KR20120056850A - 제조성이 개선된 변이체 면역글로불린 - Google Patents

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KR20120056850A
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안드레아스 아르넬
조제 지메네즈
레베카 마이클
이베트 스톨우드
제수스 주르도
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론자 바이올로직스 피엘씨
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Abstract

본 발명은 응집되기 쉬운 VH 및 VL FR 및 CDR3 도메인 및/또는 CH1 도메인 영역내의 특정 주요 위치에 존재하는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열의 변형에 관한 것이다. 기술된 바와 같이 변형된 면역글로불린은 예를 들어, 감소된 응집 성향, 및/또는 증가된 생산 수준과 같은 개선된 제조성을 나타낼 수 있다.

Description

제조성이 개선된 변이체 면역글로불린{VARIANT IMMUNOGLOBULINS WITH IMPROVED MANUFACTURABILITY}
본 발명은 항체 분자의 발현, 및 특히 제조성이 개선된 항체 분자의 생산에 관한 것이다.
"응집"이라는 용어는 세포 배양 및 발효로부터 단리, 정제 및 제제화 과정에 이르기까지의 다중 환경에서 발생할 수 있는 단백질 자가 회합과 관련된 모든 매우 다양한 현상을 기술한다. 예를 들어, '응집'은 때때로 봉입체 형성; 세포 분획법 후, '불용성' 분획 중의 단백질 축적; 샘플 중 혼탁도 출현, 단백질 침전, 입자의 형성; 또는 다른 것들 가운에서 소형 가용성 올리고머의 형성을 기술할 때 사용된다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 쇄의 "비정상적인 자가 회합"으로서 이해되는 단백질 응집은 그가 관여하는 분자의 성질 및 폴리펩티드가 생산되고, 단리되고, 저장되고, 투여되는 환경, 둘 모두에 크게 의존하는 다수의 기원 및 현상을 가질 수 있다.
폴리펩티드의 3차원 구조가 그의 천연 생리학적 기능을 결정한다. 단백질은 전형적으로 리보좀에서 합성된 후에 그의 천연 구조를 획득한다. 단백질 폴딩 과정은 근본적으로 단백질의 아미노산 서열에서 코딩된다. 그러나, 폴딩은 또한 생체내에서는 비정상적인 입체형태 집단은 회피하면서, 확실하게 폴리펩티드가 그의 의도된 생물학상 활성이 구조를 가질 수 있도록 하는 다수의 분자 헬퍼 및 질 관리 기전에 의해 도움을 받을 수 있다. 그러한 외부 헬퍼 및 질 관리 요소로는 샤프론, 이황화 이소머라제, 번역 후 변형(즉, 단백질분해 프로세싱, 아실화, 당화 등), 및 유비퀴틴-프로테오좀 시스템을 포함한다.
추가로, 단백질 응집은 용액 중 단백질의 내인성 안정성에 의해 유도된다. 단백질의 용액 중에서의 안정성은 단지 미미하며, 이렇게 상대적으로 낮은 안정성은 그의 작용을 제어하는 우수한 조절 기전을 제공하면서 특이적인 생물학적 특성을 부여하는 데 있어 중요하다. 그러나, 폴리펩티드를 그의 천연 환경 밖으로 가져오게 되면, 예를 들어, 그를 약물로서 개발하게 되면, 그의 안정성 및 응집 양상에 영향을 미칠 수 있는 그의 생산, 단리 및 제제화에 있어 많은 제약이 따르게 된다.
특히, 구체적인 생산 또는 공정 요건에 기인하여 주어진 단백질의 천연 환경을 변경시키면 그의 용액 중 수율 및 안정성은 커다란 영향을 받을 수 있다. 이러한 문제는 수율을 증가시키기 위한 공정 요건들, 예를 들어, 인공 합성, 이종 발현(즉, 포유동물 단백질의 원핵세포에서의 발현), 분비 대 비분비 경로의 사용, 단백질 합성 기구의 포함; 또는 비천연 단백질, 예를 들어, 폴리펩티드 단편 또는 융합체에 의해 제기되는 추가의 난관들에 의해 악화된다. 예를 들어, 이종 시스템에서의 포유동물 단백질의 발현은 많은 위험을 제기한다. 상기 시스템에는 보통 '천연' 폴딩 및 프로세싱을 보장하는 적절한 분자 환경이 존재하지 않는다는 사실에 기인한다.
본 발명은 특정 중요 위치에 있는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열을 변형시키면 제조성이 개선되고, 특히 응집 성향이 감소하게 되고/거나, 생산 수준이 증가하게 된다는 발견에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은
모체 면역글로불린을 제공하는 단계,
모체 면역글로불린의 VL 도메인 프레임워크 영역 및/또는 VL CDR3의 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 치환을 도입하는 단계; 및/또는
VH 프레임워크 영역 및/또는 VH CDR3의 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 치환을 도입하는 단계; 및/또는
모체 면역글로불린의 중쇄(CH)의 CH1 불변 영역 도메인의 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 치환을 도입하는 단계;
이를 통해 변이체 면역글로불린을 제조하는 단계를 포함하는, 변이체 면역글로불린을 제조하는 방법을 제공한다.
변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 개선된 제조성을 가질 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 감소된 응집 성향, 및/또는 발현시 증가된 생산성을 나타낼 수 있다.
예를 들어, 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 또는 500% 이상 증가된 생산성 및/또는 모체 면역글로불린에 비하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 99% 이상 감소된 응집(즉, 천연 상태의 총체 중 응집된 분자 비율의 감소)을 나타낼 수 있다. 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 최대 100%까지 감소된 응집을 나타낼 수 있다(즉, 완전한 응집 폐기).
제조성 개선은 전체적으로 또는 부분적으로는 모체 면역글로불린에 비하여 감소된 응집 성향으로부터 초래될 수 있다.
응집 성향은 재조합 시스템에서의 발현 후 불용성 응집체를 형성하는 면역글로불린의 경향에 관한 것이다. 응집 성향 감소는 응집된 형태로 존재하는 면역글로불린의 천연 상태의 총체 중 상기 분자 비율을 감소시킨다(문헌 [Carpenter et al., 2009 J Pharm Sci. Apr; 98(4):1201-5]). 다시 말해, 응집된 형태 또는 불용성 형태로 존재하는 변이체 면역글로불린의 천연 상태의 총체 중 상기 분자 비율은 모체 면역글로불린의 천연 상태의 총체 중의 비율보다 낮다.
변이체 면역글로불린은 천연 조건 또는 승온(예를 들어, 60℃)(즉, 면역글로불린의 항원 결합 부위가 언폴딩하지 않는 조건)하에서는 모체 면역글로불린에 비해 더 적은 자가 회합 또는 응집을 나타낼 수 있다. 바람직하게, 변이체 면역글로불린은 천연 조건(즉, 면역글로불린의 언폴딩을 일으키지 않는 조건)하에서는 모체 면역글로불린보다 더 적은 자가 회합을 나타낸다.
본원에 기술된 응집 성향은, 열 변성 이후 정확하게 리폴딩할 수 있는 단백질의 능력과 관련된 열적 리폴딩 효율과는 상이한 것이며, 이는 전형적으로는 원편광 이색성 분광 측정법(CD: circular dichroism)을 사용하여 측정된다(문헌 [Tanha et al., Protein Eng Des Sel. 2006 Nov;19(11):503-9]). 본원에 기술된 면역글로불린의 응집 성향 감소는 면역글로불린의 열적 리폴딩 효율에는 영향을 거의 미치지 않거나, 전혀 미치지 않을 수 있다. 따라서, 열적 리폴딩 효율은 응집 성향과는 상관이 없고, 면역글로불린의 제조성에 대해서는 유의적인 영향을 미치지 않는다.
응집은 종래 방법에 의해 측정될 수 있다. 적합한 기법으로는 GP-HPLC, HPLC 및 AUC(문헌 [Gabrielson JP et al., J Pharm Sci 2007 96(2):268-79]), 여과 후 단백질 손실; 혼탁도; 형광성 염료 결합(예를 들어, 나일 레드(Nile Red), 티오플라빈 T 또는 8-아닐리노-1-나프탈렌술폰산; 예를 들어, 문헌 ([Hawe, A. et al., Pharmaceutical Research 2008 25 (7) 1487-99] 또는 [Demeule, B et al., 2007 Int. J. Pharm. 329: 37-45]) 참조), 장 흐름 분획법(FFF: field-flow fractionation; 문헌 [Demeule, B et al., mAbs 2009 1(2): 142-150]), 및 분석 초원심분리(AU/AUC: analytical ultracentrifugation; 문헌 [Liu J et al., AAPS J 2006 8:580-9])를 포함한다.
다른 적합한 방법은 문헌 ([Arvinte T. In "Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals" AAPS Press, 2005: 661-6] 및 [Kiese S et al., J Pharm Sci 2008 97(10): 4347-66])에 기술되어 있다.
제조성 개선은 전체적으로 또는 부분적으로는 모체 면역글로불린에 비하여 증가된 생산성으로부터 초래될 수 있다.
변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린보다 증가된 생산성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 재조합 시스템, 예를 들어, 세균 또는 포유동물 세포에서 발현되었을 때, 모체 면역글로불린과 비교하여 증가된 수율 또는 역가를 나타낼 수 있다. 생산성은 표준 기법, 예를 들어, 브래드포드(Bradford) 분석법, 분광광도법 및 ELISA를 사용하여 측정될 수 있다.
변이체 면역글로불린은 또한 모체 면역글로불린에 비하여 개선된 정제 수율; 감소된 제제화 문제; 감소된 면역원성 및 증가된 생체이용성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제조성 개선은 모체 면역글로불린에 비하여 감소된 응집 성향 및 증가된 생산성으로부터 초래될 수 있다.
바람직하게, 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린과 동일하거나, 실질적으로 동일한 활성(즉, 항원 결합 활성)을 나타낸다.
면역글로불린은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 항원 결합 부위는 항원의 일부 또는 그 전체에 특이적으로 결합하고, 공간적으로 그에 상보적인 면역글로불린의 일부이다. 항원이 클 경우, 면역글로불린은 에피토프라고 명명되는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있다. 바람직하게, 항원 결합 도메인은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL: light chain variable region) 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH: heavy chain variable region)을 포함하는데, 이들은 동일한 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재할 수 있다.
면역글로불린의 예로는 항체 이소형, 예를 들어, IgG, IgA, IgD, IgM 및 IgE 및 그의 이소형 서브부류, 예를 들어, IgG1 및 IgG4; 항체 단편; 및 공학처리된 항체 유도체, 예를 들어, 소형 면역단백질(SIP: small immunoprotein), 소형 항체, 카멜리드 VHH 도메인 및 디아바디를 비롯한 전체 항체를 포함한다.
항체 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편(문헌 [Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)]); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 Fab 단편이 연결된 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) 2개의 도메인이 결합하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 하는 펩티드 링커에 의해 VH 도메인 및 VL 도메인이 연결된 단일 쇄 Fv 분자(scFv: single chain Fv)(문헌 ([Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988]; [Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988])); (viii) 이특이성 단일 쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965); 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구성된 다가 또는 다중특이성 단편인 "디아바디"(문헌 (WO94/13804; [P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993]))를 포함한다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 브릿지를 혼입함으로써 안정화될 수 있다(문헌 [Y. Reiter et al., Nature Biotech 14 1239-1245 1996]). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디 또한 제조될 수 있다(문헌 [S. Hu et al., Cancer Res. 56 3055-3061 1996]).
면역글로불린은 천연적인 것이거나, 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성의 것일 수 있다. 따라서, 또 다른 폴리펩티드에 융합된 항원 결합 도메인, 또는 등가물을 포함할 수 있는 키메라 면역글로불린 또한 포함한다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023에 기술되어 있다. 예를 들어, Fab2, Fab3, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 미니바디를 비롯한, 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 각종의 인공 면역글로불린은 공학처리된 것이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 모체 및 변이체 면역글로불린은 VH 및 VL 도메인, 둘 모두를 포함하는 전체 항체 또는 항체 단편이다.
면역글로불린은 본원에 기술된 바와 같이, 천연 공급원으로부터의 정제에 의해 단리되거나 수득될 수 있거나, 또는 유전자 재조합에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 합성 면역글로불린은 문헌 ([Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86] 또는 [Krebs et al., Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84])에 기술된 바와 같이, 적합한 발현 벡터내에서 합성되고 조립된 올리고뉴클레오티드를 수단으로 하여 생성된 유전자로부터의 발현에 의해 제조될 수 있다.
면역글로불린은 천연적으로, 시험관내에서, 또는 생체외에서, 예를 들어, 이종 진핵 세포(예를 들어, CHO 세포) 시스템을 사용하여 당화될 수 있거나, 또는 당화되지 않을 수 있다(예를 들어, 원핵 세포에서의 발현에 의해 생산된 경우). 바람직하게, 당화된 면역글로불린은 푸코스를 포함하지 않는다.
적합한 모체 면역글로불린은 공지된 아미노산 서열을 가지고, 이종 발현 시스템에서 재조합 발현에 의해 생산되는 임의의 면역글로불린일 수 있다. 이종 발현 시스템은 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 세포, 곤충 세포, 효모 세포 및 세균 세포, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 특히, 항체 단편일 경우에 그러하고, 이는 하기에서 더욱 상세하게 기술한다.
