자 각각의 혼합물의 존재를 초래한다. 자유 이중특이적 항체는 위에 개요서술된 포획 및 추적자 분자의 임의의 가능한 조합으로 탐지될 수 있다. 항원 복합체화된 항체는 원칙적으로 또한 임의의 상기 조합으로 탐지될 수 있으나, 항원-복합체화된 항체는 비-복합체화된 형태와 평형 상태에 있으므로 이중특이적 항체의 일부는 샘플에 존재하는 항체의 총량으로부터 빼지므로 방법의 민감도는 감소될 것이다. 항원-복합체화된 항체의 양은 고도로 가변적이고, 따라서 또한 고도로 가변적 방식으로 검정에 영향을 미친다. 이는 연장된 인큐베이션 시간을 사용함으로써 일부 이상 상쇄될 수 있으며, 연장된 인큐베이션 시간은 다른 한편으로는 검정 성능을 저하시킨다.
실험 동물로부터 수득된 혈청 또는 혈장 샘플 중 이중특이적 항체의 양의 면역학적 확인 방법의 민감도는 포획 분자 및 추적자 분자로서 이중특이적 항체의 상이한 결합 특이부의 CDR 에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체를 사용함으로써 개선될 수 있다고 현재 밝혀졌다. 또한 특히 결합 평형을 변위시키기 위해 연장된 인큐베이션 시간이 필수적이지 않으므로, 확인을 수행하는데 요구되는 시간은 감소될 수 있다. 부가적으로 이중특이적 항체는 항원과의 복합체화와 무관하게 포획될 수 있고, 따라서 더 적은 포획 분자가 요구되므로, 고체 표면 위의 포획 분자의 요구량/포획 분자의 밀도는 감소될 수 있다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 실험 동물로부터 수득된 샘플 중 치료적 다중특이적 결합체, 하나의 구현예에서 다중특이적 항체, 특히 이중특이적 항체의 양 또는 농도의 확인 방법이다:
a) 샘플을 다중특이적 결합체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 제 1 항-개별특이형 항체와 함께 인큐베이션하는 단계,
b) 샘플을 다중특이적 결합체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 제 2 항-개별특이형 항체와 함께 인큐베이션하는 단계, 여기서 제 2 결합 특이부는 제 1 결합 특이부와 상이함,
c) 단계 b) 에서 형성된 복합체를 치료적 다중특이적 결합체의 양 또는 농도와 상호연관시키는 단계.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체는 다중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체는 이중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서 결합 특이부는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인과 그것의 동족 항체 경쇄 가변 도메인이다.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체의 하나 이상의 결합 특이부의 결합 파트너는 항원이다. 하나의 구현예에서 항원은 각각의 결합 특이부에 대해 서로 독립적으로 가용성 항원 및 막-결합된 항원으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 항원은 각각의 결합 특이부에 대해 서로 독립적으로 수용체 리간드 및 세포 표면 수용체로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 방법은 면역검정이다. 하나의 구현예에서 면역검정은 샌드위치 면역검정이다.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체의 그것의 접합 파트너에 대한 접합은 항체의 아미노산 백본의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기 (라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노 기, 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기 및/또는 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다.
하나의 구현예에서 포획 항-개별특이형 항체는 특이적 결합 쌍을 통해 고정되어 있다. 하나의 구현예에서 포획 항-개별특이형 항체는 비오틴에 접합되어 있고, 고정은 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다.
하나의 구현예에서 추적자 항-개별특이형 항체는 탐지가능한 라벨에 특이적 결합 쌍을 통해 접합되어 있다. 하나의 구현예에서 추적자 항-개별특이형 항체는 디그옥시게닌에 접합되어 있고, 탐지가능한 라벨에 대한 연결은 디그옥시게닌에 대한 항체를 통해 수행된다.
하나의 구현예에서 실험 동물은 마모셋 및 타마린의 과의 일원, 구대륙 원숭이, 꼬마 및 마우스 여우원숭이, 긴팔원숭이 및 작은 유인원, 참 리머, 뿐만 아니라 그들의 교배물을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 치료적 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 하나의 구현예에서 인간 또는 인간화된 항체는 모노클로날 항체이다. 하나의 구현예에서 총 치료적 항체가 탐지되고, 또다른 구현예에서 활성 치료적 항체가 탐지되고, 하나의 구현예에서 그것의 항원에 결합되어 있는 치료적 항체가 탐지된다.
하나의 구현예에서 항-개별특이형 항체는 상자성 비드에 접합되어 있다.
