JPH09508286A

JPH09508286A - 抗体の安定性を改良するための方法

Info

Publication number: JPH09508286A
Application number: JP8504645A
Authority: JP
Inventors: スタイプ，ボリス; スタインバッハー，ステファン
Original assignee: ベーリンガーマンハイムケゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 1997-08-26
Anticipated expiration: 2015-07-06
Also published as: CA2195076C; CA2195076A1; WO1996002574A1; ATE206139T1; US5854027A; AU3075995A; EP0771325B1; EP0771325A1; JP3103116B2; DE4425115A1; DE59509642D1

Abstract

(57)【要約】機能性抗体、機能性誘導体又はそれらのフラグメントをコードする組換遺伝子を含む発現べクターによる形質転換を介して真核系又は原核系生物において向上した安定性を有する前記機能性抗体、機能性誘導体又はそれらのフラグメントを製造する方法であって、改変遺伝子であって改変されていない遺伝子と比較して置換されており、且つより頻度の高いアミノ酸をコードする少なくとも一のコドンを含む遺伝子を使用することを特徴とする方法。これにより、ジスルフィド結合のない活性抗体を製造することも可能となる。この方法の改良において、抗体を選択的に不活性化することも可能である。

Description

【発明の詳細な説明】抗体の安定性を改良するための方法本発明は抗体（AB）の安定性を改良するための方法、並びに特に診断及び治療における抗体の利用に関する。抗体バイオテクノロジーは、治療における診断（in vivo ：例えば抗原検査； in vitro：例えばイメージング）（この場合、特に長期化した血清半減期及び軽減した免疫原性を有するヒト化抗体）及び毒素学（例えば強心薬グリコシドの過剰投与）における診断を焦点とする急速に発展している分野である。更なる適用領域は、移植寛容の誘導に関して（例えば、抗−CD4AB を介する）、免疫療法( 例えば非Hodgkin リンパ腫におけるCAMPATH)に関して、並びに特に立体選択性及び部位特異性触媒可能な触媒性抗体に関して発展中である。天然抗体配列は安定性に関しては適正化されておらず、遺伝子操作されたハイブリド配列（例えばヒト化抗体又は一本鎖Ｆ_vフラグメント）は往々にしてかなり不安定である。その結果は例えば以下の通りでありうる。 − めんどうなリフォルディング； − 変性：37℃ in vivoにおいてさえもの（Ｉ）分解及び（II）免疫原性； − 損われた親和力； −貯蔵の際の凝集及び失活。溶液中の抗体を安定化するため、例えばDNAJタンパク質族由来のタンパク質（ EP−Ａ 0,556,726）又はHSP90 タンパク質族由来のタンパク質（EP−Ａ 0,551,9 16）を添加することがよいことが知られている。一方、アミノ酸配列の特異的な突然変異によって抗体を安定化する方法は今までに知られていない。抗体の中に数多くの点突然変異を導入し、そしてそのような突然変異体を安定性に関してスクリーニングすることは事実理論上可能である。しかしながら、他のタンパク質の場合、10³〜10⁴分の１の突然変異体しか改善された安定性を有さないことが明らかとされている。かかるスクリーニング法は従って非常にめんどうであり、そして更に酵素活性の如き同定可能な機能を有するタンパク質に制約される（Rollence，1988；Chen，1989；Turner，1992 ；Risse，1992；Arase，1993）。イムノグロブリンの可変ドメインの遺伝子はその開発の際の多重遺伝子重複及び突然変異に基づいて多採な変化を受ける。これらは抗体の選択性及び高い親和力をもって結合する能力に関して最適化されている(Tonegawa，1983；BereK，19 88；French，1989)。この過程において、このドメインをコードする配列はランダムに突然変異され、そして改良された抗原結合能を示すＢ細胞が選択及び増殖される(Berek，1993)。抗原結合能の最適化は主要な役割を果たすが、抗体の質は抗原親和性、ドメイン安定性、重鎖、軽鎖、可変ドメイン及び定常ドメイン間での相互作用、プロテアーゼ感受性、並びに細胞から抗体を輸送及び分泌する能力の如き数多くの要因の総合に応じるものである。従って、天然抗体は安定性に関しては必ずしも最適化されていない。 Frisch（1994）より、ヒトＶ_Kタンパク質はシステイン23／システイン88ジスルフィド結合の形成を妨げるシステイン23の置換を経て不安定となることで知られる。この不安定化はトリプトファン32をヒスチジンに置換することにより一部復帰できうる。しかしながら、これは単に偶然な結果にすぎず、更に本発明の教示とも一致しない。その理由は、Frischにより述べられているＶ_Kタンパク質REI は天然抗体のＶ_K ドメインフラグメントではなく、ミエローマ細胞系の如きにおいて過剰発現するタンパク質であるからである。REI はその組成が、天然抗体のフラグメントであるＶ_Kドメインと実質的に異なるタンパク質である。REI は例えば50位（Ｅ）及び93位（Ｑ）において異常なアミノ酸を有している。アミノ酸の立体的な配置に基づき、Ｅ50とＨ32との間で塩結合が、そしてＱ92とＨ32との間で水素結合が形成される可能性がある。天然抗体にはないかかる水素結果がこのＶ_Kタンパク質を安定化せしめる。本発明の目的は抗体の安定性を改良する方法を提供することにあり、この方法はこれらの抗体を特異的に安定化させる、不安定化させる、又は例えばジスルフィド結合の除去の如き不安定化手段の後に再安定化させることができる。本発明の目的は、真核系又は原核系生物において改良された安定性をもつ機能性抗体、機能性誘導体又はそれらのフラグメントの製造のための方法であって、前記イムノグロブリン、誘導体又はフラグメントをコードする組換遺伝子を含む発現ベクターによる形質転換を介する方法にあり、ここでこの方法は：ａ）このイムノグロブリンの可変ドメインの少なくとも一の遺伝子を共通表１− ６と対比し、そしてこのドメインと最大の相同性をもつ表を選定する；ｂ）この可変ドメインの遺伝子の中の少なくとも一のアミノ酸コドンを、 aa）このアミノ酸が選定した表の中のその位置において示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、及び／又は bb）このアミノ酸が選定した表の中のその位置において示されている場合、より高い頻度を有する記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する；ｃ）このようにして改変した遺伝子により原核系又は真核系生物を形質転換し、そして所望の活性を有する抗体、フラグメント又は誘導体を発現させる；ことを特徴とする。必要ならば、当業者に練れ親しまれた方法に従い、この抗体をこの生物から単離し、そして任意的に精製することができる。