본원에 기술된 변형을 위해 적합한 모체 면역글로불린은 차선의 제조성을 나타낼 수 있다. 다시 말해, 모체 면역글로불린은 이종 시스템에서 제조 규모로 재조합적으로 발현되었을 때, 대조군 면역글로불린에 비하여 예를 들어, 증가된 응집 및/또는 감소된 생산성과 같은 하나 이상의 바람직하지 못한 생산 특성을 나타낼 수 있다.
적합한 대조군 면역글로불린으로는 같은 이종 시스템에서 만족스러운 제조성을 보이는, 같은 유형의 면역글로불린을 포함한다. 포유동물 시스템에서 제조 규모로 발현되었을 때, 적합한 모체 면역글로불린은 ELISA에 의해 측정될 경우, 가용성 물질을 1 g/L 이하로 함유하는 수율로 및/또는, GP-HPLC에 의해 측정될 경우, 응집을 5% 이상으로 생산할 수 있다. 세균 시스템에서 제조 규모로 발현되었을 때, 모체 면역글로불린은 ELISA에 의해 측정될 경우, 가용성 물질을 0.5 g/L 이하로 함유하는 수율로 및/또는, GP-HPLC에 의해 측정될 경우, 응집을 5% 이상으로 생산할 수 있다.
방법은 예를 들어, 본원에 기술된 생산 수준 및 응집 성향을 측정함으로써 모체 면역글로불린의 제조성을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 낮은 수율(예를 들어, 포유동물 시스템에서 가용성 물질을 1 g/L 이하로 함유하는 수율) 및/또는 높은 응집 성향(예를 들어, 5% 이상의 응집)으로 생산하는 모체 면역글로불린은 차선의 제조성을 나타내는 것으로 확인될 수 있다.
본원에 기술된 모체 면역글로불린의 서열을 변형시키는 것이 그의 제조성을 증가 또는 최적화시키는 데 유용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 모체 면역글로불린은 치료학적 항체, 즉, 치료학적으로 관련된 항원에 결합하여 유익한 치료학적 효과를 발휘하는 항체일 수 있다. 치료학적 항체에 대한 많은 일례들이 당업계에 공지되어 있다.
변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린과 같은 표적 항원에 결합하지만 상이한 아미노산 서열을 가지는 비천연적으로 발생된 면역글로불린으로서, 예를 들어, 변이체 면역글로불린의 서열은 모체 면역글로불린의 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 잔기에서 상이할 수 있다. 바람직하게, 본원에 기술된 바와 같이, 변이체 면역글로불린의 서열은 응집되기 쉬운 세그먼트 중의 하나 이상의 치환에 의해서만 오직 모체 면역글로불린 서열과 상이하다. 다시 말해, 본원에 기술된 하나 이상의 치환을 제외하면, 바람직하게는 변이체 면역글로불린의 서열은 모체 면역글로불린의 아미노산 서열과 일치한다.
변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린과 같은 에피토프에 결합하여, 항원에의 결합에 대해 모체 면역글로불린과 경쟁한다. 면역글로불린들 사이의 경쟁은 예를 들어, ELISA를 사용하고/거나, 특이적인 리포터 분자를 한 면역글로불린에 태깅하여 다른 태깅되지 않은 면역글로불린의 존재하에서 검출될 수 있도록 함으로써 시험관내에서 쉽게 분석할 수 있다. 모체 면역글로불린이 치료학적 항체일 때, 바람직하게 변이체 면역글로불린은 같은 유익한 치료학적 효과를 달성한다.
본원에 기술된 면역글로불린의 항원 결합 도메인은 바람직하게 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 면역글로불린 VH 및 VL 도메인들은 각각 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)에 의해 분리되어 있는 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다. CDR은 항체가 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 특이적 결합을 담당하는 아미노산 잔기 대다수를 함유하는, 가변 도메인 내의 초가변 영역이다. 특정의 기본 프레임워크가 수용할 수 있는 길이에 따라서 CDR의 길이는 2 내지 26개의 아미노산으로 다양할 수 있다.
바람직하게, 본원에 기술된 바와 같이 사용하기 위한 면역글로불린에는 CDR내 또는 CDR간의 이황화 결합은 없다.
본원에 기술된 바와 같이 사용하는 데 적합한 모체 면역글로불린 CH1, VH 및 VL 도메인은 임의의 생식 계열로부터 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 수득될 수 있거나, 또는 공지된 인간 가변 도메인의 컨센서스 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하기 기술하는 바와 같이, 예를 들어, 항체 공학처리에 사용하기 위한 것으로, 생산된 변이체 면역글로불린의 VH 및 VL 도메인에는 하나 이상의 CDR 서열(예를 들어, CDR3)이 존재하지 않을 수 있다.
변이체 면역글로불린은 이종 시스템에서 제조 규모로 재조합적으로 발현되었을 때, 모체 면역글로불린에 비하여 예를 들어, 감소된 응집 및/또는 증가된 생산성과 같은 개선된 제조성을 나타낼 수 있다. 포유동물 시스템에서 제조 규모로 발현되었을 때, 변이체 면역글로불린은 예를 들어, ELISA에 의해 측정될 경우, 가용성 물질을 1 g/L 초과로 함유하는 수율로 및/또는, GP-HPLC에 의해 측정될 경우, 응집을 5% 미만으로 생산할 수 있다. 바람직하게, 본원에 기술된 변이체 면역글로불린은 가용성 물질을 1 g/L 초과로 함유하는 수율로 생산할 수 있고, 동시에 응집을 5% 미만으로 나타낼 수 있다. 세균 시스템에서 제조 규모로 발현되었을 때, 변이체 면역글로불린은 예를 들어, ELISA에 의해 측정될 경우, 가용성 물질을 0.5 g/L 초과로 함유하는 수율로 및/또는, GP-HPLC에 의해 측정될 경우, 응집을 5% 미만으로 생산할 수 있다. 바람직하게, 본원에 기술된 변이체 면역글로불린은 가용성 물질을 0.5g g/L 초과로 함유하는 수율로 생산할 수 있고, 동시에 응집을 5% 미만으로 나타낼 수 있다.
응집되기 쉬운 세그먼트는 주변 서열에 비하여 응집 성향이 높고, 면역글로불린의 제조성에 악영향을 미치는, 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄 서열내 존재하는 아미노산 잔기로 이루어진 단쇄 서열이다. 응집되기 쉬운 세그먼트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.
응집되기 쉬운 세그먼트는 예를 들어, 면역글로불린의 CH1, VH 또는 VL 도메인에 위치할 수 있다. 면역글로불린의 단일 도메인 또는 영역, 예를 들어, VH 또는 VL 도메인으로부터의 FR1, FR2, FR3, FR4 또는 CDR3 영역, 또는 CH1 도메인은 그의 서열내 다중의 응집되기 쉬운 세그먼트를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 이들 응집되기 쉬운 세그먼트들 중 하나 이상에서 하나 이상의 잔기를 치환하면 본원에 기술된 면역글로불린의 제조성은 개선될 수 있다.
하기 기술하는 면역글로불린 잔기 위치는 문헌 ([Kabat, EA, Wu, T.T., Perry, H. M., Gottesmann, K.S & Foeller, C. (1991)], [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242. U.S. Department of Health and Human Services])에 기술된 체계에 따라 번호화된 것이다.
적절한 경우, 치환 위치는 면역글로불린 서열 중 비변이 잔기인, 카바트(Kabat)에 따라 번호화된 잔기를 기준으로 하여 기술될 수 있다
항체를 번호화하는 대체 체계는 문헌 [Honegger, A and Plueckthun A. (2001). Yet Another Numbering Scheme for Immunoglobulin Variable Domains: An Automatic Modelling and Analysis Tool. J. Mol . Biol 309, 657-670]에 기술되어 있다. 하기 표 1a 및 1b는 오네게르(Honegger)와 카바트 번호화 체계 사이의 유사성을 나타낸다.
본원에 기술된 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 치환되는 아미노산은 바람직하게 천연적으로 발생된 20개 아미노산 중 하나이다. 천연적으로 발생된 아미노산 및 그의 표준 1 및 3분자 약어는 당업계에 주지되어 있다(문헌 [Principles of Protein Structure G. Schulz & R. Schirmer, (1979) Springer-Verlag NY Inc USA]).
치환은 모체 면역글로불린의 VL 도메인 프레임워크 영역 내의 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 도입될 수 있다. VL 도메인 프레임워크 영역의 적합한 응집되기 쉬운 세그먼트는 20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트, 37번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트, 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 및 74번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트는 VL 프레임워크 영역 1에 위치하며, VL 도메인의 15번 위치부터 23번 위치를 포괄한다.
20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 VL 도메인의 18번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 18번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 18번 위치의 잔기는 R, S 또는 V로 치환될 수 있다.
예를 들어, 모체 면역글로불린 중 18번 위치의 아미노산 잔기는 T일 수 있다. 변이체 면역글로불린은 T18R, T18S 또는 T18V 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 VL 도메인의 20번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 20번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 20번 위치의 잔기는 K, R, S 또는 V로 치환될 수 있다.
예를 들어, 모체 면역글로불린 중 20번 위치의 아미노산 잔기는 T일 수 있다. 변이체 면역글로불린은 T20K, T20R, T20S 또는 T20V 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
37번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트는 VL 프레임워크 영역 2에 위치하며, VL 도메인의 36번 위치부터 38번 위치까지를 포괄한다.
37번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 37번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 37번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 37번 위치의 잔기는 Q 또는 N으로 치환될 수 있다.
예를 들어, 모체 면역글로불린 중 37번 위치의 아미노산 잔기는 L일 수 있다. 변이체 면역글로불린은 L37Q 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트는 VL 프레임워크 영역 2에 위치하며, VL 도메인의 42번 위치부터 49번 위치까지를 포괄한다.
45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 45번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 45번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 45번 위치의 잔기는 E, K, R, Q 또는 V로 치환된다.
예를 들어, 모체 면역글로불린 중 45번 위치의 아미노산 잔기는 T일 수 있다. 변이체 면역글로불린은 T45E, T45K, T45R, T45Q 또는 T45V 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 모체 면역글로불린 중 45번 위치의 아미노산 잔기는 Q일 수 있다. 변이체 면역글로불린은 Q45E, Q45K 또는 Q45R 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 46번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 46번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 46번 위치의 잔기는 L, Y, K, R, H, F 또는 S로 치환될 수 있다.
예를 들어, 모체 면역글로불린 중 46번 위치의 아미노산 잔기는 T일 수 있다. 변이체 면역글로불린은 T46L 또는 T46Y 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 모체 면역글로불린 중 46번 위치의 아미노산 잔기는 L일 수 있다. 변이체 면역글로불린은 L46K, L46R, L46H, L46F 또는 L46S 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
74번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트는 VL 프레임워크 영역 3에 위치하며, VL 도메인 서열의 71번 위치부터 77번 위치까지를 포괄한다.
74번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 74번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 74번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 74번 위치의 잔기는 V로 치환될 수 있다.
예를 들어, 모체 면역글로불린 중 74번 위치의 아미노산 잔기는 T일 수 있다. 변이체 면역글로불린은 T74V 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
치환은 모체 면역글로불린의 VL CDR3 영역 내의 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 도입될 수 있다. 적합한 응집되기 쉬운 세그먼트는 VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트 및 VL CDR3 C 말단 응집되기 쉬운 세그먼트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트는 VL 도메인 서열 중 비변이 잔기 C88부터 잔기 C88로부터의 8번 위치의 아미노산 C 말단까지를 포괄한다. 예를 들어, VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트는 VL 도메인의 88번 위치부터 95a번 위치까지를 포괄할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 88번 위치(C88), 89번 위치(C88+1 ; 즉, 잔기 C88로부터의 1번 잔기 C 말단), 90번 위치(C88+2), 91번 위치(C88+3), 92번 위치(C88+4), 93번 위치(C88+5), 94번 위치(C88+6), 95번 위치(C88+7) 및 95a번 위치(C88+8) 중 하나 이상의 위치에 있는 잔기는 변이체 면역글로불린 중 상이한 아미노산 잔기에 의해 대체될 수 있다. 비변이 카바트 잔기 C88을 기준으로 하여 번호화된 VL CDR3 위치는 괄호 안에 표기되어 있다.
VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 91번 위치(C88+3)에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 91번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 91번 위치의 잔기는 A, F, L, R, S 또는 W로 치환될 수 있다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 91번 위치의 아미노산 잔기는 Y일 수 있다. 변이체 면역글로불린은 Y91A, Y91F, Y91L, Y91R, Y91S 또는 Y91W 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 93번 위치(C88+5)에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 93번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 93번 위치의 잔기는 D, F, L, Q, S, T, W 또는 Y로 치환될 수 있다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 93번 위치의 아미노산 잔기는 P일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 P93D, P93F, P93L, P93Q, P93S, P93T, P93W 또는 P93Y 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
VL CDR3 C 말단 응집되기 쉬운 세그먼트는 VL 도메인 서열 중 비변이 잔기 F98의 3번 위치의 아미노산 N 말단(즉, F98-3번 위치 또는 95번 위치)부터 99번 위치를 포괄한다.
모체 면역글로불린 중 95번 위치(F98-3), 96번 위치(F98-2), 97번 위치(F98-1), 98번 위치 또는 99번 위치 중 하나 이상의 위치에 존재하는 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린 중 상이한 아미노산 잔기에 의해 대체될 수 있다.