하나의 구현예에서 항-개별특이형 항체는 고체 상에 접합되어 있다.
실험 동물 중 치료적 다중특이적 결합체의 적용과 연관되는 다양한 양상들이 전임상 연구 동안 평가되어야 한다. 특정 설정에서 샘플에 존재하는 치료적 다중특이적 결합체의 총량을 분석하는 것이 적절할 수 있거나, 또는 샘플 중 치료적 다중특이적 결합체의 특정 분절, 샘플 중 치료적 다중특이적 결합체의 특정 수식, 샘플 중 그것의 하나 이상의 결합 파트너에 결합된 샘플 중 치료적 다중특이적 결합체의 농도, 또는 하나 이상의 그것의 결합 파트너에 여전히 결합할 수 있는 샘플 중 치료적 다중특이적 결합체의 분획을 분석하는 것이 중요할 수 있다. 하나의 구현예에서 각각 총 치료적 다중특이적 결합체, 또는 활성 치료적 다중특이적 결합체, 또는 결합-파트너 복합체화된 치료적 다중특이적 결합체의 탐지 방법이 본원에서 보고된다.
총, 활성, 또는 결합 파트너-복합체화된 치료적 다중특이적 결합체는 본원에서 보고되는 방법에서 직접 탐지될 수 있다.
또한, 임의의 "비활성" 치료적 다중특이적 결합체를 간접적으로 평가하는 것이 또한 가능하다. 그러한 비활성 치료적 다중특이적 결합체는 예를 들어 그것의 항원 중 하나 또는 둘다에 결합된 치료적 이중특이적 항체, 또는 교차-반응성 항원에 결합된 치료적 이중특이적 항체, 또는 치료적 이중특이적 항체에 대항하는 자가 항체에 의해 차단되는 치료적 이중특이적 항체일 수 있다. 총 다중특이적 결합체의 합계가 활성 다중특이적 결합체 및 결합 파트너-복합체화된 다중특이적 결합체의 합계 초과에 이르는 경우, 그것의 상응하는 결합 파트너에 결합되지 않은 비활성 다중특이적 결합체를 포함하는 다중특이적 결합체의 부가적 분획이 존재할 것이다.
예를 들어, 총, 활성 또는 결합 파트너-복합체화된 치료적 다중특이적 결합체를 분석하는 다양한 검정 시스템이 이용가능하다.
총 다중특이적 결합체는 예를 들어 소위 경쟁 면역검정 시스템에서 또는 소위 샌드위치 유형 검정 시스템에서 탐지될 수 있다.
그러한 검정은 세정 단계 없이 (동종 면역검정) 또는 세정 단계 (이종 면역검정) 를 포함하여 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서 총 치료적 다중특이적 결합체의 양은 샌드위치 유형 면역검정으로 탐지되고, 여기에서 항-개별특이형 항체는 그러한 샌드위치 검정의 양 측면에서 사용되고, 2 개의 항-개별특이형 항체는 다중특이적 결합체의 상이한 결합 특이부에 특이적으로 결합한다. 그러한 샌드위치의 한 측면에서 사용되는 항-개별특이형 항체는 고체 상 (종종 포획 항-개별특이형 항체로 언급됨) 에 결합되어 있거나 결합할 수 있지만, 그러한 샌드위치의 다른 측면에서 사용되는 항-개별특이형 항체는 직접 또는 간접 탐지가 촉진되게 하는 방식으로 라벨링되어 있다 (소위 추적자 항-개별특이형 항체). 그러한 샌드위치 검정 절차에서 결합된 추적자 항-개별특이형 항체의 양은 연구되는 샘플 중 치료적 다중특이적 결합체의 양과 직접 상관관계가 있다.
당 기술분야 (예를 들어 US 2003/0068664) 에서 활성 치료적 항체의 탐지를 허용하는 검정 시스템이 알려져 있다. 그러한 시스템은 고체 상에 대한 항원의 결합, 이러한 결합된 항원에 대한 치료적 항체의 결합 및 고체 상에 항원을 통해 결합된 치료적 항체의 탐지를 요구한다.
