JP2012031211A - 抗体の改良方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒト抗体またはヒト化抗体の可変領域軽鎖(以下、VL鎖)の12位(Kabat numberingに従う)に位置するプロリンを、下記のいずれかのアミノ酸に置換することを特徴とする、ヒト抗体またはヒト化抗体を改良して発現量および/または安定性の向上した抗体を得る方法;
12位:Ser,His,Val,Gly,Leu,Arg,Phe,MetまたはGlu
および当該方法により得られた、発現量および/または安定性の向上したヒト抗体またはヒト化抗体またはヒト抗体もしくはヒト化抗体フラグメント。
【選択図】なし
Description
1)ヒト抗体またはヒト化抗体の可変領域軽鎖(以下、VL鎖)の8位、12位、15位または18位(Kabat numberingに従う)の少なくともいずれか一つのアミノ酸をプロリンまたはシステインを除く他のアミノ酸に置換することを特徴とする、ヒト抗体またはヒト化抗体を改良して発現量および/または安定性の向上した抗体を得る方法。
2)VL鎖の8位、12位、15位または18位のいずれかに位置する少なくとも一つのプロリン、または15位のアミノ酸を、プロリンまたはシステインを除く他のアミノ酸に置換することを特徴とする上記1)に記載の方法。
3)置換後の各位のアミノ酸が、それぞれ下記のいずれかのアミノ酸から選ばれる上記1)または2)に記載の方法。
8位:Gly,Thr,ArgまたはSer
12位:Ser,His,Val,Gly,Leu,Arg,Phe,MetまたはGlu
15位:Arg,Ser,GlyまたはPhe
18位:Arg,Ser,Phe,Ala,Trp,LeuまたはGln
4)当該VL鎖が、ヒトVκ1ファミリー、ヒトVκ2ファミリーまたはヒトVκ3ファミリーのいずれかに属する上記1)から3)のいずれかに記載の方法。
5)ヒトVκ1ファミリーに属するVL鎖の置換後の各位のアミノ酸が、それぞれ下記のいずれかのアミノ酸から選ばれる上記1)から4)のいずれかに記載の方法。
8位:Gly,Thr,ArgまたはSer
15位:ArgまたはSer
6)当該ヒトVκ1ファミリーに属するVL鎖の置換前のFR1が、DPK9(GenBank Accession No. X59315)由来の配列を有するVL鎖である上記5)に記載の方法。
7)置換後のヒトVκ1ファミリーに属するVL鎖のFR1が、配列番号2〜7に記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列である上記5)または6)のいずれかに記載の方法。
8)ヒトVκ2ファミリーに属するVL鎖の置換後の各位のアミノ酸が、それぞれ下記のいずれかのアミノ酸から選ばれる上記1)から4)のいずれかに記載の方法。
12位:Ser,His,Val,Gly,Leu,Arg,Phe,MetまたはGlu
15位:Arg
18位:Arg,Ser,Phe,Ala,Trp,LeuまたはGln
9)当該ヒトVκ2ファミリーに属するVL鎖の置換前のFR1が、DPK18(GenBank Accession No. X63403)由来の配列を有するVL鎖である上記8)に記載の方法。
10)置換後のヒトVκ2ファミリーに属するVL鎖のFR1が、配列番号9〜25に記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列である上記8)または9)のいずれかに記載の方法。
11)ヒトVκ3ファミリーに属するVL鎖の置換後の各位のアミノ酸が、下記のいずれかのアミノ酸から選ばれる上記1)から4)のいずれかに記載の方法。
15位:Arg,Ser,GlyまたはPhe
12)当該ヒトVκ3ファミリーに属するVL鎖の置換前のFR1が、DPK22(GenBank Accession No.X59315)由来の配列を有するVL鎖である上記11)に記載の方法。
13)置換後のヒトVκ3ファミリーに属するVL鎖のFR1が、配列番号27〜30に記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列である上記11)または12)のいずれかに記載の方法。
14)当該抗体が、完全抗体、またはFab、Fab'、F(ab')2、scAb、scFv、diabody[短いリンカーペプチドにより連結された同種または異種の可変領域重鎖(VH鎖)およびVL鎖からなる組換え二量体抗体]もしくはscFv−Fc等の抗体フラグメント、或いはそれらと他の蛋白との融合抗体または融合抗体フラグメント、低分子標識体が結合された抗体または抗体フラグメント、高分子修飾体で修飾された抗体または抗体フラグメントである上記1)から13)のいずれかに記載の方法。
15)アミノ酸置換を遺伝子組換え技術により行う、上記1)から14)のいずれかに記載の方法。