VL CDR3 C 말단 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 96번 위치(F98-2)에서 발생할 수 있다. 카바트 잔기 F98에의 인접성에 의해 번호화된 VL CDR3 위치는 괄호 안에 표기되어 있다.
모체 면역글로불린 중 96번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린 중 상이한 아미노산 잔기에 의해 대체될 수 있다. 바람직하게, 96번 위치의 잔기는 E, L, V 또는 W로 치환될 수 있다.
예를 들어, 모체 면역글로불린 중 96번 위치의 아미노산 잔기는 R일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 R96E, R96L, R96V 또는 R96W 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
치환은 모체 면역글로불린의 VH 도메인 프레임워크 영역 내의 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 도입될 수 있다. VH 도메인 프레임워크 영역의 적합한 응집되기 쉬운 세그먼트는 FR1 응집되기 쉬운 세그먼트; 75번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트; 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트; 및 102번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트(또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
FR1 응집되기 쉬운 세그먼트는 VH 프레임워크 영역 1에 위치하며, 예를 들어, VH 도메인 서열의 1번 위치부터 21번 위치까지를 포괄할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트는 1번 위치부터 3번 위치; 4번 위치부터 6번 위치, 11번 위치부터 13번 위치, 및 16번 위치부터 21번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 응집되기 쉬운 세그먼트를 포함할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트는 VH 도메인 서열의 1번 위치부터 3번 위치까지를 포괄할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 1번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 1번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린 중 상이한 아미노산 잔기에 의해 대체될 수 있다. 바람직하게, 1번 위치의 잔기는 E, Q, D, A 또는 V로 치환될 수 있다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 1번 위치의 아미노산 잔기는 E일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 E1Q, E1D, E1A 또는 E1V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있거나, 모체 면역글로불린 중 1번 위치의 아미노산 잔기는 Q일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 Q1E, Q1D, Q1A 또는 Q1V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트는 VH 도메인의 4번 위치부터 6번 위치까지를 포괄할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 VH 도메인의 5번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 5번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 5번 위치의 잔기는 V로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 5번 위치의 아미노산 잔기는 L일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 L5V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트는 VH 도메인의 11번 위치부터 13번 위치까지를 포괄할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 VH 도메인의 12번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 12번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 12번 위치의 잔기는 V로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 12번 위치의 아미노산 잔기는 L일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 L12V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트는 VH 도메인의 16번 위치부터 21번 위치까지를 포괄할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 17번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 17번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 17번 위치의 잔기는 R로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 17번 위치의 아미노산 잔기는 G일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 G17R 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 19번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 19번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 19번 위치의 잔기는 T 또는 V로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 19번 위치의 아미노산 잔기는 L일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 L19T 또는 L19V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 20번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 20번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 20번 위치의 잔기는 A, K, S 또는 T로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 20번 위치의 아미노산 잔기는 R일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 R20A, R20K, R20S 또는 R20T 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
75번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트는 VH 도메인의 60번 위치부터 85번 위치까지를 포괄할 수 있다.
75번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 61번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 61번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 예를 들어, 61번 위치의 잔기는 K, R, Q, E, D, N, 또는 A로 치환될 수 있다. 바람직하게, 61번 위치의 잔기는 R로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 61번 위치의 아미노산 잔기는 P일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 P61R 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
75번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 85번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 85번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 예를 들어, 85번 위치의 잔기는 E, D 또는 A로 치환될 수 있다. 바람직하게, 85번 위치의 잔기는 E로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 85번 위치의 아미노산 잔기는 V일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 V85E, V85D 또는 V85A 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트는 VH 프레임워크 영역 3에 위치하고, 91번 위치부터 99 또는 100번 위치까지를 포괄할 수 있다.
모체 면역글로불린의 VH 도메인 중 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치, 95번 위치, 96번 위치, 97번 위치, 98번 위치, 99번 위치 및/또는 100번 위치 중 하나 이상의 위치에 존재하는 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다.
VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 94번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 94번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 예를 들어, 94번 위치의 잔기는 R, K 또는 T로 치환될 수 있다. 바람직하게, 94번 위치의 잔기는 R로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 94번 위치의 아미노산 잔기는 K일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 K94R 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있거나, 또는 모체 면역글로불린 중 94번 위치의 아미노산 잔기는 H일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 H94R, H94K 또는 H94T 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 95번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 95번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 예를 들어, 95번 위치의 잔기는 E 또는 D로 치환될 수 있다. 바람직하게, 95번 위치의 잔기는 D로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 95번 위치의 아미노산 잔기는 R일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 R95E 또는 R95D 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 96번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 96번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 96번 위치의 잔기는 A로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 96번 위치의 아미노산 잔기는 G일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 G96A 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 100번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 100번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 100번 위치의 잔기는 F, G, L, M, 또는 P로 치환될 수 있다. 바람직하게, 100번 위치의 잔기는 F로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 100번 위치의 아미노산 잔기는 V일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 V100F, V100G, V100L, V100M, 또는 V100P 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
치환은 모체 면역글로불린의 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 도입될 수 있다.
VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트는 100c번 위치(즉, 카바트 잔기 D101 기준으로 번호화된, 비변이 잔기 D101로부터의 2번 위치의 아미노산 N 말단 또는 D101-2)부터 102번 위치 또는 103번 위치까지를 포괄한다.
모체 면역글로불린의 VH 도메인 중 D101-2번 위치, D101-1번 위치, (잔기 D101로부터의 2번 또는 1번 위치의 아미노산 N 말단), 101번 위치, 102번 위치 및 103번 위치 중 하나 이상의 위치에 존재하는 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린 중 상이한 아미노산 잔기에 의해 대체될 수 있다.
VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 VL 도메인의 D101-2번 위치(잔기 D101로부터의 2번 위치의 아미노산 N 말단)에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 D101-2번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린 중 상이한 아미노산 잔기에 의해 대체될 수 있다. 바람직하게, D101-2번 위치의 아미노산 잔기는 D, E, F, G, P, S, T, W, 또는 Y로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 D101-2번 위치의 아미노산 잔기는 A일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 A(D101-2)D, A(D101-2)E, A(D101-2)F, A(D101-2)G, A(D101-2)P, A(D101-2)S, A(D101-2)T, 또는 A(D101-2)W, 또는 A(D101-2)Y 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 다시 말해, D101로부터 2번 위치의 아미노산 N 말단, 예를 들어, A100c에서의 A로부터 D, E, F, G, P, S, T, W, 또는 Y로의 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 VL 도메인의 D101-1번 위치(잔기 D101로부터의 1번 위치의 아미노산 N 말단)에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 D101-1번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, D101-1번 위치의 아미노산 잔기는 F, G, L, P 또는 M으로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 D101-1번 위치의 아미노산 잔기는 S일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 S(D101-1)F, S(D101-1)G, S(D101-1)L, S(D101-1)P 또는 S(D101-1)M 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 잔기 S(D101-1)은 S100d에 상응한다.
VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 102번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 102번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 102번 위치의 아미노산 잔기는 A, F, H, I, L, V 또는 Y로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 102번 위치의 아미노산 잔기는 P일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 P102A, P102F, P102H, P102I, P102L, P102Y 또는 P102V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있거나, 모체 면역글로불린 중 102번 위치의 아미노산 잔기는 S일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 S102A, S102F, S102H, S102I, S102L, S102Y 또는 S102V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 103번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 103번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 103번 위치의 아미노산 잔기는 I, L 또는 V로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 103번 위치의 아미노산 잔기는 W일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 W103I, W103L 또는 W103V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
CH1 응집되기 쉬운 세그먼트는 150번 위치부터 156번 위치를 포괄한다.
CH1 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환은 153번 위치에서 발생할 수 있다.
모체 면역글로불린 중 153번 위치의 아미노산 잔기는 변이체 면역글로불린에서 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 153번 위치의 잔기는 V로 치환된다. 예를 들어, 모체 면역글로불린 중 153번 위치의 아미노산 잔기는 S일 수 있고, 변이체 면역글로불린은 S153V 치환을 포함하는 CH1 도메인을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린 서열과 비교하여, 본원에 기술된 바와 같이 최대 10개의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환을 포함할 수 있다.
치환은 같은 응집되기 쉬운 세그먼트에, 또는 상이한 응집되기 쉬운 세그먼트에 존재할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 본원에 기술된 바와 같이 상이한 응집되기 쉬운 세그먼트에 1, 2, 3, 4개 이상의 치환을 포함할 수 있다. 변이체 면역글로불린은 VH 도메인, VL 도메인 중에, 및/또는 CH1 영역 중에 치환을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 치환으로 구성된 임의 조합이 사용될 수 있다. 치환으로 구성된 적합한 조합에 대한 예는 하기 표 3a 및 3b에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 변이체 면역글로불린은 VL FR1 및/또는 FR2 도메인 중에 2개의 치환을; VL CDR3 도메인 중에 3개의 치환을; VL FR2 도메인 중에 2개의 치환 및 VL CDR3 도메인 중에 3개의 치환을; VL FR1 도메인 중에 2개의 치환, VL FR2 도메인 중에 2개의 치환 및 VL CDR3 도메인 중에 3개의 치환을; VH FR1 도메인 중에 2개의 치환을; VH FR1 도메인 중에 1개의 치환 및 VH CDR3 도메인 중에 1개의 치환; VH CDR3 도메인 중에 2개의 치환; 또는 CH1 도메인 중에 1개의 치환 및 VH FR1 도메인 중에 1개의 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 18번 위치 및 20번 위치, 둘 모두에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 18번 위치 및 20번 위치, 둘 모두의 잔기는 R로 치환될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 T18R 및 T20R 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 1개의 치환 및 74번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 1개의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 18번 위치 및 74번 위치, 둘 모두에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 18번 위치의 잔기는 R로 치환될 수 있고, 74번 위치의 잔기는 V로 치환될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 T18R 및 T74V 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 45번 위치 및 46번 위치, 둘 모두에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 45번 위치의 잔기는 K 또는 R로 치환될 수 있고, 46번 위치의 잔기는 L로 치환될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 T45K(또는 T45R) 및 T46L 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개의 치환 및 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 18번 위치, 20번 위치, 45번 위치 및 46번 위치에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 18번 위치 및 20번 위치, 둘 모두의 잔기는 R로 치환될 수 있고, 45번 위치의 잔기는 K 또는 R로 치환될 수 있고, 46번 위치의 잔기는 L로 치환될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 T18R, T20R, T45K, 및 T46L 치환 또는 T18R, T20R, T45R 및 T46L 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 91번 위치(C88+3), 93번 위치(C88+5), 및 96번 위치(F98-2)에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 91번 위치의 잔기는 W로 치환될 수 있고, 93번 위치의 잔기는 Q로 치환될 수 있고, 96번 위치의 잔기는 V로 치환될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 Y91W(C88+3), P93Q(C88+5), 및 R96V(F98-2) 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개의 치환 및 VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 45번 위치, 46번 위치, 91번 위치(C88+3), 93번 위치(C88+5), 및 96번 위치(F98-2)에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 45번 위치의 잔기는 K 또는 R로 치환될 수 있고, 46번 위치의 잔기는 L로 치환될 수 있고, 91번 위치의 잔기는 W로 치환될 수 있고, 93번 위치의 잔기는 Q로 치환될 수 있고, 96번 위치의 잔기는 V로 치환될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 T45K, T46L, Y91W(C88+3), P93Q(C88+5), 및 R96V (F98-2) 치환 또는 T45R, T46L, Y91W(C88+3), P93Q(C88+5), 및 R96V(F98-2) 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개의 치환, 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개의 치환, 및 VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개 또는 3개의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 18번 위치, 20번 위치, 45번 위치, 46번 위치, 91번 위치(C88+3), 93번 위치(C88+5), 및 96번 위치(F98-2)에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 18번 위치 및 20번 위치, 둘 모두의 잔기는 R로 치환될 수 있고, 45번 위치의 잔기는 K 또는 R로 치환될 수 있고, 46번 위치의 잔기는 L로 치환될 수 있고, 91번 위치의 잔기는 W로 치환될 수 있고, 93번 위치의 잔기는 Q로 치환될 수 있고, 96번 위치의 잔기는 V로 치환될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 T18R, T20R, T45K, T46L, Y91W(C88+3), P93Q(C88+5), 및 R96V(F98-2) 치환, 또는 T18R, T20R, T45R, T46L, Y91W(C88+3), P93Q(C88+5), 및 R96V(F98-2) 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 VL 37번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 및 VL 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 37번 위치 및 45번 위치에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 37번 위치의 잔기는 Q 또는 N으로 치환될 수 있고, 45번 위치의 잔기는 E, K 또는 R로 치환될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 L37Q 및 Q45R 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트 및 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 1번 위치 및 102번 위치, 둘 모두에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1번 위치의 잔기는 Q, A, E 또는 V로 치환될 수 있고, 102번 위치의 잔기는 Y로 치환될 수 있다. 예를 들어, VH 도메인은 Q1A 및 P102Y 치환, Q1E 및 P102Y 치환, Q1V 및 P102Y 치환, E1A 및 P102Y 치환, E1Q 및 P102Y 치환, 또는 E1V 및 P102Y 치환을 포함할 수 있다.