샘플 중 활성 다중특이적 결합체의 탐지는 편리한 최첨단 절차에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 총 치료적 다중특이적 결합체 또는 그것의 결합 파트너와 복합체화된 치료적 다중특이적 결합체의 분획의 탐지는 매우 복잡하고, 꽤 상이한 검정 설정을 요구하고, 특히 상이한 검정 각각에 대한 맞춤 시약을 요구한다. 본원에서 보고되는 방법으로 서로 유사한 시험 시스템에서 활성 치료적 다중특이적 결합체, 총 치료적 다중특이적 결합체, 또는 결합 파트너-복합체화된 치료적 다중특이적 결합체를 평가하는 것이 가능하다. 그것의 성질에 의해 총, 활성, 또는 결합 파트너-복합체화된 치료적 다중특이적 결합체의 이러한 종류의 비교 평가는 일단 치료적 다중특이적 결합체의 이들 다양한 분획 사이에서 정량적 비교가 이루어진 후에 유리할 것이다.
하나의 구현예에서 활성 치료적 다중특이적 결합체를 탐지하는 샌드위치 유형 검정 포맷이 설정된다. 하나의 구현예에서 치료적 다중특이적 결합체의 하나의 결합 특이부에 결합하는 항-개별특이형 항체가 포획 항-개별특이형 항체로서 사용되고, 그러한 샌드위치 검정의 탐지 측면은 다중특이적 결합체의 각각 다른 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합되는, 라벨링된 형태의, 항원을 이용하거나, 또는 대안적으로 다중특이적 결합체의 각각 다른 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합되는 항원의 결합 후에, 치료적 다중특이적 결합체에 의해 인지되는 에피토프에 결합하지 않거나 그와 경쟁하는 제 2 항체를 이용하며, 여기에서 제 2 항체는 특이적으로 탐지가능하고/거나 직접 또는 간접 탐지가 촉진되게 하는 방식으로 라벨링되어 있다.
결합 파트너-복합체화된 치료적 다중특이적 결합체는 하나의 구현예에서 포획 항-개별특이형 항체로서 다중특이적 결합체의 하나의 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체를 사용하는 샌드위치 유형 검정 포맷으로 탐지된다. 상기 탐지에서 치료적 다중특이적 결합체의 에피토프와 경쟁하지 않는 에피토프에서 다중특이적 결합체의 상이한 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합되는 결합 파트너에 결합하는 제 2 항체가 사용된다. 상기 제 2 항체는 하나의 구현예에서 직접 또는 간접 탐지가 촉진되게 하는 방식으로 라벨링되어 있다.
직접 탐지를 위해 라벨링 기는 임의의 알려진 탐지가능한 마커 기, 예컨대 염료, 발광 라벨링 기 예컨대 화학발광 기, 예를 들어 아크리디늄 에스테르 또는 디옥세탄, 또는 형광 염료, 예를 들어 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 옥사진, 레소루핀, 시아닌 및 그의 유도체로부터 선택될 수 있다. 라벨링 기의 기타 예는 발광 금속 착물, 예컨대 루테늄 또는 유로퓸 착물, 예를 들어 ELISA 또는 CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay) 에서 사용되는 효소, 및 방사선동위원소이다. 전기화학발광에 의해 탐지될 수 있는 금속 킬레이트는 또한 하나의 구현예에서 탐지가능한 라벨로서 사용되는 신호-방사 기이고, 루테늄 킬레이트가 특히 바람직하다. 하나의 구현예에서 라벨링 기는 루테늄 (비스피리딜)3 2+ 킬레이트이다.
간접 탐지 시스템은, 예를 들어, 탐지 시약, 예를 들어, 추적자 항-개별특이형 항체가 바이오아핀 결합 쌍의 제 1 파트너로 라벨링되어 있는 것을 포함한다. 적합한 결합 쌍의 예는 합텐 또는 항원/항체, 비오틴 또는 비오틴 유사체 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스테오비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산, 및 수용체/리간드, 예를 들어, 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬이다. 하나의 구현예에서 제 1 결합 쌍 일원은 합텐, 항원 및 호르몬을 포함한다. 하나의 구현예에서 합텐은 디그옥시게닌, 테오필린, 카르보란, 및 비오틴 뿐만 아니라 그의 유사체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 그러한 결합 쌍의 제 2 파트너, 예를 들어 항체, 스트렙타비딘 등은 통상적으로, 예를 들어, 위에 언급된 라벨에 의한, 직접 탐지를 허용하도록 라벨링되어 있다.
면역검정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 검정을 수행하는 방법 뿐만 아니라 실제적 적용 및 절차가 관련 교재에 요약되어 있다. 관련 교재의 예는 Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates in "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990) 221-278, Eds. R. H. Burdon and v. P. H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam) 및 면역학적 탐지 방법을 다루는 다양한 권 "Methods in Enzymology", Eds. S. P. Colowick, N. O. Caplan and S. P., Academic Press), 특히 권 70, 73, 74, 84, 92 및 121 이다.
