JP5901522B2 - 製造性の向上した変異免疫グロブリン - Google Patents
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Description
親免疫グロブリンを提供するステップ、
親免疫グロブリンのVLドメインフレームワーク領域および/またはVL CDR3の易凝集性セグメント中に置換を導入するステップ、および/または
VH フレームワーク領域および/またはVH CDR3の易凝集性セグメント中に置換を挿入するステップ、および/または
親免疫グロブリンの重鎖(CH)のCH1定常領域ドメインの易凝集性セグメント中に置換を導入するステップ
を含み、それにより変異免疫グロブリンを製造する方法を提供する。
VHドメイン中のVH FR1易凝集性セグメント、VHポジション95易凝集性セグメント、およびVH CDR3易凝集性セグメントに置換を導入するステップ
を含むことができ、それにより、変異免疫グロブリンを製造し、前記変異免疫グロブリンは、親免疫グロブリンに対して生産性の増加および凝集の減少の両方を示す。
親免疫グロブリンを提供するステップ、
VHドメインのポジション1のA、D、E、QまたはV、ポジション17のR、ポジション94のR、ポジション95のD、ポジション96のA、ポジション100のF、ポジション100dのF、G、L、MまたはP、好ましくはFまたはM、ポジション102のA、F、H、I、L、VまたはY、好ましくはVまたはYの1つまたは複数の置換を導入するステップ、および/または
VLドメインのポジション37のQ、ポジション45のE、K、R、QまたはV、好ましくはKまたはR、ポジション46のLまたはY、好ましくはLの置換を導入するステップ
を含むことができ、それにより、変異免疫グロブリンを製造し、前記変異免疫グロブリンは、親免疫グロブリンに対して生産性の増加および凝集の減少の両方を示す。
免疫グロブリンのVLドメイン中の、ポジション18のR、SもしくはV、好ましくはRもしくはV以外、ポジション20のK、R、SもしくはV、好ましくはRもしくはV、ポジション45のE、K、R、QもしくはV、好ましくはKもしくはR、ポジション46のLもしくはY、好ましくはL、ポジション74のV、ポジション91のA、F、L、R、S、もしくはW、好ましくはW、ポジション93のD、F、L、Q、S、T、WもしくはY、好ましくはQ、および/またはポジション96のE、L、VもしくはW、好ましくはVの残基の存在、および/または
免疫グロブリンのVHドメイン中の、ポジション1のA、D、E、QもしくはV以外、ポジション5もしくはポジション12のV、ポジション17のR、ポジション19のTもしくはV、好ましくはT、ポジション20のA、K、SもしくはT、好ましくはA、ポジション94のR、ポジション96のA、ポジション100cのD、E、F、G、P、S、T、W、もしくはY、好ましくはW、ポジション100dのF、G、L、MもしくはP、好ましくはFもしくはM、ポジション102のA、F、H、I、L、VもしくはY、好ましくはVもしくはY、ポジション103のI、LもしくはV、および/またはCH1ドメイン中のポジション153のVの残基の存在
が、その免疫グロブリンが最適ではない製造性を有するという指標になる。
親免疫グロブリンの配列に対してフレームワーク易凝集性セグメントおよび/またはCDR3易凝集性セグメントに置換を含むVLドメイン、
親免疫グロブリンの配列に対してフレームワーク凝集しやすい領域および/またはCDR3易凝集性セグメントに置換を含むVHドメイン、および/または、
親免疫グロブリンの配列に対してCH1凝集しやすい領域に置換を含むCH1ドメイン
を含む親免疫グロブリンの変異体を提供する。
前記標的抗原に結合するドナー免疫グロブリンを提供するステップ、
上述した変異免疫グロブリンを提供するステップ、および
前記変異免疫グロブリンの1、2、3、4、5または6個のCDR配列を、前記ドナー免疫グロブリンの対応するCDR配列と置き換えるステップ
を含むことができ、それにより、前記標的抗原に結合するハイブリッド免疫グロブリンを製造する。
上述した変異免疫グロブリンの集団を提供するステップ、
前記変異免疫グロブリンの集団の1、2、3、4、5または6個のCDR配列を、CDR配列のレパートリーと置き換えるステップ
を含むことができ、それにより、変異免疫グロブリンライブラリーを製造する。
(a)置き換えられるCDR3を含むか、またはCDR3をコードしている領域を欠くVHドメインをコードしている核酸の出発集団を提供するステップであって、前記VHドメインが、上述した1つまたは複数の易凝集性セグメント中に1つまたは複数の置換を含むステップ、