本発明の好適な態様において、この方法は以下のようにして実施する：ａ）ヒトの重鎖の可変ドメインの遺伝子における少なくとも一のアミノ酸コドンを、 aa）このアミノ酸が表１の中のその位置に示されていない場合、記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、及び／又は ab）このアミノ酸が表１の中のその位置に示されている場合、より高い頻度をもつ記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、ｂ）マウスの重鎖の可変ドメインの遺伝子における少なくとも一のアミノ酸コドンを、 ba）このアミノ酸が表２の中のその位置に示されていない場合、記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、及び／又は bb）このアミノ酸が表２の中のその位置に示されている場合、より高い頻度をもつ記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、ｃ）ヒトのカッパータイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子における少なくとも一のアミノ酸コドンを、 ca）このアミノ酸が表３の中のその位置に示されていない場合、記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、及び／又は cb）このアミノ酸が表３の中のその位置に示されている場合、より高い頻度をもつ記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、ｄ）マウスのカッパータイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子における少なくとも一のアミノ酸コドンを、 da）このアミノ酸が表４の中のその位置に示されていない場合、記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、及び／又は db）このアミノ酸が表４の中のその位置に示されている場合、より高い頻度をもつ記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、ｅ）ヒトのλタイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子における少なくとも一のアミノ酸コドンを、 ea）このアミノ酸が表５の中のその位置に示されていない場合、記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、及び／又は eb）このアミノ酸が表５の中のその位置に示されている場合、より高い頻度をもつ記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、ｆ）マウスのλタイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子における少なくとも一のアミノ酸コドンを、 fa）このアミノ酸が表６の中のその位置に示されていない場合、記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、及び／又は fb）このアミノ酸が表６の中のその位置に示されている場合、より高い頻度をもつ記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、ｇ）そして原核系又は真核系生物を形質転換し、そして所望の活性を有する抗体、フラグメント又は誘導体を発現させる。本発明に係る方法は、安定化せしめることを意図する抗体をまず配列決定し、そしてそのドメインの配列を表１〜６に記述された共通配列又はKabat(1991)の配列と対比させるように利用する。そのアミノ酸の位置を配列の最大相同性において規定する。次に、１又は複数のコドンを本発明に従い、好都合には突然変異誘発により改変してよい。一のコドンの特異的な置換で抗体の安定性において著しい変化を既にもたらすことができることが明らかである。しかしながら、２，３又はそれより多くのコドン改変することが好ましい。置換の数の最上限には所望の適用用途にとって重要である抗体のその他の性質（例えばアフィニティー、プロテアーゼ安定性、選択性）が損われるときに到達したといえる。本手順を例示に基づいて明らかにする：アミノ酸の位置はまず表１〜６又はKabat の表（1991）との配列対比により決定する。安定性が最適化されていないヒト抗体の場合、アミノ酸Ｈが重鎖の15位に存在していることが見い出された。表１はＧ又はＳが15位にあるのが好ましいことを示す。従って、ＨをＳ、又は特に好ましくはＧにより置換することが好都合である。アミノ酸Ａがこの抗体の16位にあることが見い出されたら、ＡをＱ，Ｒ又はＧと置換することが好ましい。明らかに、ＡをＧにより置換することが特に好ましい。例えば、もし抗体が35位の後方に１又は２個のアミノ酸の挿入が施されているなら、これらのアミノ酸のうちの少なくとも１個を欠失させることが好ましい（ 35ａ／35ｂを「−」と置換する）。これはその他の任意的な挿入に適用される。即ち、これらの表は、ａ，ｂ等と記述する位置にあるアミノ酸（例えば35ａ，35 ｂ）が抗体の安定化のために好適に欠失される（即ち、アミノ酸「−」により置換される）ものと解されるべきである。表１の中の100b位の場合、これは例えば表示していないアミノ酸が安定化のためにＧ又はＳにより置換されうることを意味している。しかしながら、このアミノ酸は欠失させるのが好ましい。尚、この位置においてＧ又はＳを欠失させることが同等に好都合である。本発明に係る方法により抗体を安定化させ、しかも抗原に対する特別な親和力の如きその他の性質を保持させるため、これらの性質を損わない限りアミノ酸を置換することが好ましい。この理由のため、抗原結合性ループ又はCDR においては置換を全く施さないことが好ましい。抗体誘導体及びフラグメントは当業者に練れ親しまれた方法に従って製造されうる。かかる方法は例えばEP−Ｂ 0,125,023及びEP−Ｂ 0,120,694、並びにS．L ．Morrisonら（1984）に記載されている。本発明に従って改良された抗体を製造するため、例えば可変ドメインの完全DN A を合成することが可能である（例えばSinha ら、NAR 12（1984），4539-4557 に記載のオリゴヌクレオチド合成の手段を介する）。これらのオリゴヌクレオチドはInnis 編PCR protocols，Academic Press（1990）及びBetterらJ．Biol．Ch em．267(1992)，16712-16118に記載のPCR によりカップリングされうる。クローニング及び発現は例えばAusubel ら編Current protocols in Mole cular Biology，John Wiley and Sons，New York（1989）及びRobinsonら、Hum ．Antibod．Hybridomas 2（1991）84-93に記載の標準的な方法により実施する。特異的な抗原結合活性は例えばHarlowら編 Antibodies：A Laboratory Manual 第14章、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(1988)及びMunso nら、Anal．Biochem．407(1990)，220-239に記載の競合試験により調べられうる。適当な宿主生物は例えばCHO 細胞、イムノグロブリンを産生しないリンパ細胞系、酵母、昆虫細胞及び原核細胞、例えばＥ．コリ(E．coli)である。本発明の更なる課題は、タンパク質を変性された封入体として原核系生物（例えばＥ．コリ）において単離し、そして当業者に練れ親しまれた方法（例えば、 EP−Ａ 0,364,926を参照のこと）により活性化させる方法にある。この方法においては、驚くべきことに活性化は還元条件下でも実施してよい。本発明の更なる課題は、抗体を、所望の活性を伴って細胞質ゾルの中で生物活性的に形成され、且つこれらより直接活性形態で単離されうるように本発明に従って安定化せしめる方法にある。本発明に係る方法は、前述の全ての適用分野にとっての抗体及び抗体フラグメントの安定性を改良する。