모든 상기 면역학적 탐지 방법에서 이용되는 시약의 결합, 예를 들어 항체의 그것의 상응하는 항원에 대한 결합을 허용하는 시약 조건이 선택된다. 당업자는 용어 복합체를 사용하여 그러한 결합 사건의 결과를 언급한다. 본 발명에 따른 검정 방법에서 형성되는 복합체는 최첨단 절차에 의해 샘플 중 치료적 다중특이적 결합체의 상응하는 농도와 상호연관된다. 이용되는 탐지 시약에 따라 이러한 상호연관 단계는 총, 활성 또는 결합 파트너-복합체화된 치료적 다중특이적 결합체의 농도를 초래할 것이다.
상이한 검정에서 하나의 동일한 시약, 항-개별특이형 항체의 사용으로 인해 수득되는 값은 서로 쉽게 비교되고, 심지어는 그들의 비율이 평가될 수 있다. 하나의 구현예에서 본 발명은 활성 대 총 치료적 다중특이적 결합체의 비율에 관한 것이다. 이러한 비율은 치료적 다중특이적 결합체의 효능에 대한 지표로서의 역할을 잘 할 수 있다.
본원에서 하나의 양상에서 하기 단계를 포함하는 샘플 중 다중특이적 결합체의 양의 면역학적 확인 방법이 보고된다:
- 복합체를 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부와 상이한, 다중특이적 결합체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 제 2 항-개별특이형 항체와 함께 인큐베이션하고,
그에 의해 샘플 중 다중특이적 결합체의 양을 확인함으로써
i) 다중특이적 결합체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 제 1 항-개별특이형 항체, 및
ii) 다중특이적 결합체
사이에 형성된 복합체의 양의 확인하는 단계.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체의 양의 확인은 가교 면역검정에 의한다. 하나의 구현예에서 면역검정은 포획 항체 및 추적자 항체를 포함하고, 여기에서 포획 항체는 고체 상에 접합되어 있고, 추적자 항체는 탐지가능한 라벨에 접합되어 있다. 하나의 구현예에서 포획 항체 및 추적자 항체는 둘다 다중특이적 결합체의 상이한 결합 특이부에 결합하는 항-개별특이형 항체이다.
하나의 구현예에서 포획 항체는 고체 상에 접합되어 있다.
하나의 구현예에서 추적자 항체는 탐지가능한 라벨을 포함한다.
본원에서 보고되는 방법에서 유용한 항-개별특이형 포획 항체는 고체 상에 접합되어 있을 수 있다. 접합은 하나의 구현예에서 항체의 아미노산 백본의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기 (라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노 기, 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기 및/또는 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 항-개별특이형 포획 항체는 하나의 구현예에서 고체 상에 접합된 둘 이상의 항체의 혼합물이고, 여기에서 고체 상에 접합된 둘 이상의 항체는 고체 상에 접합되어 있는 자리에서 상이하다. 예를 들어, 고체 상에 접합 둘 이상의 항체의 혼합물은 항체의 아미노산 백본의 아미노산을 통해 고체 상에 접합된 항체 및 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통해 고체 상에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, 고체 상에 접합된 둘 이상의 항체의 혼합물은 그들의 아미노산 백본의 상이한 아미노산 잔기를 통해 고체 상에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 표현 "상이한 아미노산 잔기" 는 2 가지 상이한 종류의 아미노산, 예컨대 예를 들어 라이신 및 아스파르트 산, 또는 티로신 및 글루탐산, 또는 항체의 아미노산 서열에서의 그들의 위치에서 상이한 아미노산 백본의 2 개의 아미노산 잔기를 의미한다. 후자의 경우에 아미노산은 동일한 종류 또는 상이한 종류일 수 있다. 표현 "항체 자리에서 상이하다" 는 자리의 종류, 예를 들어 아미노산 또는 당 알코올 기, 또는, 예를 들어 항체가 고체 상에 접합되어 있는 아미노산 백본의 아미노산의 수에서 상이함을 의미한다. 반대로 본원에서 보고되는 방법에서 유용한 추적자 항체에도 같다.