(b)前記VHドメイン集団をVH CDR3アミノ酸配列のレパートリーをコードしているドナー核酸の集団と合わせて、その結果、前記ドナー核酸が、VHドメイン集団中のCDR3領域中に挿入されるようなステップであって、前記VH CDR3配列を含むVHドメインのレパートリーをコードしている核酸の生成集団を提供するためのステップ、
(c)前記生成集団の核酸を発現させるステップ、
(d)標的抗原に特異的な免疫グロブリンを選択するステップ、および
(e)前記免疫グロブリンまたはそれをコードしている核酸を回収するステップ
を含むことができる。
上述したようにフレームワーク易凝集性セグメントおよび/またはCDR3凝集しやすい領域に置換を含むVLドメイン、
上述したようにフレームワーク凝集しやすい領域および/またはCDR3易凝集性セグメントに置換を含むVHドメイン、および/または
上述したようにCH1凝集しやすい領域に置換を含むCH1ドメイン
を含むことができ、ライブラリーのメンバーは、1つまたは複数のCDR配列が異なる。
実験
遺伝子合成
配列は、市販用の供給業者によって最適化および合成され、pEE6.4およびpEE12.4中にサブクローニングされた。Top10細胞中へ形質転換し、LB培養液中でO/N培養し、QIAGEN Endofreeプラスミド精製キットを使用して精製することによって、DNAストックを調製した。DNAをTE緩衝液中に再懸濁し、Nanodrop分光光度計を使用して濃度を決定した。
常法に従う細胞培養
CHOK1SV細胞を、3〜4日間ごとに15mMのL−グルタミンを添加したCD−CHO培地中で継代培養し、振とう式CO2インキュベーター(140rpm)中で、36.5℃、10%CO2、85%湿度でインキュベートした。
一過性トランスフェクション
CHOK1SV細胞を、リポフェクタミン(Lipofectamine)2000を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、上清を回収し、遠心分離にかけ、分析の前に4℃で保存した。
安定なトランスフェクション
大規模発現を、MSX選択下で、安定にトランスフェクトされたCHOK1SV細胞を使用して行った。回収したら、上清は、精製の前に4℃で保存した。
精製
上清を、HiTrapカラム(GE)を使用してプロテインA精製し、濃縮および緩衝液交換の前に4℃で保存した。
抗体濃縮および緩衝液交換
試料を、2000gで15〜20分間の遠心分離によって濃縮した。材料を、製剤化緩衝液(50mM リン酸、100mM NaCl、pH7.4)を使用して4〜5回緩衝液交換した。緩衝液を交換したら、試料を製剤化緩衝液中で適切な使用濃度まで希釈した。
GP−HPLC
2連の試料を、Agilent1200シリーズHPLCシステムにおいてGP−HPLCによって分析した。1mg/ml試料の80μlアリコート(4℃に保った)を注入し、1ml/分で15分間流した。結果は、chemstationソフトウェアを使用して解析した。
IgG力価
抗体発現収率は、サンドイッチELISAを使用して決定した。力価は、軽鎖特異的対照に対して標準化した。
チオフラビンT結合
チオフラビンTを使用して、凝集をモニタリングすることができる。1mg/mlの精製抗体を、60°で1時間インキュベートし、次いで、30mMの最終濃度のチオフラビンTと混合し、蛍光発光をEx=305 Em=508nmで測定した(Hawe,A.、Sutter,MおよびJiskoot,W. Pharmaceutical Research 2008 25(7)1487〜99)。
ANS結合
8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸(ANS)を使用して、凝集をモニタリングすることができる。1mg/mlの精製抗体を、60°で1時間インキュベートし、次いで、30mMの最終濃度のANSと混合し、蛍光発光をEx=360 Em/508nmで測定した(Hawe,A.、Sutter,MおよびJiskoot,W. Pharmaceutical Research 2008 25(7)1487〜99)。
結果
免疫グロブリン配列を、インシリコ法およびインビトロ法によって分析して、易凝集性セグメントを特定した。特定された易凝集性セグメントを、表2に示す。
追加の番号付き発明の記述(Additional Numbered Statements of Invention)
1.フレームワーク(FR)易凝集性セグメントおよび/または相補性決定領域3(CDR3)易凝集性セグメントに置換を含む軽鎖可変(VL)ドメイン、
フレームワーク領域易凝集性セグメントおよび/またはCDR3易凝集性セグメントに置換を含む重鎖可変(VH)ドメイン、および/または、
CH1易凝集性セグメントに置換を含む重鎖定常領域1(CH1)ドメイン
を含む、変異免疫グロブリン。