更に、新規の安定抗体変異体、例えば非生理学的条件下での使用に適するようなジスルフィド結合のない抗体又は触媒性抗体であって従来安定形態では得られなかったものが本発明に従って製造されうる。触媒性抗体及びその利用は例えばCIBA Foundation Symposium on Catalytic antibodies ，London，1990 編 Chadwick D．J.，Marsh J.,第 159巻、Wiley and Sons，Chi chesterに記載されている。ジスルフィド結合のない安定化抗体は、ジスルフィド架橋を形成するシステインを別のアミノ酸に置換し、そして少なくとも１個、そして好ましくは２個以上のアミノ酸を安定性媒介アミノ酸に置き換えることにより得られる。かかる抗体は好ましくはキメラ、ヒト化、非ヒト又はヒト抗体であってβリンパ球発現型(REIタンパク質でない)に割り当てられうるものである。本発明の更なる課題は、例えば即効的な薬物速度が必要とされるときに好適に利用されうる非崩壊性不安定化抗体を製造するための方法にある。かかる抗体を得るには、上述に反する態様で少なくとも一のアミノ酸置換を実施しなくてはならない。これは、高度な頻度を有するアミノ酸を低度な頻度を有するアミノ酸により置き換えることを意味する。適当な抗体フラグメントは例えばFab，Fab’，Ｆ(ab')₂、一本鎖抗体、Ｆ_V又は個々の可変ドメインである。これらのフラグメントは免疫毒素の如き別の物質にカップリングしてもよい。本発明に係る方法は抗体の一本鎖Ｆ_V領域の安定性を改良するために、特に一本鎖免疫毒素の安定性を改良するために極めて有利である。かかる一本鎖抗原結合性タンパク質において、軽鎖と重鎖とは様々な態様で連結されている。この連結は例えばジスルフィド結合を介して、共有結合を介して、又は亜鉛錯体結合を介して達せられる。かかる一本鎖抗体及びその連結は例えばBrinkmann ら、P．N ．A．S．89(1992)，3075-3079（ペプチドリンカーを介する連結）、Brinkmanら、P．N．A．S．90(1993)，7536-7542（追加のジスルフィド結合）に記載されている。更なる免疫毒素及び連結の可能性はWO91/09871，WO91/12820及びWO91/160 69に記載されている。本発明の更なる利点は、scＦ_V（統一されていないオリゴペプチドにより連結されたＶ_H及びＶ_Lドメイン由来の一本鎖Ｆ_Vハイブリドタンパク質）が安定且つ低免疫原性形態で本発明に従って製造できうることにある。通常利用されているscＦ_Vのリンガペプチド（S．H．Jung(1994)，R．Gl ockshuber(1990)）は往々にして凝集の問題を招き、そして潜在的な免疫原である。Ｖ_HとＶ_Lドメインの共有連結は反対に分子間システイン結合によっても成し遂げられうるが、しかしかかる追加のシステインは従来誤まったジスルフィド結合を形成する可能性に基づき生じる有意なフォルディング不良を招いてしまう。本発明に係る方法は23／88位（軽鎖）、22／99（重鎖）にある保存型システインを突然変異誘発により交換すること、そして本発明に係る方法により抗体の安定性を復帰又は向上させることを可能にする。この態様において、誤まったジスルフィド結合の形成は排除される。本発明に係る方法は従って組換抗体ハイブリドの治療的用途にとって非常に重要である。更に、抗体は免疫系における選択により、多数のエフェクター機能に適合するようにテーラーメードされうる。この天然タンパク質エンジニアリングシステムは無類の有効性を有する。特製の機能性抗体ドメインの細胞質発現は、かかるエフェクター機能が細胞に導入されることを可能にする。細胞性タンパク質の活性の調節をもたらしめる用途が有利である。これは例えばタンパク質−抗体の複合形成により標的タンパク質を安定化させることによって達せられうる。これは分解速度の変化をもたらしめうる。アロステリズムエフェクター機能も可能である。第三の複合体の形成及び安定化による２つのエフェクターの接近は、例えば人工多重酵素複合体により又は誘導性オペレーターの代謝濃度の局部的な増大により代謝経路に影響を及ぼす更なる可能性をもたらしめる。しかしながら、触媒性抗体の細胞質発現が極めて有利であり、そして触媒効率に関する選択の可能性。機能性抗体の細胞質発現は本発明に従って安定化された抗体に関する単純な態様で達せられうる。本発明に係る方法の更なる利点は、発現の後に不活性形態で産生される抗体が還元条件（例えばDTE， DTT、グルタチオン）下で活性化されうることにある。本発明に係る安定化抗体は抗体用途の全分野、例えば癌及び感染症の治療において（免疫毒素として）、薬剤ターゲッティングのため、及び遺伝子治療のために有利に利用されうる。イメージング及び診断における利用は、例えば抗原−結合性物質を分析するために、同等に有利である。本発明に係る方法は、その他の理由のために既に改変されている例えばヒト化又はキメラ抗体の如き抗体の安定化にとって極めて有利である。アミノ酸のかかる修飾は不安定化をもたらし得、従って本発明に係る方法はこれらの抗体のCDR 領域の外部の追加の修飾により抗体の本来の安定性を復帰又は向上さえもせしめうる。配列データーベースの分析方法及び表１〜６の探索方法（標準配列近似）本発明は、天然イムノグロブリン配列が標準の配列集団であると仮定する。その標準の配列集団の総計は抗体機能の全ての観点に関して同等であるべきである。ある位置において天然で最も頻繁に見い出されるアミノ酸はタンパク質を最も安定化するものであろう。これは特に特定の機能ではなく、安定性に関して自然に選択されたタンパク質に適用される。ヒトの重鎖の 35，37，39，44，45，47，50，91，95，100j，100k，101 及び103位、並びに軽鎖の１，32，34，36，38，43，44，46，49，50，87，95，96及び98位において、アミノ酸はヘテロダイマーＦ_Vフラグメントの形成における重要な相互作用に関与する。ここで、選択は安定性についての主たるものではない。狙いが二量化特性を向上せしめることにあるなら、これらの位置において最も頻繁なアミノ酸を選択すべきであり、狙いが安定性を向上せしめることにあるなら、２番目又は３番目に頻繁なアミノ酸を選択することも可能である。アミノ酸の自然頻度はイムノグロブリンデーターベース由来のランダムサンプルから決定される(Kabat，1991)。このランダムサンプルは実際の率の良好な代表であることが重要である。このため、更なる追加のデーターが入手されたとき、表１〜６は一定の条件下で若干変更されうることも明らかである。理論的には、種内（例えばヒト又はマウス）及びサブタイプ内（例えばカッパー又はラムダ）での分布に関して推定を行うことができる。いくつかの近縁の配列を組織的な理由のためにデーターベースにおいて重ねて示す。その結果、データーベースは更なる修飾抜きでは適当なランダムサンプルを代表しない。この理由のため、断片のみしかわかっていない配列の間の配列距離の決定に関する問題を避けるために実質的に完璧な配列のみをデーターベースから選択する。配列であって、その位置の75％以下がわかっている配列を選ぶ。軽鎖に関しては30以下の欠失位置、そして重鎖に関しては33以下の欠失位置に相当する。従って、Kabat データーベースの以下の配列を更なる分析において利用する：タンパク質数Ｖ_L−カッパー、マウス 1068配列のうちの731 Ｖ_L−カッパー、ヒト 319 配列のうちの127 Ｖ_L−ラムダ、ヒト 148 配列のうちの82 Ｖ_L−ラムダ、マウス 74配列のうちの63 Ｖ_H、ヒト 325 配列のうちの178 Ｖ_H、マウス 1620配列のうちの883 これらの配列において、対合させた配列全ての間隔を計算及び分析する。これは一般に二項分布をもたらし、最大値はこのサブタイプの全ての配列の平均間隔の前後にある。