다른 일례로, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 1번 위치 및 103번 위치, 둘 모두에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1번 위치의 잔기는 Q, A, D, E 또는 V로 치환될 수 있고, 103번 위치의 잔기는 L로 치환될 수 있다. 예를 들어, VH 도메인은 Q1A 및 W103L 치환, Q1E 및 W103L 치환, Q1D 및 W103L 치환, Q1V 및 W103L 치환, E1A 및 W103L 치환, E1Q 및 W103L 치환, E1D 및 W103L 치환 또는 E1V 및 W103L 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개의 치환을 포함할 수 있다.
예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 100c번 위치(D101-2) 및 100d번 위치(D101-1), 둘 모두에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 100c번 위치의 잔기는 W로 치환될 수 있고, 100d번 위치의 잔기는 F로 치환될 수 있다. 예를 들어, VH 도메인은 A100cW 및 S100dF 치환을 포함할 수 있다.
다른 일례로, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 100d번 위치(D101-1) 및 102번 위치, 둘 모두에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 100d번 위치의 잔기는 F 또는 M로 치환될 수 있고, 102번 위치의 잔기는 V 또는 Y로 치환될 수 있다. 예를 들어, VH 도메인은 S100dF 및 P102V 치환, S100dM 및 P102V 치환, S100dF 및 P102Y 치환 또는 S100dM 및 P102Y 치환을 포함할 수 있다.
다른 일례로, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 102번 위치 및 103번 위치, 둘 모두에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 102번 위치의 잔기는 V 또는 Y로 치환될 수 있고, 103번 위치의 잔기는 L, I 또는 V로 치환될 수 있다. 예를 들어, VH 도메인은 P102Y 및 W103L 치환, P102Y 및 W103I 치환, P102Y 및 W103V 치환, P102V 및 W103L 치환, P102V 및 W103I 치환, 또는 P102V 및 W103V 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 및 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 95번 위치 및 102번 위치, 둘 모두에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 95번 위치의 잔기는 E 또는 D로 치환될 수 있고, 102번 위치의 잔기는 A, F, H, I, L, V, 또는 Y로 치환될 수 있다. 예를 들어, VH 도메인은 R95D 및 S102V 치환을 포함할 수 있다. 임의로, VH 도메인은 상기 기술된 바와 같이, 94번 위치 및 100번 위치, 둘 모두에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 94번 위치의 잔기는 R, K 또는 T로 치환될 수 있고, 100번 위치의 잔기는 F, G, L, M 또는 P로 치환될 수 있다. 예를 들어, VH 도메인은 H94R, R95D, V100F 및 S102V 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 CH1 응집되기 쉬운 세그먼트 및 VH 19번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 153번 위치에 치환을 포함하는 CH1 도메인, 및 19번 위치에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 153번 위치의 잔기는 V로 치환될 수 있고, 19번 위치의 잔기는 T로 치환될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린은 CH1 도메인 중 S153V 치환, 및 VH 도메인 중 L19T 치환을 포함할 수 있다.
다른 일례로, 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이, 153번 위치에 치환을 포함하는 CH1 도메인, 및 상기 기술된 바와 같이, 20번 위치에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 153번 위치의 잔기는 V로 치환될 수 있고, 20번 위치의 잔기는 A로 치환될 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 S153V 및 R20A 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 VL 20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VL 도메인, 및 VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 20번 위치에 치환을 포함하는 VH 도메인, 및 18번 위치에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, VH 도메인 중 20번 위치의 잔기는 A로 치환될 수 있고, VL 도메인 중 18번 위치의 잔기는 V로 치환될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린은 T18V 치환을 포함하는 VL 도메인, 및 R20A 또는 R20V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 VL 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VL 도메인, 및 VH 75번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 61번 및 85번 위치에 치환을 포함하는 VH 도메인, 및 46번 위치에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, VH 도메인 중 61번 위치의 잔기는 K, R, Q, E, D, N 및 A, 바람직하게 R로 치환될 수 있고, VH 도메인 중 85번 위치의 잔기는 E, D, 또는 A, 바람직하게 E로 치환될 수 있고, VL 도메인 중 46번 위치의 잔기는 K, R, H, F, 또는 S, 바람직하게 R로 치환될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린은 L46R 치환을 포함하는 VL 도메인, 및 P61R 및 V85E 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 VL 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VL 도메인, 및 VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환, 및 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 95번 및 102번 위치에 치환을 포함하는 VH 도메인, 및 37번 및 45번 위치에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, VH 도메인 중 95번 위치의 잔기는 E 또는 D, 바람직하게 D로 치환될 수 있고; VH 도메인 중 102번 위치의 잔기는 A, F, H, I, L, V 또는 Y, 바람직하게 Y로 치환될 수 있고; VL 도메인 중 37번 위치의 잔기는 Q 또는 N, 바람직하게 Q로 치환될 수 있고; VL 도메인 중 45번 위치의 잔기는 R, K 또는 E, 바람직하게 R로 치환될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린은 L37Q 및 Q45R 치환을 포함하는 VL 도메인, 및 R95D 및 S102V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 VL 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VL 도메인, 및 VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린은 94번 및 95번 위치에 치환을 포함하는 VH 도메인, 및 46번 위치에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, VH 도메인 중 94번 위치의 잔기는 R, K 또는 T, 바람직하게 R로 치환될 수 있고, VH 도메인 중 95번 위치의 잔기는 E 또는 D, 바람직하게 D로 치환될 수 있고, VL 도메인 중 46번 위치의 잔기는 K, R, H, F, 또는 S, 바람직하게 R로 치환될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린은 L46R 치환을 포함하는 VL 도메인, 및 H94R 및 R95D 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH, VL 및 CH1 도메인 중 응집되기 쉬운 세그먼트의 아미노산 서열내 치환을 도입하는 데 요구되는 기법은 일반적으로 당업계에서 이용가능하다. 하나 이상의 치환을 포함하는 변이체 면역글로불린을 코딩하는 핵산은 예를 들어, 문헌 ([Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992] 또는 [Molecular Cloning : a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press])에 기재되어 있는 바와 같은, 표준 DNA 조작법 및 돌연변이유발 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 이어서, 하기 기술하는 바와 같이, 핵산은 발현되어 변이체 면역글로불린을 제조할 수 있다.
변이체 서열은 모체 면역글로불린의 표적 항원에 결합하고/거나, 그를 중화시킬 수 있는 능력에 대해, 및/또는 개선된 제조성에 대해 테스트될 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, 하나 이상의 치환을 도입하면, 발현시 변이체 면역글로불린의 생산성은 그의 모체 면역글로불린에 비하여 증가되고, 응집 성향은 그의 모체 면역글로불린에 비하여 감소됨으로써, 변이체 면역글로불린의 제조성은 그의 모체 면역글로불린에 비하여 증가될 수 있다.
예를 들어, 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 또는 500% 이상 증가된 생산성 및/또는 모체 면역글로불린에 비하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 99% 이상 감소된 응집을 나타낼 수 있다. 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 최대 100%까지 감소된 응집을 나타낼 수 있다(즉, 완전한 응집 폐기).
본원에 기술된 변이체 면역글로불린을 제조하는 방법은 모체 면역글로불린을 제공하는 단계, VL 도메인 중 VL 37번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 VL 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 도입하는 단계, 및/또는
VH 도메인 중 VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트; VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트; 및 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 도입하는 단계,
이를 통해 변이체 면역글로불린을 제조하고, 여기서, 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 증가된 생산성 및 감소된 응집, 둘 모두를 나타내는 것인 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 변이체 면역글로불린을 제조하는 방법은
모체 면역글로불린을 제공하는 단계,
VH 도메인의 1번 위치에 A, D, E, Q 또는 V; 17번 위치에 R; 94번 위치에 R; 95번 위치에 D; 96번 위치에 A; 100번 위치에 F; 100d번 위치에 F, G, L, M 또는 P, 바람직하게 F 또는 M; 102번 위치에 A, F, H, I, L, V 또는 Y, 바람직하게 V 또는 Y 치환 중 하나 이상을 도입하는 단계; 및/또는
VL 도메인의 37번 위치에 Q; 45번 위치에 E, K, R, Q 또는 V, 바람직하게 K 또는 R; 46번 위치에 L 또는 Y, 바람직하게 L 치환을 도입하는 단계;
이를 통해 변이체 면역글로불린을 제조하고, 여기서, 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 증가된 생산성 및 감소된 응집, 둘 모두를 나타내는 것인 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 적합한 VH 도메인은 상기 기술된 바와 같이, 94번 및 102번 위치에 치환을 가질 수 있고, 임의로는 추가로 94번 및 100번 위치에 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, VH 도메인의 95번 위치의 잔기는 D로 치환될 수 있고, 102번 위치의 잔기는 A, F, H, I, L, V 또는 Y, 바람직하게 V 또는 Y로 치환될 수 있고; 임의로 94번 위치의 잔기는 또한 R로 치환될 수 있고, 100번 위치의 잔기는 F로 치환될 수 있다.
적합한 VL 도메인은 상기 기술된 바와 같이, 37번 및 45번 위치에 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 37번 위치의 잔기는 Q로 치환될 수 있고, 45번 위치의 잔기는 E, K, R, Q 또는 V, 바람직하게 K 또는 R로 치환될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 L37Q 및 Q45R 치환을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 94번 및 95번 위치에 치환을 포함하는 VH 도메인, 및 46번 위치에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, VH 도메인 중 94번 및 95번 위치의 잔기는 각각 R 및 D로 치환될 수 있고, VL 도메인 중 46번 위치의 잔기는 R로 치환될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린은 L46R 치환을 포함하는 VL 도메인 및 H94R 및 R95D 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
다른 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 95번 및 102번 위치에 치환을 포함하는 VH 도메인, 및 37번 및 45번 위치에 치환을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, VH 도메인 중 95번 및 102번 위치의 잔기는 각각 D 및 V로 치환될 수 있고, VL 도메인 중 37번 및 45번 위치의 잔기는 각각 Q 및 R로 치환될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린은 L73Q 및 Q45R 치환을 포함하는 VL 도메인 및 R95D 및 S102V 치환을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
상기 기술된 응집되기 쉬운 세그먼트의 존재는 감소된 또는 차선(sub-optimal)의 제조성을 나타내는 면역글로불린을 확인하는 데 도움이 될 수 있다.
면역글로불린의 제조성을 평가하는 방법은
면역글로불린의 VL 도메인 중 18번 위치, 20번 위치, 45번 위치, 46번 위치, 74번 위치, 91번 위치, 93번 위치, 및 96번 위치, 및 면역글로불린의 VH 도메인 중 1번 위치, 5번 위치, 12번 위치, 17번 위치, 19번 위치, 20번 위치, 94번 위치, 96번 위치, 100c번 위치, 100d번 위치, 102번 위치, 103번 위치, 및 CH1 도메인 중 153번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 확인하는 단계를 포함할 수 있으며,
면역글로불린의 VL 도메인 중 18번 위치에 R, S 또는 V, 바람직하게 R 또는 V 이외의 잔기, 20번 위치에 K, R, S 또는 V, 바람직하게 R 또는 V 이외의 잔기, 45번 위치에 E, K, R, Q 또는 V, 바람직하게 K 또는 R 이외의 잔기, 46번 위치에 L 또는 Y, 바람직하게 L 이외의 잔기, 74번 위치에 V 이외의 잔기, 91번 위치에 A, F, L, R, S, 또는 W, 바람직하게 W 이외의 잔기, 93번 위치에 D, F, L, Q, S, T, W 또는 Y, 바람직하게 Q 이외의 잔기, 및/또는 96번 위치에 E, L, V 또는 W, 바람직하게 V 이외의 잔기가 존재한다는 것, 및/또는
면역글로불린의 VH 도메인 중 1번 위치에 A, D, E, Q 또는 V 이외의 잔기, 5번 또는 12번 위치에 V 이외의 잔기, 17번 위치에 R 이외의 잔기, 19번 위치에 T 또는 V, 바람직하게 T 이외의 잔기, 20번 위치에 A, K, S 또는 T, 바람직하게 A 이외의 잔기, 94번 위치에 R 이외의 잔기, 96번 위치에 A 이외의 잔기, 100c번 위치에 D, E, F, G, P, S, T, W, 또는 Y, 바람직하게 W 이외의 잔기, 100d번 위치에 F, G, L, M 또는 P, 바람직하게 F 또는 M 이외의 잔기, 102번 위치에 A, F, H, I, L, V 또는 Y, 바람직하게 V 또는 Y 이외의 잔기, 103번 위치에 I, L 또는 V 이외의 잔기가 존재한다는 것, 및/또는 CH1 도메인 중 153번 위치에 V 이외의 잔기가 존재한다는 것은 면역글로불린이 차선의 제조성을 가진다는 것을 시사한다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린의 VH 도메인 중 100d번 및/또는 102번 위치에 있는 아미노산 잔기의 실체를 확인할 수 있다. 100d번 위치에 F, G, L, M 또는 P, 바람직하게, F 또는 M 이외의 잔기, 및/또는 102번 위치에 A, F, H, I, L, V 또는 Y, 바람직하게, V 또는 Y 이외의 잔기가 존재한다는 것은 면역글로불린의 제조성이 차선의 것임을 시사한다.