16)上記1)から14)のいずれかに記載の方法により得られた、発現量および/または安定性の向上したヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメント。
17)ヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントの可変領域軽鎖(以下、VL鎖)の8位、12位、15位または18位(Kabat numberingに従う)の少なくともいずれか一つのアミノ酸がプロリンまたはシステインを除く他のアミノ酸で置換された、発現量および/または安定性の向上した抗体の製造方法であって、該置換後のVL鎖のアミノ酸配列を含む該ヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントのアミノ酸配列をコードする遺伝子を作製し、該遺伝子を真核系または原核系生物の宿主に形質転換し、該宿主から該ヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントを発現させ、ついで該ヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントを回収することを含む方法。
18)上記17)に記載の方法により製造された、発現量および/または安定性の向上したヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメント。
8位:Gly,Thr,ArgまたはSer
12位:Ser,His,Val,Gly,Leu,Arg,Phe,MetまたはGlu
15位:Arg,Ser,GlyまたはPhe
18位:Arg,Ser,Phe,Ala,Trp,LeuまたはGln
Vκ1(抗SEB抗体SEB3-2-7) :DIVMTQSPSSLSASVGDTVTITC(配列番号1)
Vκ2(抗FasL抗体RNOK203) :DVVMTQTPLSLPVTLGQPASISC(配列番号8)
Vκ3(抗CTLA-4抗体CTLA4-3-1):EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(配列番号26)
(1)大腸菌株
JM83株(Gene, 33, p.103-119 (1985))を用いた。
プラスミドpTrc99A-Fab-mycは、trcプロモーターのコントロール下で各Fabクローンをコードする。大腸菌での発現およびフォールディングをスムーズにするために、CH1およびCκ領域C末端のCys残基はSerに置換されており、両鎖間のジスルフィド結合は欠損した分子型になっている。検出を容易にするために、L鎖のC末端にc-myc tagを付加している。ペリプラズムおよび培養上清へ分泌させるため、pelB配列シグナル(Leiら、 J. Bacteriol., 169, p.4379-4383 (1987))を両鎖のコード領域の前方に挿入している(図1)。
利用したオリゴDNAはSIGMA GENOSYS社において合成されたものを使用した。
(1)抗SEB抗体SEB3-2-7
健常者20名由来末梢血由来リンパ球を出発材料として構築したscFvディスプレイファージライブラリーから組換えSEB蛋白質を用いたパンニング法により分離した、SEBを特異的に認識するヒト抗体である。VHはVH1ファミリーに属するDP-75のセグメント由来の配列を、VLはVκ1ファミリーに属するDPK9(GenBank Accession No. X59315)のセグメント由来の配列を有する。VLドメインのFR1のアミノ酸配列を配列番号1に示す。
文献(Nakashimaら、J. Immunol., 167, p.3266-3275 (2001))に報告された、Fas Ligandを特異的に認識し、中和能を有するヒト化抗体である。VLはVκ2ファミリーに属するDPK18(GenBank Accession No. X63403)のセグメント由来の配列を有する。VLドメインのFR1のアミノ酸配列を配列番号8に示す。
健常者20名由来末梢血由来リンパ球を出発材料として構築したscFvディスプレイファージライブラリーから組換えCTLA-4蛋白質を用いたパンニング法により分離した、CTLA-4を特異的に認識するヒト抗体である。VHはVH1ファミリーに属するDP-25のセグメント由来の配列を、VLはVκ3ファミリーに属するDPK22(GenBank Accession No.X59315)のセグメント由来の配列を有する。VLドメインのFR1のアミノ酸配列を配列番号26に示す。