방법의 하나의 구현예에서 면역검정은 포획 항체, 추적자 항체 및 탐지 항체를 포함하고, 여기에서 포획 항체는 스트렙타비딘을 통해 고체 상에 접합된 다중특이적 결합체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 비오티닐화된 항-개별특이형 항체이고, 추적자 항체는 디그옥시게닌에 접합된 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 결합체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체이고, 탐지 항체는 호오스래디시 퍼옥시다제에 접합된 디그옥시게닌에 대항하는 항체이다.
하나의 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 다중특이적 결합체를 포함하는 샘플을 다중특이적 결합체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 제 1 항-개별특이형 항체와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 제 1 항-개별특이형 항체와 다중특이적 결합체 사이에 복합체가 형성되는 단계,
- 항-개별특이형 포획 항체와 다중특이적 결합체 사이의 복합체를 제 1 항-개별특이형 항체가 결합하는 결합 특이부와 동일하지 않은, 즉 상이한 다중특이적 결합체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 제 2 항-개별특이형 항체와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 제 1 항-개별특이형 항체, 다중특이적 결합체, 및 제 2 항-개별특이형 항체 사이의 복합체가 형성되는 단계, 및
- 이전 단계에서 형성된 복합체의 양을 확인하는 단계.
하나의 구현예에서 보정 곡선을 사용하여 다중특이적 결합체의 양을 확인한다.
하나의 구현예에서 제 2 항-개별특이형 항체는 탐지가능한 라벨에 접합되어 있다.
하나의 구현예에서 고정된 탐지가능한 라벨의 양을 확인하여 다중특이적 결합체의 양을 확인한다.
하나의 구현예에서 다중특이적 결합체는 이중특이적 결합체이다. 하나의 구현예에서 이중특이적 결합체는 이중특이적 항체이다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에서 제시된다. 본 발명의 정신에서 벗어나지 않으면서 제시된 절차에 변형이 가해질 수 있다고 이해된다.
실시예
실시예 1
샘플 중 이중특이적 항체의 양의 일반적 확인 방법
다중특이적 결합체/이중특이적 항체의 농도를 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 에 의해 확인했다.
마우스 혈청 또는 혈장 샘플 및 눈 용해물 중 이중특이적 항체의 정량화를 위해, 이중특이적 항체의 상이한 결합 특이부에 대항하는 비오티닐화된 및 디그옥시겐화된 모노클로날 항-개별특이형 항체를 포획 및 탐지 항체로서 사용하는 고체-상 순차적 (serial) 샌드위치 면역검정을 수행하여 이중특이적 항체의 이중특이성의 온전성을 입증했다. 이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체에 대한 이러한 설정에서 비오티닐화된 항-개별특이형 포획 항체는 VEGF-결합 자리에 특이적으로 결합하지만, 디그옥시겐화된 항-개별특이형 탐지 항체는 ANG2 결합 자리에 특이적으로 결합한다. 스트렙타비딘 코팅된 미세 역가 플레이트 (SA-MTP) 의 고체 상 위에 결합된 포획 항체, 이중특이적 항체 및 탐지 항체의 면역 복합체를 항-디그옥시게닌 항체에 커플링된 호오스래디시 퍼옥시다제로 탐지했다. SA-MTP 로부터 미결합 물질을 세정하고 ABTS-기질을 첨가한 후에, 얻어진 신호는 SA-MTP 의 고체 상에 결합된 이중특이적 항체의 양에 비례했다. 병행하여 분석된 칼리브레이터 (칼리브레이터) 를 참조하여 샘플의 측정된 신호를 농도로 변환하여 정량화를 수행했다.
이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체의 탐지를 위한 설정
제 1 단계에서 SA-MTP 를 MTP-셰이커 위에서 500 rpm 에서 1 시간 동안 농도 1 ㎍/ml 의 100 ㎕/웰 의 비오티닐화 항-개별특이형 포획 항체 용액 (항-항-VEGF 항체 항체 M-2.45.51-Bi) 으로 코팅한다. 그 동안 칼리브레이터, QC-샘플 및 샘플을 제조했다. 칼리브레이터 및 QC-샘플을 2 % 혈청 매트릭스로 희석했다. 신호가 칼리브레이터의 선형 범위 내일 때까지 샘플을 희석했다.
SA-MTP 를 항-개별특이형 포획 항체로 코팅한 후에, 플레이트를 300 ㎕/웰 세정 완충액으로 3 회 세정했다. 후속적으로 100 ㎕/웰 의 칼리브레이터, QC-샘플 및 샘플을 SA-MTP 위에 피펫팅하고, 500 rpm 에서 1 시간 동안 인큐베이션했다.