親免疫グロブリンを同定するステップ、
前記親免疫グロブリンのVLドメイン中のフレームワーク易凝集性セグメントおよび/またはCDR3易凝集性セグメント中に置換を導入するステップ、および/または
前記親免疫グロブリンのVHドメイン中のフレームワーク領域易凝集性セグメントおよび/またはCDR3易凝集性セグメント中に置換を導入するステップ、および/または
前記親免疫グロブリンのCH1ドメイン中の定常領域易凝集性セグメント中に置換を導入するステップ
を含み、それにより、前記親免疫グロブリンに対して製造性の向上を示す、変異免疫グロブリンを製造する方法。
免疫グロブリンのVLドメイン中のポジション18、20、45、46、74、91、93および96、VHドメイン中のポジション1、5、12、17、19、20、94、96、100c、100d、102,および103、ならびに免疫グロブリンのCH1ドメイン中のポジション153からなる群から選択される1つまたは複数のポジションのアミノ酸残基を同定するステップ
を含み、
免疫グロブリンのVLドメイン中の、ポジション18のR、SもしくはV、好ましくはRもしくはV以外、ポジション20のK、R、SもしくはV、好ましくはRもしくはV、ポジション45のE、K、R、QもしくはV、好ましくはKもしくはR、ポジション46のLもしくはY、好ましくはL、ポジション74のV、ポジション91のA、F、L、R、S、もしくはW、好ましくはW、ポジション93のD、F、L、Q、S、T、WもしくはY、好ましくはQ、および/またはポジション96のE、L、VもしくはW、好ましくはVの残基の存在、および/または
免疫グロブリンのVHドメイン中の、ポジション1のA、D、E、QまたはV以外、ポジション5またはポジション12のV、ポジション17のR、ポジション19のTまたはV、好ましくはT、ポジション20のA、K、SまたはT、好ましくはA、ポジション94のR、ポジション96のA、ポジション100cのD、E、F、G、P、S、T、W、またはY、好ましくはW、ポジション100dのF、G、L、MまたはP、好ましくはFまたはM、ポジション102のA、F、H、I、L、VまたはY、好ましくはVまたはY、ポジション103のI、LまたはVの残基の存在、および/または
免疫グロブリンのCH1ドメイン中のポジション153のV以外の残基の存在
が、その免疫グロブリンの製造性が最適ではないという指標になる方法。
ポジション100dのSおよび/またはポジション102のPの存在が、その免疫グロブリンが最適ではない製造性を有するという指標になる方法。
前記標的抗原に結合するドナー免疫グロブリンを提供するステップ、
記述1から89のいずれか1つに記載の変異免疫グロブリンを提供するステップ、
前記変異免疫グロブリンの1つまたは複数のCDR配列を、前記ドナー免疫グロブリンの対応するCDR配列と置き換えるステップ
を含み、それにより、前記標的抗原に結合するハイブリッド免疫グロブリンを製造する方法。
記述1から95のいずれか1つに記載の変異免疫グロブリンを提供するステップ、
前記変異免疫グロブリンの1つまたは複数のCDR配列を、その中の1つまたは複数のポジションにランダムな残基を含むCDR配列と置き換えるステップ
を含み、それにより、多様な変異免疫グロブリンのライブラリーを製造する方法。
フレームワーク易凝集性セグメントおよび/またはCDR3易凝集性セグメントに置換を含むVLドメイン、
フレームワーク領域易凝集性セグメントおよび/またはCDR3易凝集性セグメントに置換を含むVHドメイン、および/または
CH1易凝集性セグメントに置換を含むCH1ドメイン
を含み、ライブラリーのメンバーが、1つまたは複数のCDR配列が異なる、変異免疫グロブリンライブラリー。
記述111に記載の変異免疫グロブリンライブラリーと前記抗原とを接触させるステップ、および
前記抗原に結合することができるライブラリーの1つまたは複数の免疫グロブリンを選択するステップ
を含む方法。
Claims (21)
- 製造性が向上した変異免疫グロブリンの製造方法であって、
前記変異免疫グロブリンが完全なヒト化若しくはヒト抗体、またはそのFab抗体断片であり、
前記方法が、
(a)VLドメインおよびVHドメインを有する親免疫グロブリンを同定するステップ、
(b)下記(b1)〜(b4)のいずれか1つのステップ;
(b1)前記親免疫グロブリンのVLドメインに、L37Q及びQ45R置換、又はL46R置換を導入するステップ、
(b2)前記親免疫グロブリンのVHドメインに、E1Q、G17R、R95D、G96A、S102V、P102Y、P102V、及びS100dMからなる群より選択される少なくとも1種の置換を導入するステップ、