대조군 면역글로불린에 비하여 제조성이 감소되어 있거나, 차선의 것인 것으로 확인된 면역글로불린은 개선된 제조성을 나타내는 변이체 면역글로불린을 제조하기 위한, 상기 기술된 방법에 의해 변형시키고자 하는 후보물질이 될 수 있다.
특히, 면역글로불린 서열 내의 제조성에 대해 유해한 효과를 가질 수 있는 하나 이상의 잔기를 확인할 수 있다. 이어서, 제조성을 개선시키기 위해 확인된 잔기를 변경시키거나 변형시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 기술된 방법에 의해 제조된 모체 면역글로불린의 변이체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은
변이체 면역글로불린이
모체 면역글로불린의 서열과 비교하여 프레임워크 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VL 도메인;
모체 면역글로불린의 서열과 비교하여 프레임워크 응집되기 쉬운 영역 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VH 도메인; 및/또는
모체 면역글로불린의 서열과 비교하여 CH1 응집되기 쉬운 영역에 치환을 포함하는 CH1 도메인을 포함하는 것인, 모체 면역글로불린의 변이체를 제공한다.
적합한 응집되기 쉬운 세그먼트 및 치환은 상기 기술되어 있다.
VL, VH, 또는 CH1 도메인 중 한 위치에서의 치환은 모체 서열 중 상기 위치에 존재하는 잔기를 상이한 잔기로, 바람직하게, 상기 기술된 잔기로 대체시키는 것을 포함한다. 모체 면역글로불린이 아미노산 서열 중 적절한 위치에 상기 기술된 것과 같은 잔기를 이미 포함하고 있을 경우, 이는 본원에 기술된 치환, 또는 치환된 잔기는 아니다. 따라서, 모체 또는 생식계열 면역글로불린은 본원에 기술된 변이체 면역글로불린이 아니다.
상기 기술된 바와 같이, 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린과 유사하거나 동일한 생물학적 활성을 가질 수 있지만, 이종 발현 시스템에서 개선된 제조성, 예를 들어 감소된 응집 성향, 및/또는 증가된 생산성을 나타낼 수 있다.
예를 들어, 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 또는 500% 이상 증가된 생산성 및/또는 모체 면역글로불린에 비하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 99% 이상 감소된 응집(즉, 천연 상태의 총체 중 응집된 분자 비율의 감소)을 나타낼 수 있다. 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 최대 100%까지 감소된 응집을 나타낼 수 있다(즉, 완전한 응집 폐기).
상기 기술된 바와 같이, 변이체 면역글로불린은 모체 면역글로불린에 비하여 개선된 생체이용성 및/또는 감소된 면역원성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 기술된 변이체 면역글로불린 또는 그의 CH1, VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 전체적으로 또는 부분적으로 합성된 것일 수 있다. 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열에 관해 언급하는 것은 명시된 서열을 가진 DNA 분자를 포함하고, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, U가 T를 대신하여 치환되어 있는, 명시된 서열을 가진 RNA 분자를 포함한다.
본원에 기술된 변이체 면역글로불린 분자 또는 그의 CH1, VH 도메인 및/또는 VL 도메인은 상기 변이체 면역글로불린 분자 또는 그의 CH1, VH 도메인 및/또는 VL 도메인이 제조될 수 있도록 하는 조건하에서 상기 핵산을 발현시키는 단계, 및 그를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
하기에서 더욱 상세하게 기술되는 바, 핵산은 하나 이상의 CDR이 존재하지 않는 변이체 면역글로불린 또는 그의 VH 또는 VL 도메인을 코딩할 수 있다. CDR(들)을 코딩하는 적합한 핵산을 변이체 면역글로불린 또는 그의 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 내로 삽입함으로써 공여체 면역글로불린으로부터 수득된 하나 이상의 CDR을 변이체 면역글로불린의 프레임워크 내로 도입할 수 있다.
변이체 면역글로불린 및 코딩 핵산은 단리된 것이 바람직하다. 면역글로불린 및 핵산은 시험관내 또는 생체내에서 수행된 재조합 DNA 기법에 의한 제조 방법이 이루어진 경우, 그들이 제조되는 환경(예를 들어, 세포 배양물)에서 그들과 함께 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산과 같은, 그들과 회합하고 있던 물질을 함유하지 않거나, 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 기술된 변이체 면역글로불린 또는 그의 CH1, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 1 이상 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태로 핵산 작제물(construct)을 제공한다.
작제물은 상기 기술된 면역글로불린 발현을 위한 발현 시스템에서 사용될 수 있다.
각종 상이한 숙주 세포에서 면역글로불린을 클로닝 및 발현시키기 위한 시스템은 주지되어 있다. 적합한 숙주 세포로는 세균, 포유동물 세포, 효모 및 바큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종성 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용가능한 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 골수종 세포 및 기타 다수를 포함한다. 소형 면역글로불린 분자를 위한 것으로서, 일반적으로 바람직한 세균 숙주는 이. 콜라이이다.
원핵 세포, 예를 들어, 이. 콜라이에서의 면역글로불린, 예를 들어, 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 잘 확립되어 있다. 그에 관한 리뷰를 위해, 예를 들어, 문헌 [Plueckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]을 참조하라. 진핵 세포 배양물 중에서의 발현은 또한 면역글로불린 제조를 위한 옵션으로서 당업자에게 이용가능하며, 그에 관한 최근의 리뷰를 위해, 예를 들어, 문헌 ([Ref, M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576]; [Trill J.J. et al., (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560])을 참조하라. 면역글로불린, 예를 들어, 항체 및 항체 단편은 또한 무세포 시스템 중에서 발현될 수 있다.
프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절하게는 다른 서열을 비롯한, 적절한 조절 서열을 포함하는 면역글로불린 발현에 적합한 벡터가 선택될 수 있거나, 구성될 수 있다. 벡터는 바이러스 플라스미드, 예를 들어, 적절하게는 파지 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 설명을 위해서, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning : a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조하라. 예를 들어, 핵산 작제물 제조, 돌연변이유발, 서열 분석, DNA의 세포 내로의 도입, 및 유전자 발현에서의 핵산 조작, 및 단백질 분석에 관한 다수의 공지 기법과 프로토콜은 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세히 기술되어 있다.
변이체 면역글로불린 또는 그의 CH1, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산은 숙주 세포 내에 포함되어 있을 수 있다. 추가의 다른 측면은 상기 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 도입은 임의의 이용가능한 기법을 사용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기법은 인산칼슘 형질감염, DEAE 덱스트란, 전기천공, 리포좀 매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어, 백시니아를 사용한 형질도입을 포함하고, 곤충 세포의 경우에는 바큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함한다. 숙주 세포에서의, 특히, 진핵 세포에서의 바이러스 또는 플라스미드 기반 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피좀으로 유지될 수 있거나, 숙주 세포 내로 또는 인공 염색체 내로 도입될 수 있다. 도입은 단일 또는 다중 유전자 부위에 하나 이상의 카피를 무작위로 또는 표적화하여 통합시킴으로써 이루어질 수 있다. 세균 세포의 경우, 적합한 기법으로는 예를 들어, 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.
도입 후, 예를 들어, 유전자 발현을 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터 발현시키거나, 발현될 수 있도록 할 수 있다.
변이체 면역글로불린 또는 그의 CH1, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기법에 따라 게놈과의 재조합을 촉진시키는 서열을 포함함으로써 촉진될 수 있다.
발현에 의해 변이체 면역글로불린 또는 그의 CH1, VH 및/또는 VL 도메인을 제조한 후, 임의의 적합한 기법을 사용하여 이를 단리 및/또는 정제할 수 있다. 예를 들어, 제조 방법은 추가로 상기 생성물을, 1 이상의 추가 성분, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로 제제화시키는 것을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린는 인체 또는 동물 신체 치료 또는 진단 방법, 예를 들어, 인간 환자에게 유효량의 변이체 면역글로불린을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법(이는 예방 치료법도 포함할 수 있다)에서 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 기술된 변이체 면역글로불린을 포함하는 약학 조성물, 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 변이체 면역글로불린을 제제화시키는 것을 포함하는 약제 또는 약학 조성물 제조 방법, 및 투여용 약제의 제조에서 변이체 면역글로불린의 용도를 제공한다.
변이체 면역글로불린 이외에도, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 주지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 물질은 비독성이어야 하고, 활성 성분의 효능에 간섭하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 따라 달라질 것이며, 투여 경로는 경구 투여, 또는 주사, 예를 들어, 정맥내 주사일 수 있다.
정맥내 주사, 또는 이환 부위에의 주사를 위해, 활성 성분은 발열 물질 무함유의, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 가진, 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 것이다. 당업자는 예를 들어, 등장성 비히클, 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트를 가한 링거 주사액을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있을 것이다. 필요에 따라, 방부제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제를 포함할 수 있다.
치료하고자 하는 병증에 따라 조성물은 단독으로, 또는 다른 치료법과 함께 조합되어 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 치료법으로는 적합한 용량의 진통제 약물, 비스테로이드성 약물(예를 들어, 아스피린, 파라세타몰, 이부프로펜, 또는 케토프로펜), 또는 아편제, 모르핀, 또는 구토 방지제를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린의 사용이 치료학상 이익될 수 있는 임상적 징후로는 모체 면역글로불린이 유용할 수 있는 임의의 병증 또는 질병을 포함한다.
본 발명에 따라, 제공되는 조성물은 개체에게 투여될 수 있다. 환자에게 충분히 이익이 될 수 있는 "치료학적 유효량"으로 투여되는 것이 바람직하다. 그러한 이익은 1가지 이상의 증상이 적어도 호전되는 것일 수 있다. 실제 투여량, 및 투여 속도 및 투여 시간 경과는 치료 대상의 성질 및 증증도에 따라 달라질 것이다. 치료법, 예를 들어, 투여량 등을 처방하는 것은 일반의 및 다른 의사의 책임 범위 안에 있다. 항체의 적절한 용량은 당업계에 주지되어 있고; 문헌 ([Ledermann J.A. et al., (1991) lnt J. Cancer 47: 659-664]; [Bagshawe K.D. et al., (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922])를 참조하라.
정확한 용량은 항체가 진단용인지 또는 치료용인지 여부, 치료하고자 하는 부위의 크기 및 위치, 항체(예를 들어, 전체 항체, 단편 또는 디아바디)의 정확한 성질 및 항체에 부착된 임의의 검출가능한 라벨 또는 다른 분자의 성질을 비롯한 인자에 따라 달라질 것이다. 전형적인 항체 용량은 전형적으로 전신 적용시 0.5 mg 내지 1 g 범위, 및 국소 적용시 10 ㎍ 내지 1 mg일 것이다. 전형적으로, 항체는 전체 항체, 바람직하게, IgG4 이소형일 것이다. 이는 성인 환자의 단일 치료를 위한 용량인데, 상기 용량은 아동 및 유아에 대해서 비례적으로 조절될 수 있고, 다른 항체 포맷에 대해서도 또한 분자량에 비례하는 방식으로 조절될 수 있다. 치료는 매일, 주 2회, 매주, 또는 매월 진행되는 간격으로, 의사의 재량에 따라 반복될 수 있다.
본원에 기술된, 응집되기 쉬운 세그먼트내 치환을 포함하는 변이체 면역글로불린 및 코딩 핵산은 제조성이 개선된 면역글로불린을 제조하는 항체 공학처리 방법에서 유용할 수 있다.
재조합 DNA 기술을 사용하여 제조성이 개선된 변이체 면역글로불린을 제조할 수 있다. 적합한 기법으로는 본원에 기술된 바와 같이, 공여체 항체의 CDR 서열 하나 이상을 코딩하는 DNA를 변이체 면역글로불린의 가변 영역에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 다수의 후속 문헌들을 참조하라. 별법으로, 생산된 면역글로불린의 제조성을 개선시키는, 면역글로불린의 응집되기 쉬운 세그먼트를 코딩하는 서열내 유전자를 유전적으로 돌연변이화시키는 유전적 돌연변이를 하이브리도마 또는 면역글로불린을 생산하는 다른 세포에 가할 수 있다. 이는 재조합 생산에 적합한 제조성을 가진 항체를 공학처리하거나, 또는 리포맷시키는 데 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변이체 면역글로불린의 VH 및 VL 도메인에 하나 이상의 CDR 서열(예를 들어, CDR3)이 존재하지 않을 수 있다. 재조합 DNA 기술을 사용하여 이종 또는 합성 CDR을 상응하는 CDR(예를 들어, CDR3)이 존재하지 않는 변이체 면역글로불린 VH 및/또는 VL 도메인 내로 도입할 수 있다. 이는 제조성에는 영향을 주지 않으면서 변이체 면역글로불린의 결합 특성을 변경시킬 수 있다.
예를 들어, 공여체 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR 서열(예를 들어, CDR3)을 사용하여 본원에 기술된 변이체 면역글로불린 중 상응하는 CDR 서열을 대체시킬 수 있다. 본원에 기술된 인간 변이체 면역글로불린으로부터의 CDR 서열 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 모두를 비인간 공여체 면역글로불린, 예를 들어, 뮤린 면역글로불린으로부터의 수득된 CDR 서열로 대체시켜 인간화된 면역글로불린을 제조할 수 있다. 인간화된 면역글로불린은 비인간 공여체 면역글로불린과 같은 결합 활성을 가지지만, 인간에서는 감소된 면역원성을 보일 수 있는 바, 이에, 인간화된 면역글로불린은 치료학적 유용성을 가질 수 있다.