이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체는 이제 SA-MTP 의 고체 상에 항-개별특이형 항-VEGF 항체 포획 항체를 통해 그것의 VEGF 결합 자리와 결합되었다. 인큐베이션 후에 플레이트를 세정하여 미결합 분석물질을 제거했다. 그 후 농도 250 ng/ml 의 100 ㎕/웰 의 항-개별특이형 탐지 항체 (항-항-ANG2 항체 항체 M-2.6.81-Dig) 를 SA-MTP 의 웰에 첨가했다. 그 후, 플레이트를 셰이커 위에서 500 rpm 에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 세정 후에, 농도 50 mU/ml 의 100 ㎕/웰 의 제 2 탐지 항체 (폴리클로날 항-디그옥시게닌 항체-Fab-POD 접합체) 를 SA-MTP 의 웰에 첨가하고, 플레이트를 500 rpm 에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 과잉량의 제 2 탐지 항체를 제거하는 최종 세정 단계 후에, 100 ㎕/웰 기질 (ABTS) 을 첨가했다. 항체-POD 접합체는 ABTS® 기질의 발색 반응을 촉매작용한다. 그 후 신호를 ELISA 판독기에 의해 405 nm 파장 (레퍼런스 파장: 490 nm ([405/490] nm)) 에서 측정했다.
실시예 2
인간 FcRn 에 대한 FcRn 마우스 트랜스제닉에서 이중특이적 항체의 약물동력학적 특성분석을 위한 실시예 1 에 따른 검정의 사용
생활상에서
연구는 인간 FcRn (huFcRn, line 276 -/tg) 에 대한 마우스 FcRn 결핍 및 반접합 트랜스제닉인 암컷 C57BL/6J 마우스 (배경) 를 포함했다.
파트 1
모든 마우스를 2 ㎕/동물 의 적당한 용액 [즉 21 ㎍ 화합물/동물 (돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A (Kabat 의 EU Index 에 따른 번호지정) 를 포함하지 않는 항-VEGF/ANG2 항체, 사용된 항체 및 아미노산 서열에 관한 추가 세부사항에 대해 EP 12176299.1 참고) 또는 23.6 ㎍ 화합물/동물 (돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A (Kabat 의 EU Index 에 따른 번호지정) 를 포함하는 항-VEGF/ANG2 항체)] 으로 오른쪽 눈 내로 유리체내 1 회 주입했다.
마우스를 각각 6 마리의 동물을 포함하는 2 개의 그룹으로 배정했다. 혈액 샘플을 그룹 1 로부터 각각의 이중특이적 항체의 적용 후 2, 24 및 96 시에, 그룹 2 로부터 7, 48 및 168 시에 취했다.
오른쪽 마우스 눈의 유리체 내로의 주입을 World Precision Instruments, Inc., Berlin, Germany 로부터의 나노리터 주입을 위한 NanoFil Microsyringe 시스템을 사용하여 수행했다. 마우스를 2.5 % 이소플루란으로 마취하고, 마우스 눈의 시각화를 위해 Leica MZFL 3 현미경과 40 배 배율 및 환형 광원과 Leica KL 2500 LCD 라이트닝 (lightning) 을 사용했다. 후속적으로, 35-게이지 바늘을 사용하여 2 ㎕ 의 화합물을 주입했다.
혈청 중 화합물 수준의 확인을 위해 각각의 동물로부터 반대쪽 눈의 안구후 정맥 얼기를 통해 혈액을 수집했다.
실온에서 1 시간 후에 3 min 동안 4 ℃ 에서 원심분리 (9,300 x g) 에 의해 혈액으로부터 50 ㎕ 이상의 혈청 샘플을 수득했다. 원심분리 직후 혈청 샘플을 동결시키고, 분석 전까지 -80 ℃ 에서 동결 상태로 저장했다.
그룹 1 의 동물의 처리된 눈을 처리 후 96 시에 단리했고, 그룹 2 의 동물의 처리된 눈을 처리 후 168 시에 단리했다.
샘플을 분석 전까지 -80 ℃ 에서 동결 상태로 저장했다.
파트 2
모든 마우스를 200 ㎕/동물 의 적당한 용액 [즉 21 ㎍ 화합물/동물 (돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A (Kabat 의 EU Index 에 따른 번호지정) 를 포함하지 않는 항-VEGF/ANG2 항체) 또는 23.6 ㎍ 화합물/동물 (돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A (Kabat 의 EU Index 에 따른 번호지정) 를 포함하는 항-VEGF/ANG2 항체)] 으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 1 회 주입했다.