この配列間隔分布はランダムサンプルエラーの効果を下げるために利用されうる。自然分布の配列が特定の平均間隔及び特定の間隔分布を有するなら、ランダムサンプルをデーターベースから同一の間隔分布の境界条件下で取ったとき、ランダムサンプルエラーは少なくなる。利用する境界条件は以下の通りとする：これらの配列はデーターベースからランダムに選択され、そしてそれらが予め選択しておいた配列に対しての最小及び最大距離を満足せしめるかどうか調べる。そのような場合、それらは新たなランダムサンプルに分類される。これを、ランダムサンプルのメンバーとしてのその適合性について全ての配列が調べ上げられるまで繰り返す。一般にデーターベースの配列のうちの５〜20％がこの工程で選択される。この選択を何回も繰り返すと（本ケースの場合、500回）、個々の配列はランダムサンプルを表わすようになるが、ただし他の配列との距離に応じて異なる頻度を有するものとなるであろう。最後に、この新たなランダムサンプルを個々の位置に関するアミノ酸頻度を決定するために用いる。ここで決定する頻度の場合、上記の再サンプリング工程を利用し、これによるアミノ酸であってその頻度が0.1(＝10％)未満のものは表の中に示していない。本発明を以下の実施例、図面、表及び配列プロトコールにより一層詳細に説明する。図面の説明図１：発現プラスミドｐＶ_LＨ₅（lac^p/o：lac 遺伝子のプロモーター／オペレーター領域；ompA−Ｖ_LＨ₅：外膜プロテインＡのシグナル配列をもつＶ_Lドメインに関するコード領域；tIpp：ターミネーター；f1−IG：Ｆ₁ファージ複製起点；b la：ｂラクタマーゼ遺伝子；ori：プラスミド複製起点；lacＩ：lac リプレッサー遺伝子）。この図は実寸大ではない。（このプラスミドはEP−Ｂ 0,324,162に記載のプラスミドに本質的に相当する。この特許にはこのプラスミドを利用する抗体の発現も記載されている）。図２：Ｖ_Lタンパク質の励起スペクトル。発光はＩ_Em＝360mm として測定。タンパク質濃度：PBS 中２mM。強度は任意単位で記載。図３：フォルディングした（１）及びほどいた（３）Ｖ_Lタンパク質の蛍光スペクトル並びにスペクトル差（２）。励起波長Ｉ_EX＝284nm。タンパク質濃度：PBS 中２mM。強度は任意単位で記載。実施例Ｅ．コリＫ12株 CJ236 Bio-Rad Laboratories GmbH，Munich 由来の dutl，ungl，thi-1，relAl［pCJ105(Cam^r)，F'］（Geisselsoder ら、1987） JM83 ara，D(lac-pro AB)．strA，thi-1[F801acZM15] (Yanisch-Perron ら1985] JM109 recAl，supE44，endAl，hsd R17．gyrA96， relAl，thi (lac-pro AB) (Yanisch-Perron ら1985)バクテリオファージ M13K07 Deutsche Pharmacia GmbH，Freiburg由来のヘルパーファージ(Vieira & Messing，1987)プラスミドプラスミドpV_LH₅はlac プロモーター／オペレーターのコントロール下で抗体M cPC603 のＶ_Lドメインをコードする。固定化亜鉛イオンに基づくクロマトグラフィーにより一段階でタンパク質を均質となるまで精製するため、２個のＣ末端アミノ酸アルギニン(108)及びアラニン(109)を５個のヒスチジン残基と交換する。野生型配列と異なり、106位にはイソロイシン残基の代わりにロイシン残基がある。ペリプラズマへの分泌のため、外膜プロテインＡのシグナル配列）。オリゴデオキシヌクレオチド利用するオリゴデオキシヌクレオチドはApplied Biosystems GmbH，Weitersta dt由来のDNA シンセサイザー380Aでホスホラミジット法により合成した。Ｅ．コリ培養物の増殖（Maniatisら、1982） 37℃で 180〜200rpmでの振盪による14〜20時間のインキュベーションを経て密な一夜培養物が得られる。細胞密度はOD₆₀₀の測定により決定する。プラスミドを担持している株を選定するため、適当な抗生物質を培地に加える。 LB培地：10ｇ／１の Bacto− トリプトン５ｇ／１の Bacto−酵母抽出物５ｇ／１のNaCl 2.5ml/１の１ＭのNaOHプラスミド−DNA によるＥ．コリの形質転換（Hanahan，1983）コンピテント細胞Ｅ．コリを形質転換のためにコンピテントにする。 250ml のエーレンマイヤーフラスコ中の20mlのTYM 培地に0.5ml のＥ．コリ株の定常期一夜培養物を利用して接種し、そして 0.2〜0.8 のOD₆₀₀に至るまで37 ℃でインキュベートする。0.5〜0.9 のOD₆₀₀に至るまで増殖させた後、それを全容量500ml のTYM 培地で満たし、そして更にインキュベートする。0.6 のOD₆₀₀ に達したとき、細菌懸濁物を冷却する。細菌を4200rpm で４℃で15分遠心し、上清液をデカンテーションし、そしてペレットを全部で80mlのTfB Ｉバッファーに再懸濁し、その上清液をデカンテーションし、そしてペレットを全部で16mlの氷冷TfB IIバッファーに再懸濁する。 TYM ：20ｇ／１の Bacto− トリプトン５ｇ／１の Bacto−酵母抽出物 100mM のNaCl 10mMのMgSO₄ TfB Ｉ：30mMのKOAc TfB II：75mMのCaCl₂ 50mMのMnCl₂ 10mMのKCl 100mM のKCl 10mMのNaMOPS pH 7.0 10mMのCaCl₂ 15％（ｖ／ｖ）のグリセロール 15％（ｖ／ｖ）のグリセロール形質転換プラスミドDNA を30μｌの容量の水に加え、そしてこの細菌懸濁物とよく混合する。氷上で60分後、それを37℃で 115秒間ヒートショックにかける。氷上で１分後、800μｌのLB培地を加え、細菌懸濁物を10mlの培養チューブに移し、そして約180rpm及び37℃で60分インキュベートする。全形質転換混合物を抗生物質含有LBプレート上に注ぎ、そして37℃で12〜16時間インキュベートする。突然変異誘発突然変異誘発はin vitro突然変異誘発キットMuta−Gene（商標）（Bio Rad La boratories GmbH，GER）のバッファーを利用し、Kunkel 1985，Geisseloderら、 1987，Vieira and Messing，1987に従って実施する。DNA フラグメントの再クローニングによる二重突然変異体の作製個々の突然変異体(2.3)のコンホメーション安定性を決定する最中、Ala 15 Le u，Asn 90 Gln及びPhe 32 Tyrがとりわけ安定効果を有することが示された。安定効果の増強を調べるため、二重突然変異体Ala 15 Leu／Asn 90 Gln及びAla 15 Leu／Phe 32 Tyrを作製する。これらの二重突然変異体は既に作製されている個々の突然変異体のDNA フラグメントを再クローニングすることにより調製される。制限消化の後、これらのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分け、所望のフラグメントをアガロースから切り出し、それよりDNA を単離し、そして適当な態様でライゲーションさせる。Ala 15 Leu／Phe 32 Tyr：制限エンドヌクレアーゼBstEIIによる突然変異体Ala 15 Leu及びPhe 32 TyrのプラスミドDNA の消化は各ケースにおいて２種類のフラグメントをもたらしめた。3232bpのフラグメントはアミノ酸32の塩基を含み、そして870bp のフラグメントはアミノ酸15の塩基を含む。未修飾抗体に比してのほどけた抗体の自由エンタルピーの差は22.6KJ／mol(理論上は20.8)であることが見い出された。