표적 항원에 결합하는 하이브리드 면역글로불린을 제조하는 방법은
상기 표적 항원에 결합하는 공여체 면역글로불린을 제공하는 단계,
상기 기술된 변이체 면역글로불린을 제공하는 단계; 및
상기 변이체 면역글로불린의 CDR 서열 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개를 상기 공여체 면역글로불린으로부터의 상응하는 CDR 서열로 대체시키는 단계,
이를 통해 상기 표적 항원에 결합하는 하이브리드 면역글로불린을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게, 변이체 면역글로불린의 VH CDR3 및/또는 VL CDR3을 공여체 면역글로불린으로부터의 상응하는 VH CDR3 및/또는 VL CDR3으로 대체시킨다.
변이체 면역글로불린은 인간 면역글로불린일 수 있고, 공여체 면역글로불린은 비인간 면역글로불린일 수 있다.
CDR 이식에 의해 면역글로불린을 인간화시키는 데 적합한 기법은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, 문헌 ([Riechman et al., (1988) Nature 332 323-327]; [Queen et al., PNAS USA (1989) 86 10029-10033]) 참조).
하이브리드 면역글로불린의 VL CDR3은 상기 기술된 바와 같이 VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트 또는 VL CDR3 C 말단 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함할 수 있다.
하이브리드 면역글로불린의 VH CDR3은 상기 기술된 바와 같이 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함할 수 있다.
적합한 변이체 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 프레임워크 또는 불변 영역 중에 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치환을 공여체 VH 및/또는 VL CDR3 서열 내로 도입할 수 있다. 변이체 면역글로불린 내로의 삽입 이전 또는 이후에 표준 기법을 사용하여 치환을 수행할 수 있다.
본원에 기술된 변이체 면역글로불린은 또한 CDR 이식 이외의 인간화 방법에도 또한 유용할 수 있다. 면역글로불린의 제조성을 개선시키기 위해 인간화된 항체를 생산하는 동안 본원에 기술된 하나 이상의 치환을 변이체 면역글로불린 내로 도입할 수 있다. 사용될 수 있는 인간화 기법은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Padlan et al., Mol. Immunol. (1991) 28 489-498] 참조).
본원에 기술된 변이체 면역글로불린은 면역 특이성을 단리시키기 위한 라이브러리 또는 레퍼토리 생산에 유용할 수 있다.
변이체 면역글로불린 라이브러리를 제조하는 방법은
본원에 기술된 변이체 면역글로불린 집단을 제공하는 단계,
상기 변이체 면역글로불린 집단의 CDR 서열 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개를 CDR 서열의 레퍼토리로 대체시키는 단계,
이를 통해 변이체 면역글로불린을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
변이체 면역글로불린 라이브러리는 같은 변이체 면역글로불린 배경 중 다양한 레퍼토리의 대체 CDR 서열을 포함할 것이다.
라이브러리는 항원에 특이적인 변이체 면역글로불린에 대해 스크리닝될 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 변이체 면역글로불린 집단의 VH CDR3을 VH CDR3 서열의 레퍼토리로 대체시킬 수 있다. 예를 들어, 표적 항원에 결합하는 변이체 면역글로불린을 제조하는 방법은
(a) 대체시키고자 하는 CDR3을 포함하거나, CDR3 코딩 영역이 존재하지 않는 VH 도메인을 코딩하는 핵산들로 구성된 출발 집단을 제공하는 단계로서, 상기 VH 도메인은 본원에 기술된 하나 이상의 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환을 포함하는 것인 단계,
(b) 공여체 핵산이 VH 도메인 집단 중의 CDR3 영역 내로 삽입되도록 상기 VH 도메인 집단을 VH CDR3 아미노산 서열의 레퍼토리를 코딩하는 공여체 핵산 집단과 조합하여 상기 VH CDR3 서열을 포함하는 VH 도메인의 레퍼토리를 코딩하는 핵산들로 구성된 생성물 집단을 제공하는 단계;
(c) 상기 생성물 집단의 핵산을 발현시키는 단계;
(d) 표적 항원에 특이적인 면역글로불린을 선별하는 단계; 및
(e) 상기 면역글로불린 또는 그를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
VH 도메인을 코딩하는 핵산 집단은 상기 기술된 바와 같이, CH1 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환을 포함하는 CH1 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
같은 방식으로, VL CDR3 서열의 레퍼토리를, 상기 기술된 바와 같이, CH1 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환을 포함하며, 대체시키고자 하는 VL CDR3을 포함하거나, VL CDR3 코딩 영역이 존재하지 않는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 집단과 조합시킬 수 있다.
CDR3 이외에도, CDR1 및 CDR2 서열의 레퍼토리 또한 상기 기술된 바와 같이, 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환을 포함하는 VH 및/또는 VL 도메인들로 구성된 집단 내로 이식시킨 후, 표적 항원에 특이적인 변이체 면역글로불린에 대해 스크리닝할 수 있다.
CDR 유래 서열의 레퍼토리는 상응하는 CDR 서열이 존재하지 않는, 본원에 기술된 VH 또는 VL 도메인 집단으로 셔플링될 수 있고, 셔플링된 완전 VH 또는 VL 도메인은 동족 VL 또는 VH 도메인(이는 또한 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다)과 조합하여 공학처리된 변이체 면역글로불린을 제공할 수 있다. 이어서, 레퍼토리를 적합한 숙주 시스템, 예를 들어, WO92/01047의 파지 디스플레이 시스템에 디스플레이시킴으로써 제조성이 개선된 적합한 면역글로불린을 선별해낼 수 있다. 레퍼토리는 104개 이상의 개체 구성원, 예를 들어, 106개 내지 108 또는 1010개의 구성원으로부터의 임의의 것으로부터 구성될 수 있다.
CDR 셔플링 및 항체 공학처리 기법은 당업계에 주지되어 있고, 당업자는 상기 기법을 사용하여 통상의 방법을 사용함으로써 제조성이 개선된 면역글로불린을 제공할 수 있다.
CDR 서열의 레퍼토리는 CDR 서열내 하나 이상의 위치에 존재하는 다양한 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, CDR 서열의 레퍼토리는 CDR 서열내 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 위치에 존재하는 다양한 잔기를 포함할 수 있다.
CDR 서열의 레퍼토리는 CDR 서열내 하나 이상의 가변 위치를 포함할 수 있다. 예를 들어, CDR 서열의 레퍼토리는 CDR 서열내 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 가변 위치를 포함할 수 있다. 각 가변 위치에 존재하는 잔기는 레퍼토리의 상이한 구성원들 간에 차이가 있을 수 있다. 가변 위치에 존재하는 잔기는 임의의 것일 수 있거나(예를 들어, 확률이 동일한 임의의 천연적으로 발생된 아미노산일 수 있거나), 또는 아미노산들로 구성된 소정의 군 또는 서브세트로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 변이체 면역글로불린의 VL CDR3은, 91번 위치의 A, F, L, R, S 및 W , 93번 위치의 D,, F, L, Q, S, T, W 및 Y, 및/또는 96번 위치의 E, L, V 및 W를 포함하는 공여체 VL CDR3 서열의 레퍼토리로 대체시킬 수 있다. 변이체 면역글로불린의 VH CDR3은 100c번 위치의 D, E, F, G, P, S, T, W, 및 Y, 100d번 위치의 F, G, L, P 및 M, 102번 위치의 A, F, H, I, L, V 및 Y, 및/또는 103번 위치의 I, L 및 V를 포함하는 공여체 VH CDR3 서열의 레퍼토리로 대체시킬 수 있다.
상기 위치에 존재하는 상기 잔기에 대한 CDR3 레퍼토리의 편향성은 제조성 개선에 도움이 될 수 있다.
하나 이상의 가변 위치 이외에도, CDR 서열의 레퍼토리는 또한 하나 이상의 비가변 위치를 포함할 수 있다. 각 비가변 위치에 존재하는 잔기는 레퍼토리 각 구성원에서 동일한 것일 수 있다.
CDR 서열의 레퍼토리를 수령체 변이체 면역글로불린 내로 도입시키는 것은, 라이브러리의 각 구성원들이 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환을 포함하는 것인, 다양한 결합 특성을 가진 변이체 면역글로불린 라이브러리를 제조하는 데 유용할 수 있다.
변이체 면역글로불린 라이브러리는
본원에 기술된 바와 같이 프레임워크 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 영역에 치환을 포함하는 VL 도메인;
본원에 기술된 바와 같이 프레임워크 응집되기 쉬운 영역 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VH 도메인; 및/또는
본원에 기술된 바와 같이 CH1 응집되기 쉬운 영역에 치환을 포함하는 CH1 도메인을 포함할 수 있고;
여기서, 라이브러리의 구성원들은 하나 이상의 CDR 서열에서 차이를 가진다.
변이체 면역글로불린 라이브러리는 표적 항원에 결합할 수 있는, 제조성이 개선된 면역글로불린을 확인하는 데 유용할 수 있다. 표적 항원에 결합하는 하나 이상의 면역글로불린을 수득하는 방법은:
상기 기술된 면역글로불린의 라이브러리를 상기 항원과 접촉시키는 단계, 및
상기 항원에 결합할 수 있는, 라이브러리 중의 하나 이상의 면역글로불린을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
라이브러리는 박테리오파지 입자 표면 상에 디스플레이될 수 있는데, 각 입자는 각 표면 상에 디스플레이된, 항체 VH 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하고, 임의로는 존재할 경우, 디스플레이된 VL 도메인을 포함한다.
항원에 결합할 수 있고, 박테리오파지 입자 상에 디스플레이된 면역글로불린을 선별한 후, 상기 면역글로불린을 디스플레이하는 박테리오파지 입자로부터 핵산을 수득할 수 있다. 상기 면역글로불린을 디스플레이하는 박테리오파지 입자로부터 수득된 핵산 서열을 가진 핵산으로부터의 발현에 의해 면역글로불린 또는 그의 항체 VH 가변 도메인 및/또는 VL 도메인을 제조하는 후속 생산에 상기 핵산이 사용될 수 있다.
면역글로불린은 항원에 결합할 수 있는 능력; 항원에의 결합에 대해 다른 면역글로불린과 경쟁할 수 있는 능력 및/또는 항원을 중화시킬 수 있는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 상이한 면역글로불린의 결합 치환성 및 중화 효능은 적절한 조건하에서 비교될 수 있다. 면역글로불린의 제조성 또한 테스트될 수 있다.
본 발명의 다양한 추가의 측면 및 실시양태는 본 개시내용을 통해 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에서 언급된 모든 문헌들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "및/또는"은 구체화된 2개의 특징 또는 구성 요소들 각각을 다른 것과 함께, 또는 다른 것을 포함하지 않고 구체적으로 개시하는 것으로 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 마치 본원에서 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B, 각각을 개별적으로 기재한 것과 같이 구체적으로 개시하는 것으로 한다.
문맥상 달리 언급하지 않는 한, 상기 기술된 특징에 관한 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 측면 또는 실시양태로 제한하고자 하지 않으며, 기술된 모든 측면 및 실시양태에 동등하게 적용된다.
이에, 본 발명의 특정 측면 및 실시양태는 일례에 의해서, 및 하기 기술하는 표를 참고로 하여 설명될 것이다.
하기 표 1a 및 1b는 면역글로불린 VH 및 VL 도메인에 대한 카바트 번호화 체계와 오네게르 번호화 체계 사이의 유사성을 나타낸다.
하기 표 2a 및 2b는 제조성이 개선된 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 아미노산 치환에 관한 예를 나타낸다. 바람직한 치환 또한 표시되어 있다. 아미노산에 대한 표준 IUPAC-IUB JCBN 1문자 명명법이 사용되었다.
표 3a 및 3b는 제조성이 개선된 응집되기 쉬운 세그먼트 내의 치환 조합에 관한 예를 나타낸다.
표 4는 변이체 면역글로불린 일례들의 제조성을 나타낸다.
실험부
유전자 합성
서열은 상업적 공급업체에 의해 최적화 및 합성하고, pEE6.4 및 pEE12.4로 서브클로닝시켰다. Top10 세포로 형질전화시켜 DNA 스톡을 제조하고, LB 브로쓰 중에서 O/N 배양하고, 퀴아젠 엔도프리(QIAGEN Endofree) 플라스미드 정제용 키트를 사용하여 정제하였다. DNA를 TE 완충액 중에 재현탁시키고, 나노드롭(Nanodrop) 분광광도계를 사용하여 농도를 측정하였다.
통상의 세포 배양
15 mM L 글루타민으로 보충된 CD-CHO 배지 중에서 CHOK1SV 세포를 매 3-4일마다 서브배양하고, 진탕용 CO2 인큐베이터 (140 rpm) 중 36.5℃, 10% CO2, 85% 습도하에서 인큐베이션시켰다.
일시적 형질감염
리포텍트아민 2000(Lipofectamine 2000)을 사용하여 CHOK1 SV 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 72 h 경과시, 상등액을 수거하고, 원심분리시키고, 분석하기 전에 4℃에서 보관하였다.
안정적인 형질감염
MSX 선별을 사용함으로써 안정적으로 형지감염된 CHOK1SV 세포를 사용하여 대규모 발현을 수행하였다. 일단 수거한 후, 정제하기 전에 상등액을 4℃에서 보관하였다.