前述の先行技術や報告例においては、VLドメイン単独やscFvを用いたものがほとんどであるのに対し、本発明においてはFabを用いて改変の検討を行った。IgGであれば動物細胞による発現が必要となるため解析に時間と労力を要するのに対し、フラグメントであれば細菌による産生が可能であるため検討が迅速に行えるという利点を有する。ドメイン単独やscFvに関しては、そのVHおよびVLの配列を組み換えてIgG分子型に変換した際に、おそらく構造の変化によると思われる抗原親和性の低下等の性状の変化がしばしば起こるのに対し、FabではIgG分子型に変換した際に、そのような変化は比較的起こりにくいことが知られている。従って、Fab分子型で確認した改変の効果は、IgG分子型に変換した際にも保持される可能性が高いと考えられる。現行の抗体医薬品はほとんどがIgG分子型であることから、本発明による改良技術は既知の技術よりも、抗体医薬分野への貢献度が大きいことが期待できる。
形質転換は、Gene Pulser(BIO-RAD社)を用い、エレクトロポレーション法により行った。JM83株をコンピテントセルとして、形質転換し、50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布、30℃で一夜培養した。得られたクローンを分離・培養し、プラスミドを常法により調製してDNA塩基配列を分析した。
改変したVL遺伝子のDNA塩基配列をCEQ DTCS Quick Start Kit(BECKMAN COULTER)を用いて決定した。構築した発現株については、DNA塩基配列を解析し、設計通りの配列であることを確認した。
野生型Fab発現プラスミドを鋳型として、変異導入部位のコドンをNNK(NはAまたはCまたはGまたはT、KはGまたはT)としたオリゴDNAを用いて、上記と同様に、PCR法によりVL遺伝子を増幅し、野生型Fab発現プラスミドのVL領域と置換した。JM83に形質転換し、得られたクローンについて96ウェルマイクロタイタープレートで発現誘導を行った。
96ウェルプレート(COSTAR)に入れた50μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地に、上で得られたクローンおよびコントロールとして野生型Fab発現株を植菌し、30℃で5〜6時間培養し、終濃度1mMになるようにIPTGを添加して、更に一夜培養してFabの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、1mM EDTAを含むPBSに懸濁して氷中に30分菌体を放置した。次いで2,000rpmで15分間遠心し、上清を回収してペリプラズム画分とした。
発現量の解析は、Dot Blotにより行った。0.45μmニトロセルロースフィルター(Millipore)に上で得られたペリプラズム画分をスポットし、2%スキムミルクを含むPBS-0.05%Tween20でブロッキングした後、ペルオキシダーゼ(HRP)標識anti-Fab Ab(CAPPEL)で検出した。野生型に比べて発現量が高いと思われたクローンについて、上記と同様にしてDNA塩基配列分析を行い、1アミノ酸置換体であることを確認できたクローンについて、以下の評価を行った。
50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に大腸菌懸濁液を塗布し、30℃で一夜培養後、シングルコロニーを、50μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地に植菌し、30℃でO.D.600nm=0.5〜1.0まで培養し、終濃度1mMになるようにIPTGを添加して、更に一夜培養してFabの発現誘導を行った。培養終了後菌液を遠心し、上清を培養上清画分とした。沈殿した菌体を、1mM EDTAを含むPBSに懸濁して氷中に30分菌体を放置した。次いで8,900×gで15分間遠心し、上清を回収してペリプラズム画分とした。
発現・精製した組換えSEBを200ng/100μL/wellで、ELISAプレート(Nunc)に4℃一夜固定化し、洗浄後、1%BSA-PBSで4℃一夜ブロッキングした。SEB3-2-7の野生型/改変体のペリプラズム画分または培養上清画分を用いて、1%BSA-PBSで希釈し、100μL/wellで37℃1時間反応させた。検出は、ビオチン化anti-Kappa Ab(Southern Biotechnology)とペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン(Vector Lab.)とを組み合わせて行った。650nm/450nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーVmax(Molecular Devices)を用いて測定した。
SEB3-2-7の野生型/改変体のペリプラズム画分について段階希釈し、ELISAを行って機能を持ったFab蛋白質の発現量を比較評価した。その結果、SEB3-2-7のP8G改変体について、発現量の向上が認められた(図2)。
SEB3-2-7の野生型/改変体の培養上清画分を1%BSA-PBSで希釈し、50μL/tubeにして、42℃の水浴で2時間処理した。その後、室温に戻し、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、SEB3-2-7のP8T、P8G、P8RおよびP8S改変体について、熱安定性の向上が認められた(図3)。