Ala 15 Leu／Asn 90 Gln：制限エンドヌクレアーゼ XmnＩによる突然変異体Ala 15 Leu及びAsn 90 GlnのプラスミドDNA の消化は各ケースにおいて２種類のフラグメントをもたらしめた。2991bpのフラグメントはアミノ酸15の塩基を含み、そして1110bpのフラグメントはアミノ酸90の塩基を含む。非修飾抗体に比してのほどけた抗体の自由エンタルピーの差は23.9KJ／mol(理論上は23.6)であることが見い出された。組換Ｖ_Lドメインの発現及びプロセシングＶ_Lタンパク質をエッシェリヒア・コリ（Ｅ．コリ）中でlac オペレーター／リプレッサーのコントロール下で発現させ（Skerra a コード領域には外膜プロテインＡ（ompA）のシグナル配列が先行し、それはタンパク質が内性Ｅ．コリシグナルペプチダーゼにより切断される際にそれのペリプラズマへの分泌を及ぼしめる。ペリプラズマへの分泌は、そこに存在する高い（酸化性）レドックス電位の結果としての中枢ジスルフィド結合の形成を可能にし、それ故低い（還元性）レドックス電位では細胞質内で不可能であるＶ_Lタンパク質の適正なフォルディングを可能にする（Gilbert 1 990）。タンパク質は、ペリプラズマの選択的溶解によりその他のペリプラズマ系タンパク質との混合物の中から容易に単離される(１ＭのNaCl／１mMのEDTA／50mMのトリス／HCl pH8.0)。アミノ酸108 及び109 の代わりに存在する５個のＣ末端ヒスチジン残基は、固定化亜鉛イオンに基づくクロマトグラフィーによる一段階での均質に至るまでのタンパク質の簡単な精製を可能にする（Hochuli ら、1988）。 10リットルのLB培地に200ml のＥ．コリ JM 83／p Ｖ_LＨ₅の定常期一夜培養物を接種し、そして10mlのAMP ストック溶液と混合する。その培養物に通気を施し、そして室温において0.7 のOD₆₀₀に至るまでインキュベートする（約４時間）。 lac オペレーター／リプレッサーのコントロール下でのＶ_LＨ₅発現を誘導するため、５mlの１ＭのIPTG溶液を５mlのAMP ストック溶液と共に加える。このAMP ストック溶液は選択抗生物質の損失を補充し、その損失は溶解した細菌がペリプラズマから培地にβラクタマーゼを放出することにより生ずる。これを更に３時間インキュベートする。細菌を回収するため、約430ml の部を Beckmann遠心機のローターJA−10用の500ml の遠心カップに満たし、そしてそれぞれ6000rpm で10分遠心する。６本の遠心カップを用い、４回の遠心が必要となる。上清液をデカンテーション後、約30ｇの細菌ペレットが一般に得られる。ペリプラズマの溶解細胞のグラム当り２mlのペリプラズマ溶解バッファーを加え、細菌を撹拌しなから４℃で再懸濁し、そして少なくとも更に１時間強く撹拌する。その後、乳状の薄茶色の懸濁物をBeckmann遠心機のローターJA−20用遠心カップに移し、そして20,000rpm で４℃での20分の遠心によりスフェロプラストを分離させる。組換Ｖ_Lタンパク質を含む透明な薄黄色上清液を50mlのFalcon槽に移し、そして４℃ にて使用時まで保存する。固定化亜鉛イオンでのクロマトグラフィー（Hochuli ら、1988，Linderら、1992 ）Ｖ_Lドメインの５個のＣ末端システイン残基は固定化亜鉛イオンに対するタンパク質の結合性を、それが一段階で均質となるまで精製されうる程に高める。本ケースにおいては、亜鉛をイミノジアセテートキレートリガンドに複合させ、そのリガンドをSepharose にカップリングさせる。これにより、タンパク質のヒスチジン残基は亜鉛上の錯体リガンドとして働き、従ってカラム材料に結合する。溶出はイミダゾールにより成し遂げられ、それは亜鉛上のヒスチジン残基を追い出す。カラムの準備カラム(German Pharmacia GmbH，Freiburg 由来の約５mlの錯形成性Sepharose Fast Flow)を再生するため、まずそれを50mlの再生バッファーですすぎ、次いで20mlの水ですすいで錯形成亜鉛を除去し、これによってもタンパク質はまだ結合している。次にカラムを15mlの塩化亜鉛溶液（１mg/ml）、15mlの水及び50ml のカラム平衡バッファーですすぐ。クロマトグラフィークロマトグラフィーは約 0.7〜１ml／min の流速で行い、そして各ケースにつき10分のフラクションを集める。ペリプラズマリゼート（約70ml）を適用後、OD₂₈₀がＯ値に戻るまでカラム平衡バッファーですすぐ。弱く結合したタンパク質をカラム平衡バッファー中の10 mMのイミダゾールですすぐことにより溶出させる。Ｖ_LＨ₅ドメインはカラム平衡バッファー中の10から300mM に至るイミダゾールの直線勾配において、約70mMのイミダゾールにおいて全容量200ml にて溶出する。タンパク質の純度はSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりチェックする。ペリプラズマ溶解バッファー：１ＭのNaCl １mMのEDTA 50mMのTris／HCl pH 8.0 カラム平衡バッファー：１ＭのNaCl 50mMのTris／HCl pH 8.0 再生バッファー：１ＭのNaCl 50mMのEDTA 50mMのTris／HCl pH 8.0 次に所望の量のＶ_Lタンパク質（約１〜２mg）を含むタンパク質溶液を 100倍容量の対応のバッファーに対して２回透析する。変性曲線の決定変性曲線を決定するため、Ｖ_Lタンパク質をPBS に対して透析し、そして0.2mM の濃度(2.5mg／ml；Ｍ＝12.4KDa)に調整する。タンパク質溶液から沈殿物及びその他の粒子を除くため、使用前にこれを冷蔵式Sigma 2K15遠心機で10分遠心し、そしてその上清液を新しい1.5ml のエッペンドルフ反応槽の中に移し入れる。このタンパク質溶液の５μｌのアリコートを10μｌのHamiltonピペットを用いて５mlの試験管に入れ、そして500μｌの変性バッファーと混合し、その試験管をシリコーン栓で閉じ、そして20℃で一夜インキュベーションする。０から５Ｍに至る濃度域のPBS 中の塩化グアニジニウムが変性バッファーを担う。２Ｍ以上では濃度を 0.1Ｍの段階で上げ、そしてそれより低い濃度で 0.2Ｍの段階で下げる。装置の設定：励起波長：１_EX＝284nm 発光波長：１_Em＝360nm 励起スリット幅：２nm 発光スリット幅：10nm ２．３ほどけ状態の自由エンタルピーを決定するための変性曲線の分析変性化合物の存在下で、タンパク質はその自然コンホメーションを失い、それ故その生物学的機能を失う。尿素及び塩化グアニジニウムがこのために極めて有効である。数多くの球状タンパク質がこれらの化合物により可逆式にほどけ、そして簡単な二状態挙動を示す。これは、熱量データー（DH_cal）を平衡定数の温度−依存性から決定されうる対応のバン・ホッフ・エンタルピー（DH_vant'Hoff ）と対比することにより示されうる。２者の比は１であるべきである。多くの単独ドメインタンパク質の場合、これからの逸脱は非常に小さいことが示された。このことは、生じうる中間体が熱動力学的に不安定であることを示す。従ってそれらは無視でき、その結果変性はフォルディングされた（Ｆ）及びほどけた（Ｕ）２通りの巨視的状態間での協奏的転移であると考えられる(Privalov 1979)。本ケースにおいては、ほどけたタンパク質は同一又は非常に近いエネルギーを有する互いへと迅速に変換しうる順応体（コンフォーマー）のアンサンブルを表わす。理想的なケースでは、変性状態はランダムコイルを形成するであろう。即ち、結合のまわりの回転は完璧に自由であり、且つ全ての隣接の回転と独立しているべきである。