마우스를 각각 5 마리의 동물을 포함하는 2 개의 그룹으로 배정했다. 혈액 샘플을 그룹 1 로부터 각각의 이중특이적 항체의 적용 후 1, 24 및 96 시에, 그룹 2 로부터 7, 48 및 168 시에 취했다.
혈청 중 화합물 수준의 확인을 위해 각각의 동물로부터 안구후 정맥 얼기를 통해 혈액을 수집했다.
실온에서 1 시간 후에 3 min 동안 4 ℃ 에서 원심분리 (9,300 x g) 에 의해 혈액으로부터 50 ㎕ 이상의 혈청 샘플을 수득했다. 원심분리 직후 혈청 샘플을 동결시키고, 분석 전까지 -80 ℃ 에서 동결 상태로 저장했다.
전체 눈 용해물 (마우스) 의 제조
실험실 동물로부터 전체 눈의 물리화학적 붕괴에 의해 눈 용해물을 수득했다. 기계적 파괴를 위해, 각각의 눈을 원추형 바닥을 갖는 1.5 ml 마이크로 바이알 내로 옮겼다. 동결 및 해동 후에, 눈을 1 ml 세포 세정 완충액으로 1 회 세정했다 (Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011). 다음 단계에서, 500 ㎕ 의 갓 제조된 세포 용해 완충액을 첨가하고, 1.5 ml 조직 분쇄 막자 (tissue grinding pestle) (Kimble Chase, 1.5 ml 막자, Art. No. 749521-1500) 를 사용하여 눈을 분쇄했다. 그 후 혼합물을 5 회 동결 및 해동시키고, 다시 분쇄했다. 남은 조직으로부터 용해물을 분리하기 위해 샘플을 4 min 동안 4,500 g 에서 원심분리했다. 원심분리 후에 상청액을 수집하고, 정량화 ELISA 에서 추가의 분석 전까지 -20 ℃ 에서 저장했다.
분석
샘플 중 이중특이적 항체의 양의 확인을 실시예 1 에 따라 수행했다.
약물동력학적 평가
약물동력학적 평가 프로그램 WinNonlinTM (Pharsight), 버전 5.2.1 을 사용하여 비-구획 분석에 의해 약물동력학적 파라미터를 계산했다.
결과
A) 혈청 농도
혈청 농도에 대한 결과가 표 1 내지 2 에 제시되어 있다.
표 1: 돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A 를 포함하지 않는 항-VEGF/ANG2 항체의 유리체내 및 정맥내 적용 후에 혈청 농도의 비교.
Figure pct00001
표 2: 돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A 를 포함하는 항-VEGF/ANG2 항체의 유리체내 및 정맥내 적용 후에 혈청 농도의 비교.
Figure pct00002
B) 왼쪽 및 오른쪽 눈의 눈-용해물 중 농도
눈 용해물 중 농도에 대한 결과가 표 3 내지 4 에 제시되어 있다.
표 3a: 오른쪽 눈 내로 유리체내 적용 후에 눈 용해물 중 돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A 를 포함하지 않는 항-VEGF/ANG2 항체의 농도.
Figure pct00003
표 3b: 정맥내 적용 후에 눈 용해물 중 돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A 를 포함하지 않는 항-VEGF/ANG2 항체의 농도.
Figure pct00004
표 4a: 오른쪽 눈 내로 유리체내 적용 후에 눈 용해물 중 돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A 를 포함하는 항-VEGF/ANG2 항체의 농도.
Figure pct00005
표 4b: 정맥내 적용 후에 눈 용해물 중 돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A 를 포함하는 항-VEGF/ANG2 항체의 농도.
Figure pct00006
실시예 3
이중특이적 항체의 약물동력학적 특성분석을 위한 검정
10 % 인간 EDTA/혈장 중 항-VEGF/ANG2 항체를 포함하는 샘플의 동일한 세트를 항원-기반 ELISA (A) 및 항-개별특이형 항체-기반 ELISA (B) 로 분석했다.