SEB3-2-7の野生型/改変体の培養上清画分を1%BSA-PBSで希釈し、50μL/tubeにした。1N HClとpHメーター(HORIBA)を用いてpH4.5に調整し、25℃で2時間処理した。その後、1M Tris-HCl(pH9.5)でpH7とし、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、SEB3-2-7のP8T、P8G、P8RおよびP8S改変体について、酸に対する耐性の向上が認められた(図4)。
FasLについては、His-tagを付加された市販の組換えFas Ligand(R&D systems)を50ng/100μL/wellで、NIキレートプレート(Nunc)に室温2時間固定化した。RNOK203の野生型/改変体の培養上清画分を用いて、ブロックエース(大日本製薬)で希釈し、100μL/wellで37℃1時間反応させた。検出は、ビオチン化anti-Kappa Ab(Southern Biotechnology)とペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン(Vector Lab.)とを組み合わせて行った。650nm/450nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーVmax(Molecular Devices)を用いて測定した。
RNOK203の野生型/改変体の培養上清画分について段階希釈し、ELISAを行って機能を持ったFab蛋白質の発現量を比較評価した。その結果、RNOK203のP12S改変体について、発現量の向上が認められた(図5)。
RNOK203の野生型/改変体の培養上清画分をブロックエースで希釈し、50μL/tubeにして、40℃の水浴で2時間処理した。その後、室温に戻し、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性として、改変体間で比較した。その結果、RNOK203のP12S、P12H、P12V、P12G、P12L、P12R、P12F、P12MおよびP12E改変体について、熱安定性の向上が認められた。代表例についてグラフに示し(図6)、残りの改変体については各々の残存活性の、野生型の残存活性に対する比率を表1にまとめた。
RNOK203の野生型/改変体の培養上清画分をブロックエースで希釈し、50μL/tubeにした。1N HClとpHメーター(HORIBA)を用いてpH4.0に調整し、25℃で2時間処理した。その後、1M Tris-HCl(pH9.5)でpH7とし、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、RNOK203のP12V改変体について、酸に対する耐性の向上が認められた(図7)。
RNOK203の野生型/改変体の培養上清画分について、凍結融解を6回繰り返したサンプルと1回のみのサンプルを準備してELISAを行い、凍結融解1回のサンプルの吸光度に対する、凍結融解6回のサンプルの吸光度の割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、RNOK203のP12S、P12V、P12G、P12L、P12RおよびP12F改変体について、凍結融解に対する耐性の向上が認められた(図8)。
CTLA-4については、市販の組換えCTLA-4(R&D systems)を100ng/100μL/wellで、ELISAプレート(Nunc)に室温1時間固定化し、洗浄後、ブロックエースで室温1時間ブロッキングした。CTLA4-3-1の野生型/改変体のペリプラズム画分を用いて、ブロックエースで希釈し、100μL/wellで37℃1時間反応させた。検出は、ビオチン化anti-Kappa Ab(Southern Biotechnology)とペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン(Vector Lab.)とを組み合わせて行った。650nm/450nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーVmax(Molecular Devices)を用いて測定した。
CTLA4-3-1の野生型/改変体のペリプラズム画分について段階希釈し、ELISAを行って機能を持ったFab蛋白質の発現量を比較評価した。その結果、CTLA4-3-1のP15R、P15SおよびP15G改変体について、発現量の向上が認められた(図9)。特にP15R改変体に関しては、約100倍もの上昇という劇的な効果が認められたが、わずか1アミノ酸の置換により、機能を有するFab蛋白の発現量がこれ程上昇した例は、これまでに報告されていない。