溶媒、タンパク質の主鎖原子及びアミノ酸の20種類の側鎖間での相互作用は理想的な同一の状態とはならないため、理想的なランダムコイルから逸脱する挙動が予測されるであろう（Tanford 1970）。実際の鎖の立体的な要件も短い域の相互作用の維持に貢献する（Flory 1969）。ところで、濃厚な塩化グアニジニウム溶液中では、その他の変性剤により生ずるものに相当する「完璧」なほどけが達成される(Pr rich 1986)を利用すると、変性状態における個々の集団の構造及び動力学を調べることも可能である。これは急平衡における数多くの有意に異なる「多形態」順応体と認められる（Dobsonら、1985）。タンパク質突然変異体の調査は、変性状態のコンパクトさ及びそのエネルギーが個々の突然変異により強力に影響を受けることを強く示唆する（Shortle 1992）。２通りの状態を利用し、熱動力学的平衡定数Ｋは以下の通りに定義されうる：ほどけの自由エンタルピーはそれらより以下の通りに誘導できうる：〔Ｕ〕／〔Ｆ〕比は、円二色性、UV吸収又は蛍光スペクトルの如き天然及びほどけ状態の特性の相違を検出する多くの吸光測定法により決定されうる。最後の方法が最も高感度であり、そして最低量のタンパク質を必要とする。測定されたシグナルＩは従ってフォルディング（Ｉ_f）とほどけ（Ｉ_u）との成分の和より成る：これらは対応の平衡濃度〔Ｆ〕及び〔Ｕ〕に比例する。２通りの状態の物質− 特異性吸光特性により得られる比例定数としてＣ_f及びＣ_uを利用することにより、以下が得られる：物質量の残高（〔Ｐ〕：タンパク質濃度）を利用し変換、並びに完全にフォルディングした及びほどけた状態のシグナル強度を表わす_cf〔Ｐ〕＝ｉ_f０及び_cu〔Ｐ〕＝Ｉ_u０を考慮して（４）及び（５）を除することにより以下が得られる：完全にフォルディングした及びほどけた状態のシグナル強度は変性剤の濃度に依存しうる。これは、線形依存性による良好な近似式と考慮することができる。本明細書のＶ_Lドメインの場合、これはほどけた状態にのみ適用され、そして（７）を利用して考慮される。タンパク質を塩化グアニジニウムの如き変性剤によりほどいた場合、タンパク質の安定性は変性剤の濃度の上昇と共に低下し、換言すればΔＧ_uは小さくなる。２通りの状態の挙動を示すタンパク質についての変性曲線を分析するうえで、変性剤の濃度とΔＧ_uと間に直線関係があるとみなされる(Pace 1986，Alonso an d Dill 1991)。（３）及び（６）を利用し、フォルディング形態及びほどけた形態が検出可能な濃度において存在しているような変性剤濃度域内でΔＧ_uが計算できる。変性剤非存在下でのほどけ状態の自由エンタルピーは、ゼロモラーの変性剤に対する直線外挿により得られ、ここで（８）の適応性が基礎として考慮される。第２の分析方法は（２），（３），（６），（７）及び（８）を利用してパラメーター（９）に関するシグナル強度についての式を誘導し、次いで最少二乗誤差の原理に従って曲線の理論形態を実測値に適合させることによる。以下の数量がパラメーターとしてある：Ｖ_L突然変異体の変性曲線を確立するため、測定パラメーターとして蛍光を利用する。Ｖ_Lタンパク質の蛍光は主に１個のトリプトファン残基35に起因し、それは中枢のジスルフィド結合に対しタンパク質の内側にパッキングされている。ほどけの際、トリプトファン残基はより親水性の環境に出ていき、そしてジスルフィド結合との相互作用は失われる。フォルディングしたタンパク質の非常に低い蛍光はジスルフィド結合の蛍光消失効果に基づく（Cowgill 1967）。図２はフォルディングした及びほどけた状態の蛍光スペクトル（０Ｍ及び５ＭのGdm HCl を伴うPBS 中で２mMのタンパク質；20℃）並びに両者のスペクトル差を示す。ほどけの際、350nm にて最大値を有するタンパク質蛍光は約16倍上昇する。従って、本ケースにおいては、蛍光は理想的な測定パラメーターであると証明され、なぜならこれはタンパク質がほどけるときに有意に変化するからである。図３は励起スペクトルを示し、350 での蛍光は励起波長に対して決定される。 280nm において際立った最大値が認められうる。PBS ４mMのKH₂PO₄ 16mMのNa₂HPO₄ 115mMのNaCl pH値は7.4 通常何回かの測定を行い、データーは（10）に従って標準化した値（（５），（６）及び（７）由来）を平均化することにより得られる。得られるパラメーターから、タンパク質の半分がほどけた状態にある濃度、即ち変性中点〔Gdm HCl〕_1/2を計算することが可能である。本ケースでは、DG_u＝０である。（８）より、（11）が得られる。個々の測定値のパラメーターを表７にまとめる。タンパク質の発現において、野生型と比べ、より安定な突然変異体の場合、収量は約９〜26mgに上昇することが驚くべきことに観察もされた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年７月１９日【補正内容】請求の範囲１．機能性抗体、機能性誘導体又はそれらのフラグメントをコードする組換遺伝子を含む発現ベクターによる真核系又は原核系生物の形質転換を介して前記生物において改良された安定性を有する前記機能性抗体、機能性誘導体又はそれらのフラグメントを製造する方法であって、ａ）前記抗体、誘導又はフラグメントの少なくとも一の可変ドメインの遺伝子を共通表１〜６と対比させ、そしてこのドメインと最大の相同性を有する表を選定し、ｂ）この可変ドメインの遺伝子の少なくとも一のアミノ酸コドンを、 aa）このアミノ酸が選定した表の中のその位置において表示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれについてのコドンにより置換する、及び／又は bb）このアミノ酸が選定した表の中のその位置において表示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、ｃ）そして前記原核系又は真核系生物をこのようにして改変した遺伝子により形質転換し、そして所望の活性を有する抗体、フラグメント又は誘導体を発現させる、方法。２．改変された遺伝子であって、アミノ酸についての少なくとも一のコドンが、ａ）ヒトの重鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 aa）このアミノ酸が表１におけるその位置に示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は ab）このアミノ酸が表１におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｂ）マウスの重鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 ba）このアミノ酸が表２におけるその位置に示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は bb）このアミノ酸が表２におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｃ）ヒトのカッパータイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 ca）このアミノ酸が表３におけるその位置に示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は cb）このアミノ酸が表３におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｄ）マウスのカッパータイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 