항-VEGF/ANG2 항체의 탐지를 위한 항원-기반 ELISA:
제 1 단계에서 Maxisorb 미세 역가 플레이트에 재조합 인간 안지오포이에틴 2 (ANG2) 를 1 시간 동안 직접 코팅했다. 이와 병행하여, 디그옥시게닌-라벨링된 재조합 인간 VEGF 를 미지량의 항-VEGF/ANG2 항체 또는 레퍼런스 표준을 각각 함유하는 샘플과 함께 예비-인큐베이션했다. 샘플을 디그옥시게닌-라벨링된 VEGF 와 함께 예비-인큐베이션하기 전에 10-배 희석했다. 미세 역가 플레이트의 코팅 및 세정 후에, 항-VEGF/ANG2 항체 및 디그옥시게닌-라벨링된 VEGF 의 예비-인큐베이션된 용액을 미세 역가 플레이트에 피펫팅하고, 또다른 1 시간 동안 인큐베이션했다. 예비-인큐베이션 용액으로부터의 디그옥시게닌-라벨링된 VEGF 에 결합된 항-VEGF/ANG2 항체가 고정된 ANG2 에 결합되었다. 또다른 세정 단계 후에, 폴리클로날 HRP-라벨링된 (호오스래디시 퍼옥시다제-라벨링된) 항-디그옥시게닌 항체를 플레이트에 첨가하고, 또다른 1 시간 동안 인큐베이션했다. 그 후, 플레이트를 세정하고, ABTS 기질 용액을 첨가하여 발색 반응을 촉발했다 (도 2 참고).
항-VEGF/ANG2 항체의 탐지를 위한 항-개별특이형 항체-기반 ELISA:
제 1 단계에서 SA-MTP (스트렙타비딘-코팅된 미세 역가 플레이트) 를 비오티닐화 항-개별특이형 포획 항체 용액 (항-항-VEGF 항체 항체 (M-2.45.51-BI)) 으로 코팅했다. 한편 칼리브레이터, 대조군-샘플 (QC-샘플) 및 샘플을 제조했다. 칼리브레이터 및 QC-샘플을 10 % 시노몰구스 혈장 매트릭스로 희석했다. 신호가 칼리브레이터의 선형 범위 내일 때까지 샘플을 희석했다.
SA-MTP 를 항-개별특이형 포획 항체로 코팅한 후에, 플레이트를 3 회 세정했다. 후속적으로 QC-샘플 및 샘플을 SA-MTP 위에 피펫팅하고, 500 rpm 에서 1 시간 동안 인큐베이션했다.
이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체는 SA-MTP 의 고체 상에 항-개별특이형 항-VEGF 항체 포획 항체에 대한 그것의 VEGF 결합 자리를 통해 결합되어 있다. 인큐베이션 후에 플레이트를 세정하여 미결합 분석물질을 제거했다. 그 후 항-개별특이형 탐지 항체 (항-항-ANG2 항체 항체 (M-2.6.81-DIG), 0.5 ㎍/ml) 를 SA-MTP 의 웰에 첨가했다. 그 후, 플레이트를 셰이커 위에서 500 rpm 에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 세정 후에, 제 2 탐지 항체 (폴리클로날 항-디그옥시게닌 항체-Fab-POD 접합체 (POD=퍼옥시다제)) 를 SA-MTP 의 웰에 첨가하고, 플레이트를 500 rpm 에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 과잉량의 제 2 탐지 항체를 제거하는 최종 세정 단계 후에 기질 (ABTS) 을 첨가했다. 항체-POD 접합체는 ABTS® 기질의 발색 반응을 촉매작용한다. 그 후 신호를 ELISA 판독기에 의해 405 nm 파장 (레퍼런스 파장: 490 nm ([405/490] nm)) 에서 측정했다. 10 % 인간 혈장 중 0.1 - 30 ng/ml 로부터의 보정 표준의 OD-신호를 405 nm 에서 측정했다.
표 5: 항-VEGF/ANG2 항체의 탐지를 위한 검정 (A) 및 검정 (B) 의 비교.
Figure pct00007
상이한 검정 (A) 및 (B) 로 수득된 보정 곡선이 도 3 에 제시되어 있다.
도 4 로부터 항-개별특이형 항체 기반 검정이 5 %, 10 % 및 20 % 인간 혈청의 존재시 비슷한 결과를 제공하지만, 항원-기반 검정이 큰 편차를 보임을 알 수 있다.

Claims (6)

  1. 하기 단계를 포함하는 샘플 중 다중특이적 항체의 양의 확인 방법:
    - 복합체를 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 샘플 중 다중특이적 항체의 양을 확인하여 i) 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체와, ii) 다중특이적 항체 사이에 형성된 복합체의 양을 확인하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체가 고체 상에 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-개별특이형 항체가 탐지가능한 라벨에 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈청 또는 혈장을 포함하고/거나, 세포 용해물이고/거나, 다중특이적 항체의 하나 이상의 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 샘플이 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
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