(b3)前記親免疫グロブリンのVHドメインに、Q1A及びP102Y置換; Q1E及びP102Y置換; R95D及びS102V置換; H94R、R95D、V100F及びS102V置換; S100dF及びP102V置換; S100dF及びP102Y置換; S100dM及びP102Y置換; 又はS100dM及びP102V置換を導入するステップ、
(b4)前記親免疫グロブリンのVLドメインに、L37Q及びQ45R置換を導入し、且つ前記親免疫グロブリンのVHドメインに、R95D及びS102V置換を導入するステップ
(但し、VHドメイン及びVLドメイン内のポジション番号はカバット番号付けスキームに従って番号付けされている。)、並びに
(c)前記親免疫グロブリンの標的抗原に対する前記変異免疫グロブリンの結合能を試験するステップ
を含み、
それにより、発現時に前記親免疫グロブリンに対して凝集傾向の減少および生産性の増加の両方をを示す、VLドメインおよびVHドメインを有する変異免疫グロブリンを製造する、方法。 - 前記変異免疫グロブリンの配列が、親免疫グロブリン配列に対して10個までの請求項1に記載のアミノ酸置換を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、Q1A及びP102Y置換、又はQ1E及びP102Y置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVLドメインに、L46R置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、E1Q置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、G17R置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、R95D置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、G96A置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、S102V置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、P102Y置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、S100dF置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、S100dM置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、R95D及びS102V置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVLドメインに、L37Q及びQ45R置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVLドメインに、L37Q及びQ45R置換が導入されており、且つ前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、R95D及びS102V置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVLドメインに、L37Q及びQ45R置換が導入されており、且つ前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、S102V置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVLドメインに、L37Q及びQ45R置換が導入されており、且つ前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、R95D置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、H94R、R95D、V100F及びS102V置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、S100dF及びP102V置換、又はS100dF及びP102Y置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、S100dM及びP102Y置換、又はS100dM及びP102V置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異免疫グロブリンのVLドメインに、L46R置換が導入されており、且つ前記変異免疫グロブリンのVHドメインに、H94R及びR95D置換が導入されている、請求項1又は2に記載の方法。
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