実施例20において認められたP15R改変による発現量の向上を更に確認するために、Fab発現プラスミドの改変を行った。Fd鎖(H鎖のうち、VHからCH1までの領域を指す)のC末端にE tagをコードする合成オリゴDNAを挿入したCTLA4-3-1Fabの野生型/P15R改変体の発現プラスミドを構築した(図10)。以下、E tagを付加したFd鎖を含むFabをFab−Eと呼ぶ。JM83株をコンピテントセルとして、形質転換を行い、DNA塩基配列解析により設計通りの配列であることを確認した。これにより、Fabを構成するFd鎖およびL鎖について、Fd鎖はE tagを利用して、L鎖はc-myc tagを利用して検出することが可能となった。
実施例21で得た培養上清画分およびペリプラズム画分について、ウェスタンブロットにより、Fd鎖およびL鎖の検出を行った。Fd鎖をHRP標識anti-E tag Ab(Amersham Biosciences)で、L鎖をHRP標識anti-c-myc tag Ab(Roche)で検出したところ、Fd鎖とL鎖のいずれも野生型では検出できないのに対して、P15R改変体ではほぼ設計通りの分子量(Fd鎖・L鎖それぞれ約27kDaと約26kDa)の位置にバンドが検出された(図11)。これらの結果から、P15R改変により、Fd鎖とL鎖のいずれも発現量が向上していることが確かめられた。
Fd鎖とL鎖が会合(アセンブリー)し、Fabとしての分子形態を正しく形成しているかを調べるために、以下のサンドイッチELISA系での検討を行った。anti-c-myc tag Ab 9E10を200ng/100μL/wellで、ELISAプレート(Nunc)に室温1時間固定化し、洗浄後、1%BSA-PBSで室温1時間ブロッキングした。各回収画分について、1%BSA-PBSで希釈し、100μL/wellで37℃1時間反応させた。検出はHRP標識anti-E tag Abで行い、650nm/450nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーVmax(Molecular Devices)を用いて測定した。
CTLA4-3-1の野生型/改変体のペリプラズム画分をブロックエースで希釈し、50μL/tubeにして、28℃の水浴で2時間処理した。その後、室温に戻し、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、CTLA4-3-1のP15R、P15S、P15GおよびP15F改変体について、熱安定性の向上が認められた(図13)。
CTLA4-3-1の野生型/改変体のペリプラズム画分をブロックエースで希釈し、50μL/tubeにした。1N HClとpHメーター(HORIBA)を用いてpH4.0またはpH3.5に調整し、氷上で2時間処理した。その後、1M Tris-HCl(pH9.5)でpH7とし、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、CTLA4-3-1のP15R、P15S、P15GおよびP15F改変体について、酸に対する耐性の向上が認められた(図14)。
実施例20から実施例25に示した、L鎖15位をArgまたはSerに改変することによる効果が、RNOK203(L鎖15位はLeu)においても認められるか否かを検討した。
RNOK203の野生型/改変体の培養上清画分について段階希釈し、ELISAを行って機能を持ったFab蛋白質の発現量を比較評価した。その結果、RNOK203のL15R改変体について、発現量の向上が認められた(図15)。
RNOK203の野生型/改変体の培養上清画分をブロックエースで希釈し、50μL/tubeにした。1N HClとpHメーター(HORIBA)を用いてpH5.0に調整し、25℃で2時間処理した。その後、1M Tris-HCl(pH9.5)でpH7とし、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、RNOK203のL15R改変体について、酸に対する耐性の向上が認められた(図16)。
実施例20から実施例28に示した、L鎖15位をArgまたはSerに改変することによる効果が、SEB3-2-7(L鎖15位はVal)においても認められるか否かを検討した。
SEB3-2-7の野生型/改変体の培養上清画分を1%BSA-PBSで希釈し、50μL/tubeにして、42℃の水浴で2時間処理した。その後、室温に戻し、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、SEB3-2-7のV15RおよびV15S改変体について、熱安定性の向上が認められた(図17)。
SEB3-2-7の野生型/改変体の培養上清画分を1%BSA-PBSで希釈し、50μL/tubeにした。1N HClとpHメーター(HORIBA)を用いてpH4.5またはpH4.0に調整し、25℃で2時間処理した。その後、1M Tris-HCl(pH9.5)でpH7とし、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、SEB3-2-7のV15RおよびV15S改変体について、酸に対する耐性の向上が認められた(図18)。