da）このアミノ酸が表４におけるその位置に示されている場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は db）このアミノ酸が表４におけるその位置に示されていない場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｅ）ヒトのλタイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 ea）このアミノ酸が表５におけるその位置に示されている場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は eb）このアミノ酸が表５におけるその位置に示されていない場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｆ）マウスのλタイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 fa）このアミノ酸が表６におけるその位置に示されている場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は fb）このアミノ酸が表６におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ような遺伝子を使用する、請求項１記載の方法。３．前記抗体、フラグメント又は誘導体を前記生物から単離し、そして精製する、請求項１又は２記載の方法。４．前記発現を原核系又は真核系生物において実施し、そして前記抗体、フラグメント又は誘導体が細胞質ゾルの中で機能的に形成される、請求項１〜３記載の方法。５．少なくとも２組のコドンを置換する、請求項１〜４記載の方法。６．更に、前記抗体、フラグメント又は誘導体の中の少なくとも一のジスルフィド結合形成システインを別のアミノ酸により置換する、請求項１〜５記載の方法。７．全てのジスルフィド結合形成システインを置換する、請求項６記載の方法。８．抗体、機能性フラグメント又は誘導体の標的式不安定化のために頻度の高いアミノ酸を頻度の低いアミノ酸と交換する、請求項１〜５記載の方法を改良した方法。９．抗体のＶ_H及びＶ_Lドメイン由来のハイブリドタンパク質であって、分子間システイン結合を介して連結され、且つそれらにおける重鎖の22及び／99位、軽鎖の23及び／又は88位にあるシステインが別のアミノ酸により置換され、そして少なくとも１個の更なるアミノ酸、好ましくはCDR 領域の外側にあるアミノ酸が請求項１〜５の方法に従って置換されている、ハイブリドタンパク質。 10．前記抗体、フラグメント又は誘導体を機能性タンパク質を形成するために in vitroで還元条件下でフォルディングせしめる、請求項３記載の方法。【手続補正書】【提出日】１９９７年２月１３日【補正内容】請求の範囲１．機能性抗体、機能性誘導体又はそれらのフラグメントをコードする組換遺伝子を含む発現ベクターによる真核系又は原核系生物の形質転換を介して前記生物において改良された安定性を有する前記機能性抗体、機能性誘導体又はそれらのフラグメントを製造する方法であって、ａ）前記抗体、誘導体又はフラグメントの少なくとも一の可変ドメインの遺伝子を下記の表１〜６と対比させ、そしてこのドメインと最大の相同性を有する表を選定し、ｂ）この可変ドメインの遺伝子の少なくとも一のアミノ酸コドンを、 aa）このアミノ酸が選定した表の中のその位置において表示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、及び／又は bb）このアミノ酸が選定した表の中のその位置において表示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、ｃ）そして前記原核系又は真核系生物をこのようにして改変した遺伝子により形質転換し、そして所望の活性を有する抗体、フラグメント又は誘導体を発現させる、方法。２．改変された遺伝子であって、アミノ酸についての少なくとも一のコドンが、ａ）ヒトの重鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 aa）このアミノ酸が表１におけるその位置に示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は ab）このアミノ酸が表１におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｂ）マウスの重鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 ba）このアミノ酸が表２におけるその位置に示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は bb）このアミノ酸が表２におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｃ）ヒトのカッパータイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 ca）このアミノ酸が表３におけるその位置に示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は cb）このアミノ酸が表３におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｄ）マウスのカッパータイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 da）このアミノ酸が表４におけるその位置に示されている場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は db）このアミノ酸が表４におけるその位置に示されていない場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｅ）ヒトのλタイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 ea）このアミノ酸が表５におけるその位置に示されている場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は eb）このアミノ酸が表５におけるその位置に示されていない場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｆ）マウスのλタイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 fa）このアミノ酸が表６におけるその位置に示されている場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は fb）このアミノ酸が表６におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ような遺伝子を使用する、請求項１記載の方法。３．前記抗体、フラグメント又は誘導体を前記生物から単離し、そして精製する、請求項１又は２記載の方法。４．前記発現を原核系又は真核系生物において実施し、そして前記抗体、フラグメント又は誘導体が細胞質ゾルの中で機能的に形成される、請求項１〜３記載の方法。５．少なくとも２組のコドンを置換する、請求項１〜４記載の方法。６．更に、前記抗体、フラグメント又は誘導体の中の少なくとも一のジスルフィド結合形成システインを別のアミノ酸により置換する、請求項１〜５記載の方法。７．全てのジスルフィド結合形成システインを置換する、請求項６記載の方法。８．抗体、機能性フラグメント又は誘導体の標的式不安定化のために頻度の高いアミノ酸を頻度の低いアミノ酸と交換する、請求項１〜５記載の方法を改良した方法。