정제
하이트랩(HiTrap) 칼럼(GE)을 사용하여 상등액을 단백질 A 정제시키고, 농축 및 완충액 교환 이전에 4℃에서 보관하였다.
항체 농축 및 완충액 교환
2,000 g에서 15-20 min 동안 원심분리하여 샘플을 농축시켰다. 제조용 완충액 (50 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, pH 7.4)을 사용하여 4-5회에 걸쳐 물질의 완충액을 교환하였다. 일단 완충액을 교환한 후, 샘플을 제조용 완충액 중에서 적절한 실험용 농도로 희석시켰다.
GP - HPLC
애질런트 1200(Agilent 1200) 시리즈 HPLC 시스템 상에서 GP-HPLC에 의해 이중 샘플을 분석하였다. (4℃에서 보관된) 80 ㎕ 분취량의 1 mg/ml 샘플을 주입하고, 15 min 동안 1 ml/min로 전개시켰다. 켐스테이션(chemstation) 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하였다.
IgG 역가
샌드위치 ELISA를 사용하여 항체 발현율을 측정하였다. 역가를 경쇄 특이 대조군으로 정규화시켰다.
티오플라빈 T 결합
티오플라빈 T를 사용하여 응집에 대해 모니터링할 수 있다. 1 mg/ml의 정제된 항체를 1 h 동안 60℃에서 인큐베이션시킨 후, 최종 농도 30 μM의 티오플라빈 T와 함께 혼합하고, Ex=305, Em=508 nm에서 형광도를 측정하였다(문헌 [Hawe, A., Sutter, M and Jiskoot, W. Pharmaceutical Research 2008 25 (7) 1487-99]).
ANS 결합
8-아닐리노-1-나프탈렌술폰산(ANS)을 사용하여 응집에 대해 모니터링할 수 있다. 1 mg/ml의 정제된 항체를 1 h 동안 60℃에서 인큐베이션시킨 후, 최종 농도 30 μM의 ANS와 함께 혼합하고, Ex=360, Em/508 nm에서 형광도를 측정하였다(문헌 [Hawe, A., Sutter, M and Jiskoot, W. Pharmaceutical Research 2008 25 (7) 1487-99]).
결과
인실리코 및 시험관내 방법에 의해 면역글로불린 서열을 분석함으로써 응집되기 쉬운 세그먼트를 확인하였다. 확인된 응집되기 쉬운 세그먼트는 하기 표 2에 제시되어 있다.
응집 성향을 감소시키는 것으로서, 서열 번호 1 및 2에 제시되어 있는 VH 및 VL 도메인의 확인된 응집되기 쉬운 세그먼트내 존재하는 치환을 디자인하고, 합성하였다(표 2). 치환이 면역글로불린의 발현, 안정성 및 응집에 미치는 효과에 대해 테스트하였다(표 3 및 4).
확인된 응집되기 쉬운 세그먼트내 존재하는 잔기의 치환을 통해 제조성이 개선되었으며, 특히, 응집 성향이 감소하였고/거나, 생산 수준이 개선된 것으로 나타났다.
번호화된 본 발명의 추가 서술
1. 프레임워크(FR) 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 상보성 결정 영역 3(CDR3) 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인;
프레임워크 영역 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인; 및/또는
CH1 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(CH1) 도메인을 포함하는 변이체 면역글로불린.
2. 모체 면역글로불린을 확인하는 단계,
모체 면역글로불린의 VL 도메인 중 프레임워크 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 치환을 도입하는 단계, 및/또는
모체 면역글로불린의 VH 도메인 중 프레임워크 영역 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 치환을 도입하는 단계, 및/또는
모체 면역글로불린의 CH1 도메인 중 불변 영역 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 치환을 도입하는 단계,
이를 통해 모체 면역글로불린에 비하여 제조성이 개선된 변이체 면역글로불린을 제조하는 단계를 포함하는, 면역글로불린의 제조성을 개선시키는 방법.
3. 제1의 서술 내지 제2의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, 변이체 면역글로불린이 모체 면역글로불린에 비하여 감소된 응집 성향, 및/또는 발현시 증가된 생산성을 가진 것인 면역글로불린 또는 방법.
4. 제1의 서술 내지 제3의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VL 도메인 프레임워크 응집되기 쉬운 세그먼트가 20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트, 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 및 74번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
5. 제4의 서술에 있어서, 20번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트가 VL 도메인의 15번 위치부터 23번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
6. 제5의 서술에 있어서, VL 도메인이 VL 도메인의 18번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
7. 제6의 서술에 있어서, 18번 위치의 잔기가 R, S 또는 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
8. 제7의 서술에 있어서, VL 도메인이 T18R, T18S 또는 T18V를 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
9. 제5의 서술 내지 제8의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VL 도메인이 VL 도메인의 20번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
10. 제9의 서술에 있어서, 20번 위치의 잔기가 K, R, S 또는 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
11. 제10의 서술에 있어서, VL 도메인이 T20K, T20R, T20S 또는 T20V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
12. 제4의 서술 내지 제11의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트가 VL 도메인의 42번 위치부터 49번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
13. 제12의 서술에 있어서, VL 도메인이 45번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
14. 제13의 서술에 있어서, 45번 위치의 잔기가 E, K, R, Q 또는 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
15. 제14의 서술에 있어서, VL 도메인이 T45E, T45K, T45R, T45Q 또는 T45V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
16. 제12의 서술 내지 제15의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VL 도메인이 46번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
17. 제16의 서술에 있어서, 46번 위치의 잔기가 L 또는 Y로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
18. 제17의 서술에 있어서, VL 도메인이 T46L 또는 T46Y 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
19. 제4의 서술 내지 제18의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, 74번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트가 VL 도메인 서열의 71번 위치부터 77번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
20. 제19의 서술에 있어서, VL 도메인이 VL 도메인의 74번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
21. 제20의 서술에 있어서, 74번 위치의 잔기가 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
22. 제21의 서술에 있어서, VL 도메인이 T74V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
23. 제1의 서술 내지 제22의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VL 도메인 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트가 VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트 및 VL CDR3 C 말단 응집되기 쉬운 세그먼트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
24. 제23의 서술에 있어서, VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트가 VL 도메인 서열 중 잔기 C88부터 잔기 C88로부터의 8번 위치의 아미노산 C 말단까지를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
25. 제24의 서술에 있어서, VL 도메인이 88번 위치, 89번 위치, 90번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치, 95 또는 95a번 위치 중 하나 이상의 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
26. 제25의 서술에 있어서, VL 도메인이 91번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
27. 제26의 서술에 있어서, 91번 위치의 잔기가 A, F, L, R, S 또는 W로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
28. 제27의 서술에 있어서, VL 도메인이 Y91A, Y91F, Y91L, Y91R, Y91S 또는 Y91W 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
29. 제24의 서술 내지 제29의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VL 도메인이 93번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
30. 제29의 서술에 있어서, 93번 위치의 잔기가 D, F, L, Q, S, T, W 또는 Y로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
31. 제30의 서술에 있어서, VL 도메인이 P93D, P93F, P93L, P93Q, P93S, P93T, P93W 또는 P93Y 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
32. 제23의 서술에 있어서, VL C 말단 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트가 VL 도메인 서열 중 잔기 F98의 3번 위치의 아미노산 N 말단부터 99번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
33. 제32의 서술에 있어서, VL 도메인이 95번 위치, 96번 위치, 97번 위치, 98번 위치 또는 99번 위치 중 하나 이상의 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
34. 제33의 서술에 있어서, VL 도메인이 96번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
35. 제34의 서술에 있어서, 96번 위치의 잔기가 E, L, V 또는 W로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
36. 제35의 서술에 있어서, VL 도메인이 R96E, R96L, R96V 또는 R96W 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
37. 제1의 서술 내지 제36의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VH 도메인 프레임워크 응집되기 쉬운 세그먼트가 FR1 응집되기 쉬운 세그먼트; 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트; 및 102번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
38. 제37의 서술에 있어서, FR1 응집되기 쉬운 세그먼트가 VH 도메인 서열의 프레임워크 영역 1에 위치하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
39. 제38의 서술에 있어서, FR1 응집되기 쉬운 세그먼트가 1번 위치부터 3번 위치; 4번 위치부터 6번 위치, 11번 위치부터 13번 위치, 및 16번 위치부터 21번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 응집되기 쉬운 세그먼트인 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
40. 제39의 서술에 있어서, FR1 응집되기 쉬운 세그먼트가 1번 위치부터 3번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
41. 제40의 서술에 있어서, VH 도메인이 VH 도메인의 1번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
42. 제41의 서술에 있어서, 1번 위치의 잔기가 E, Q, D, A 또는 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
43. 제42의 서술에 있어서, VH 도메인이 Q1E, Q1D, Q1A 또는 Q1V 치환 또는 E1Q, E1D, E1A 또는 E1V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
44. 제39의 서술에 있어서, FR1 응집되기 쉬운 세그먼트가 VH 도메인의 4번 위치부터 6번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
45. 제44의 서술에 있어서, VH 도메인이 VH 도메인의 VH 도메인의 5번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
46. 제45의 서술에 있어서, 5번 위치의 잔기가 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
47. 제46의 서술에 있어서, VH 도메인이 L5V를 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
48. 제39의 서술에 있어서, FR1 응집되기 쉬운 세그먼트가 VH 도메인의 11번 위치부터 13번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
49. 제48의 서술에 있어서, VH 도메인이 VH 도메인의 VH 도메인의 12번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
50. 제49의 서술에 있어서, 12번 위치의 잔기가 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
51. 제50의 서술에 있어서, VH 도메인이 L12V를 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
52. 제39의 서술에 있어서, FR1 응집되기 쉬운 세그먼트가 VH 도메인의 16번 위치부터 21번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
53. 제52의 서술에 있어서, VH 도메인이 VH 도메인의 17번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
54. 제53의 서술에 있어서, 17번 위치의 잔기가 R로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
55. 제54의 서술에 있어서, VH 도메인이 G17R 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
56. 제52의 서술 내지 제55의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VH 도메인이 19번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
57. 제56의 서술에 있어서, 19번 위치의 잔기가 T 또는 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
58. 제57의 서술에 있어서, VH 도메인이 L19T 또는/및 L19V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
59. 제52의 서술 내지 제58의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VH 도메인이 20번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
60. 제59의 서술에 있어서, 20번 위치의 잔기가 A, K, S 또는 T로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
61. 제60의 서술에 있어서, VH 도메인이 R20A, R20K 또는 R20S 또는 R20T 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
62. 제37의 서술 내지 제61의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트가 91번 위치부터 99번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
63. 제62의 서술에 있어서, VH 도메인이 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치, 95번 위치, 96번 위치, 97번 위치, 98번 위치 및/또는 99번 위치 중 하나 이상의 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
64. 제63의 서술에 있어서, VH 도메인이 94번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
65. 제64의 서술에 있어서, 94번 위치의 잔기가 R로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
66. 제65의 서술에 있어서, VH 도메인이 K94R 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
67. 제63의 서술 내지 제66의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VH 도메인이 96번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
68. 제67의 서술에 있어서, 96번 위치의 잔기가 A로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
69. 제68의 서술에 있어서, VH 도메인이 G96A 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
70.제1의 서술 내지 제69의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트가 100c번 위치부터 103번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
71. 제70의 서술에 있어서, VH 도메인이 100c번 위치, 100d번 위치, 101번 위치, 102번 위치 및 103번 위치 중 하나 이상의 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
72. 제71의 서술에 있어서, VH 도메인이 100c번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
73. 제72의 서술에 있어서, 100c번 위치의 잔기가 D, E, F, G, P, S, T, W, 또는 Y로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
74. 제73의 서술에 있어서, VH 도메인이 A100cD, A100cE, A100cF, A100cG, A100cP, A100cS, A100cT, 또는 A100cW 또는 A100cY를 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
75. 제70의 서술 내지 제74의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VH 도메인이 100d번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
76. 제75의 서술에 있어서, 100d번 위치의 잔기가 F, G, L, P 또는 M으로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
77. 제76의 서술에 있어서, VH 도메인이 S100dF, S100dG, S100dL, S100dP 또는 S100dM 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
78. 제70의 서술 내지 제77의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VH 도메인이 102번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