RNOK203の野生型/改変体の培養上清画分をブロックエースで希釈し、50μL/tubeにして、45℃の水浴で2時間処理した。その後、室温に戻し、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、RNOK203のP18R、P18SおよびP18F改変体について、熱安定性の向上が認められた(図19)。
RNOK203の野生型/改変体の培養上清画分をブロックエースで希釈し、50μL/tubeにした。1N HClとpHメーター(HORIBA)を用いてpH4.0に調整し、25℃で2時間処理した。その後、1M Tris-HCl(pH9.5)でpH7とし、ELISAを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性として、改変体間で比較した。その結果、RNOK203のP18F、P18A、P18W、P18L、P18R、P18QおよびP18S改変体について、酸に対する耐性の向上が認められた。代表例についてグラフに示し(図20)、残りの改変体については各々の残存活性の、野生型の残存活性に対する比率を表2にまとめた。
RNOK203の野生型/改変体の培養上清画分について、凍結融解を6回繰り返したサンプルと1回のみのサンプルを準備してELISAを行い、凍結融解1回のサンプルの吸光度に対する、凍結融解6回のサンプルの吸光度の割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、RNOK203のP18R、P18Q、P18S、P18FおよびP18L改変体について、凍結融解に対する耐性の向上が認められた(図21)。
Claims (7)
- ヒト抗体またはヒト化抗体の可変領域軽鎖(以下、VL鎖)の12位(Kabat numberingに従う)に位置するプロリンを、下記のいずれかのアミノ酸に置換することを特徴とする、ヒト抗体またはヒト化抗体を改良して発現量および/または安定性の向上した抗体を得る方法。
12位:Ser,His,Val,Gly,Leu,Arg,Phe,MetまたはGlu - ヒトVκ2ファミリーに属するVL鎖の置換後のアミノ酸が、下記のいずれかのアミノ酸から選ばれる請求項1に記載の方法。
12位:Ser,His,Val,Gly,Leu,Arg,Phe,MetまたはGlu - 当該ヒトVκ2ファミリーに属するVL鎖の置換前のFR1が、配列番号8に記載の配列を有するVL鎖である請求項2に記載の方法。
- 置換後のヒトVκ2ファミリーに属するVL鎖のFR1が、配列番号9〜17に記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列である請求項2または3に記載の方法。
- 当該抗体が、完全抗体、またはFab、Fab'、F(ab')2、scAb、scFv、diabodyもしくはscFv−Fcから選ばれる抗体フラグメント、或いはそれらと他の蛋白との融合抗体または融合抗体フラグメント、放射性元素が結合された抗体または抗体フラグメント、ポリエチレングリコールで修飾された抗体または抗体フラグメントである請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- アミノ酸置換を遺伝子組換え技術により行う、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- ヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントの可変領域軽鎖(以下、VL鎖)の12位(Kabat numberingに従う)に位置するプロリンを、下記のいずれかのアミノ酸に置換された、発現量および/または安定性の向上した抗体の製造方法であって、該置換後のVL鎖のアミノ酸配列を含む該ヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントもしくははヒト化抗体フラグメントのアミノ酸配列をコードする遺伝子を作製し、該遺伝子を真核系または原核系生物の宿主に形質転換し、該宿主から該ヒト抗体もしくははヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントもしくははヒト化抗体フラグメントを発現させ、ついで該ヒト抗体もしくははヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントもしくははヒト化抗体フラグメントを回収することを含む方法。
12位:Ser,His,Val,Gly,Leu,Arg,Phe,MetまたはGlu
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