９．抗体のＶ_H及びＶ_Lドメイン由来のハイブリドタンパク質であって、分子間システイン結合を介して連結され、且つそれらにおける重鎖の22及び／99位、軽鎖の23及び／又は88位にあるシステインが別のアミノ酸により置換され、そして少なくとも１個の更なるアミノ酸が請求項１〜５の方法に従って置換されている、ハイブリドタンパク質。 10．前記少なくとも１個の更なるアミノ酸がCDR 領域の外側にある、請求項９記載のハイブリドタンパク質。 11．前記抗体、フラグメント又は誘導体を機能性タンパク質を形成するために in vitroで還元条件下でフォルディングせしめる、請求項３記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 19/00 ＺＮＡ 9356−4ＨＣ０７Ｋ 19/00 ＺＮＡＣ１２Ｎ 1/21 9282−4ＢＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 // Ｇ０１Ｎ 33/531 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/531 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スタインバッハー，ステファンドイツ連邦共和国，デー−82661 レンクリース，トゥルツェルシュトラーセ８

Claims

【特許請求の範囲】１．機能性抗体、機能性誘導体又はそれらのフラグメントをコードする組換遺伝子を含む発現ベクターによる形質転換を介して真核系又は原核系生物において改良された安定性を有する前記機能性抗体、機能性誘導体又はそれらのフラグメントを製造する方法であって、ａ）前記抗体、誘導又はフラグメントの少なくとも一の可変ドメインの遺伝子を共通表１〜６と対比させ、そしてこのドメインと最大の相同性を有する表を選定し、ｂ）この可変ドメインの遺伝子の少なくとも一のアミノ酸コドンを、 aa）このアミノ酸が選定した表の中のその位置において表示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれについてのコドンにより置換する、及び／又は bb）このアミノ酸が選定した表の中のその位置において表示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換する、ｃ）そして前記原核系又は真核系生物をこのようにして改変した遺伝子により形質転換し、そして所望の活性を有する抗体、フラグメント又は誘導体を発現させる、方法。２．改変された遺伝子であって、アミノ酸についての少なくとも一のコドンが、ａ）ヒトの重鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 aa）このアミノ酸が表１におけるその位置に示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は ab）このアミノ酸が表１におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｂ）マウスの重鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 ba）このアミノ酸が表２におけるその位置に示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は bb）このアミノ酸が表２におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｃ）ヒトのカッパータイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 ca）このアミノ酸が表３におけるその位置に示されていない場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は cb）このアミノ酸が表３におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｄ）マウスのカッパータイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 da）このアミノ酸が表４におけるその位置に示されている場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は db）このアミノ酸が表４におけるその位置に示されていない場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｅ）ヒトのλタイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 ea）このアミノ酸が表５におけるその位置に示されている場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は eb）このアミノ酸が表５におけるその位置に示されていない場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；ｆ）マウスのλタイプ軽鎖の可変ドメインの遺伝子においては、 fa）このアミノ酸が表６におけるその位置に示されている場合、記述されているアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている、及び／又は fb）このアミノ酸が表６におけるその位置に示されている場合、より高い頻度を有する記述されたアミノ酸のいづれかについてのコドンにより置換されている；のような遺伝子を使用する、請求項１記載の方法。３．前記抗体、フラグメント又は誘導体を前記生物から単離し、そして精製する、請求項１又は２記載の方法。４．前記発現を原核系又は真核系生物において実施し、そして前記抗体、フラグメント又は誘導体が細胞質ゾルの中で機能的に形成される、請求項１〜３記載の方法。５．少なくとも２組のコドンを置換する、請求項１〜４記載の方法。６．更に、前記抗体、フラグメント又は誘導体の中の少なくとも一のジスルフィド結合形成システインを別のアミノ酸により置換する、請求項１〜５記載の方法。７．全てのジスルフィド結合形成システインを置換する、請求項６記載の方法。８．抗体、機能性フラグメント又は誘導体の標的式不安定化のために頻度の高いアミノ酸を頻度の低いアミノ酸と交換する、請求項１〜５記載の方法を改良した方法。９．請求項１〜７記載の方法に従って得られる改変され、安定性の改良された機能性抗体、機能性誘導体又はフラグメント。 10．請求項１〜７記載の方法に従って得られる抗体のＶ_H及びＶ_Lドメイン由来の安定性改良型ハイブリドタンパク質。 11．βリンパ球発現型に相当しうる組換、ジスルフィド結合非含有、機能性、ヒト化、キメラ、非ヒト、又はヒト抗体、誘導体又はフラグメント。 12．抗体のＶ_H及びＶ_Lドメイン由来のハイブリドタンパク質であって、分子間システイン結合を介して連結され、且つそれらにおける重鎖の22及び／99位、軽鎖の23及び／又は88位にあるシステインが別のアミノ酸により置換され、そして少なくとも１個の更なるアミノ酸、好ましくはCDR 領域の外側にあるアミノ酸が請求項１〜５の方法に従って置換されている、ハイブリドタンパク質。 13．癌、自己免疫疾患及び感染症疾患の如きのための薬剤を製造するための請求項１〜８の記載に従って得られる抗体の利用。 14．抗体に結合する物質の免疫分析の如きのための診断試薬における請求項１〜７に従って得られる抗体の利用。 15．前記抗体、フラグメント又は誘導体を機能性タンパク質を形成するために in vitroで還元条件下でフォルディングせしめる、請求項３記載の方法。 16．触媒抗体としての請求項１〜７記載に従って得られる抗体の利用。