79. 제78의 서술에 있어서, 102번 위치의 잔기가 A, F, H, I, L, V 또는 Y로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
80. 제79의 서술에 있어서, VH 도메인이 P102A, P102F, P102H, P102I, P102L, P102Y 또는 P102V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
81. 제70의 서술 내지 제80의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, VH 도메인이 103번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
82. 제81의 서술에 있어서, 103번 위치의 잔기가 I, L 또는 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
83. 제82의 서술에 있어서, VH 도메인이 W103I, W103L 또는 W103V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
84. 제1의 서술 내지 제83의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, CH1 응집되기 쉬운 세그먼트가 150번 위치부터 156번 위치를 포괄하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
85. 제84의 서술에 있어서, CH1 도메인이 153번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
86. 제85의 서술에 있어서, CH1 도메인이 153번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
87. 제86의 서술에 있어서, 153번 위치의 잔기가 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
88. 제87의 서술에 있어서, VH 도메인이 S153V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
89. 제1의 서술 내지 제88의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, 변이체 면역글로불린의 서열이 모체 면역글로불린 서열과 비교하여 10개 이하의 아미노산 치환을 가지는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
90. 제1의 서술 내지 제89의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, 변이체 면역글로불린의 서열이 VL FR1 및/또는 FR2 도메인 중에 2개의 치환을; VL CDR3 도메인 중에 3개의 치환을; VL FR2 도메인 중에 2개의 치환 및 VL CDR3 도메인 중에 3개의 치환을; VL FR1 도메인 중에 2개의 치환, VL FR2 도메인 중에 2개의 치환 및 VL CDR3 도메인 중에 3개의 치환을; VH FR1 도메인 중에 2개의 치환을; VH FR1 도메인 중에 1개의 치환 및 VH CDR3 도메인 중에 1개의 치환; VH CDR3 도메인 중에 2개의 치환; 또는 CH1 도메인 중에 1개의 치환 및 VH FR1 도메인 중에 1개의 치환을 가지는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
91. 제90의 서술에 있어서, VH 도메인의 서열이 100d(D101-1) 및 102번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
92. 제91의 서술에 있어서, 102번 위치의 잔기가 A, F, H, I, L, V 또는 Y로 치환되고, 100d번 위치의 잔기가 F, G, L, P 또는 M으로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
93. 제92의 서술에 있어서, VH 도메인이 P102A, P102F, P102H, P102I, P102L, P102Y 또는 P102V 치환 및 S100dF, S100dG, S100dL, S100dP 또는 S100dM 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
94. 제93의 서술에 있어서, VH 도메인이 S100dF 및 P102V 치환, S100dM 및 P102V 치환, S100dF 및 P102Y 치환 또는 S100dM 및 P102Y 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
95. 제1의 서술 내지 제94의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, 변이체 면역글로불린이 인간화된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
96. 면역글로불린의 VL 도메인 중 18번 위치, 20번 위치, 45번 위치, 46번 위치, 74번 위치, 91번 위치, 93번 위치, 및 96번 위치, 및 면역글로불린의 VH 도메인 중 1번 위치, 5번 위치, 12번 위치, 17번 위치, 19번 위치, 20번 위치, 94번 위치, 96번 위치, 100c번 위치, 100d번 위치, 102번 위치, 및 103번 위치, 및 CH1 도메인 중 153번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 확인하는 단계로서,
면역글로불린의 VL 도메인 중 18번 위치에 R, S 또는 V, 바람직하게 R 또는 V 이외의 잔기, 20번 위치에 K, R, S 또는 V, 바람직하게 R 또는 V 이외의 잔기, 45번 위치에 E, K, R, Q 또는 V, 바람직하게 K 또는 R 이외의 잔기, 46번 위치에 L 또는 Y, 바람직하게 L 이외의 잔기, 74번 위치에 V 이외의 잔기, 91번 위치에 A, F, L, R, S, 또는 W, 바람직하게 W 이외의 잔기, 93번 위치에 D, F, L, Q, S, T, W 또는 Y, 바람직하게 Q 이외의 잔기, 및/또는 96번 위치에 E, L, V 또는 W, 바람직하게 V 이외의 잔기가 존재한다는 것; 및/또는
면역글로불린의 VH 도메인 중 1번 위치에 A, D, E, Q 또는 V 이외의 잔기, 5번 또는 12번 위치에 V 이외의 잔기, 17번 위치에 R 이외의 잔기, 19번 위치에 T 또는 V, 바람직하게 T 이외의 잔기, 20번 위치에 A, K, S 또는 T, 바람직하게 A 이외의 잔기, 94번 위치에 R 이외의 잔기, 96번 위치에 A 이외의 잔기, 100c번 위치에 D, E, F, G, P, S, T, W, 또는 Y, 바람직하게 W 이외의 잔기, 100d번 위치에 F, G, L, M 또는 P, 바람직하게 F 또는 M 이외의 잔기, 102번 위치에 A, F, H, I, L, V 또는 Y, 바람직하게 V 또는 Y 이외의 잔기, 103번 위치에 I, L 또는 V 이외의 잔기가 존재한다는 것; 및/또는
면역글로불린의 CH1 도메인 중 153번 위치에 V 이외의 잔기가 존재한다는 것은 면역글로불린의 제조성이 차선의 것임을 시사하는 것인 단계를 포함하는, 면역글로불린의 제조성을 평가하는 방법.
97. 면역글로불린의 VH 도메인 중 100d번 위치 및/또는 102번 위치에 있는 아미노산 잔기를 확인하는 단계로서,
100d번 위치에 S, 및/또는 102번 위치에 P가 존재한다는 것은 면역글로불린의 제조성이 차선의 것임을 시사하는 것인 단계를 포함하는, 면역글로불린의 제조성을 평가하는 방법.
98. 상기 치환들 중 하나 이상을 포함하는 제1의 서술 내지 제95의 서술 중 어느 한 서술에 따른 변이체 면역글로불린, 또는 VH 도메인, VL 도메인 또는 CH1 도메인을 코딩하는 단리된 핵산.
99. 제98의 서술에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
100. 제99의 서술에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
101. 상기 변이체 면역글로불린 또는 VH 도메인, VL 도메인 또는 CH1 도메인이 제조될 수 있도록 하는 조건하에서 제98의 서술에 따른 핵산을 발현시키는 단계, 및 이를 회수하는 단계를 포함하는, 변이체 면역글로불린을 제조하는 방법.
102. 제101의 서술에 있어서, 변이체 면역글로불린을, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로 제제화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
103. 제1의 서술 내지 제95의 서술 중 어느 한 서술에 따른 변이체 면역글로불린 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
104. 제1의 서술 내지 제95의 서술 중 어느 한 서술에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 변이체 면역글로불린.
105. 표적 항원에 결합하는 공여체 면역글로불린을 제공하는 단계,
제1의 서술 내지 제89의 서술 중 어느 한 서술에 따른 변이체 면역글로불린을 제공하는 단계,
상기 변이체 면역글로불린의 하나 이상의 CDR 서열을 상기 공여체 면역글로불린으로부터의 상응하는 CDR 서열로 대체시키는 단계,
이를 통해 상기 표적 항원에 결합하는 하이브리드 면역글로불린을 제조하는 단계를 포함하는 것인, 표적 항원에 결합하는 하이브리드 면역글로불린을 제조하는 방법.
106. 제105의 서술에 있어서, 하이브리드 면역글로불린의 VL CDR3이 VL CDR3 N 말단 응집되기 쉬운 세그먼트 또는 VL CDR3 C 말단 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 것인 방법.
107. 제105의 서술 또는 제106의 서술에 있어서, 하이브리드 면역글로불린의 VH CDR3이 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 것인 방법.
108. 제1의 서술 내지 제95의 서술 중 어느 한 서술에 따른 변이체 면역글로불린을 제공하는 단계,
상기 변이체 면역글로불린의 하나 이상의 CDR 서열을, CDR 서열 중의 하나 이상의 위치에 무작위 잔기를 포함하는 CDR 서열로 대체시키는 단계,
이를 통해 변이체 면역글로불린들로 구성된 다양한 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하는 것인, 변이체 면역글로불린 라이브러리를 제조하는 방법.
109. 제108의 서술에 있어서, 변이체 면역글로불린의 VL CDR3을, 91번 위치의 A, F, L, R, S 또는 W, 93번 위치의 D, F, L, Q, S, T, W 또는 Y, 및/또는 96번 위치의 E, L, V 또는 W를 포함하는 무작위 CDR3 서열로 대체시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
110. 제108의 서술 또는 제109의 서술에 있어서, 변이체 면역글로불린의 VH CDR3을, 100c번 위치의 D, E, F, G, P, S, T, W, 또는 Y, 100d번 위치의 F, G, L, P 또는 M, 102번 위치의 A, F, H, I, L, V 또는 Y, 및/또는 103번 위치의 I, L 또는 V를 포함하는 무작위 CDR3 서열로 대체시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
111. 라이브러리의 각 구성원이
프레임워크 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VL 도메인;
프레임워크 영역 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 VH 도메인; 및/또는
CH1 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 CH1 도메인을 포함하고;
여기서, 라이브러리의 구성원들은 하나 이상의 CDR 서열에서 차이를 가지는 것인, 변이체 면역글로불린 라이브러리.
112. 제111의 서술에 따른 변이체 면역글로불린 라이브러리를 코딩하는 핵산 집단.
113. 제111의 서술에 따른 변이체 면역글로불린 라이브러리를 항원과 접촉시키는 단계,
상기 항원에 결합할 수 있는, 라이브러리 중의 하나 이상의 면역글로불린을 선별하는 단계를 포함하는, 표적 항원에 결합하는, 제조성이 개선된 하나 이상의 면역글로불린을 수득하는 방법.
서열:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003

Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007

Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> Lonza Biologics PLC Arnell, Andreas Jimenez, Jose Michael, Rebecca Stallwood, Yvette Zurdo, Jesus <120> Variant Immunoglobulins with Improved Manufacturability <130> NRSFP6713770 <140> PCT/GB2010/001579 <141> 2010-08-20 <150> GB 0914691.1 <151> 2009-08-21 <150> US 61/241,717 <151> 2009-09-11 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Pro 85 90 95 Glu Met Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Tyr Glu Gly Pro Thr Tyr Phe Ala Ser Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (58)

  1. VL 도메인 및 VH 도메인을 가진 모체 면역글로불린을 확인하는 단계,
    모체 면역글로불린의 VL 도메인 중 프레임워크 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 치환을 도입하는 단계, 및/또는
    모체 면역글로불린의 VH 도메인 중 프레임워크 영역 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 치환을 도입하는 단계, 및/또는
    모체 면역글로불린의 CH1 도메인 중 불변 영역 응집되기 쉬운 세그먼트 내로 치환을 도입하는 단계,
    이를 통해 모체 면역글로불린에 비하여 제조성이 개선된, VL 도메인 및 VH 도메인을 가지는 변이체 면역글로불린을 제조하는 단계
    를 포함하는, 면역글로불린의 제조성을 개선시키는 방법.
  2. 프레임워크(FR) 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 상보성 결정 영역 3(CDR3) 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인;
    프레임워크 영역 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인; 및/또는
    CH1 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(CH1) 도메인
    을 포함하는 변이체 면역글로불린.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변이체 면역글로불린이 모체 면역글로불린에 비하여 감소된 응집 성향 및 발현시 증가된 생산성, 이 둘 모두를 나타내는 것인 방법 또는 변이체 면역글로불린.
  4. 제3항에 있어서, 변이체 면역글로불린이 모체 면역글로불린에 비하여 20% 이상 증가된 생산성 및 30% 이상 감소된 응집 성향을 나타내는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 치환이 모체 면역글로불린의 VL 도메인 중 VL 37번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 및/또는 VL 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 도입되고/거나;
    치환이 모체 면역글로불린의 VH 도메인 중 VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트; VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트; 및 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 도입된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 치환이 VH 도메인 서열의 1번 위치, 17번 위치, 94번 위치, 95번 위치, 96번 위치, 100번 위치, 100d번 위치 및 102번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치, 및/또는 VL 도메인 서열의 37번 위치, 45번 위치 및 46번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 도입된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  7. 제6항에 있어서, VL 도메인 서열 중 37번 위치의 잔기가 Q 또는 N으로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  8. 제7항에 있어서, VL 도메인이 L37Q 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인 서열 중 45번 위치의 잔기가 E, K, R, Q 또는 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  10. 제9항에 있어서, VL 도메인이 T45E, T45K, T45R, T45Q 또는 T45V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인 서열 중 46번 위치의 잔기가 L 또는 Y로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  12. 제11항에 있어서, VL 도메인이 T46L 또는 T46Y 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 서열 중 1번 위치의 잔기가 E, Q, D, A 또는 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  14. 제13항에 있어서, VH 도메인이 Q1E, Q1D, Q1A 또는 Q1V 치환 또는 E1Q, E1D, E1A 또는 E1V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 서열 중 17번 위치의 잔기가 R로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  16. 제15항에 있어서, VH 도메인이 G17R 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  17. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 서열 중 94번 위치의 잔기가 R로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  18. 제17항에 있어서, VH 도메인이 H94R 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  19. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 서열 중 95번 위치의 잔기가 D로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  20. 제19항에 있어서, VH 도메인이 R95D 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  21. 제6항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 서열 중 96번 위치의 잔기가 A로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  22. 제21항에 있어서, VH 도메인이 G96A 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  23. 제6항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 서열 중 100d번 위치의 잔기가 F, G, L, P 또는 M으로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  24. 제23항에 있어서, VH 도메인이 S100dF, S100dG, S100dL, S100dP 또는 S100dM 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  25. 제6항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 서열 중 102번 위치의 잔기가 A, F, H, I, L, V 또는 Y로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  26. 제25항에 있어서, VH 도메인이 P102A, P102F, P102H, P102I, P102L, P102Y, P102V 또는 S102V 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  27. 제3항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 면역글로불린의 서열이 모체 면역글로불린 서열과 비교하여 10개 이하의 아미노산 치환을 가지는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  28. 제3항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인의 서열이 VH FR1 응집되기 쉬운 세그먼트 및 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  29. 제28항에 있어서, VH 도메인의 서열이 1번 위치 및 102번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 102번 위치의 잔기가 A, F, H, I, L, V 또는 Y로 치환되고, 1번 위치의 잔기가 E, Q, D, A 또는 V로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  31. 제30항에 있어서, VH 도메인이 P102Y 치환 및 Q1A 또는 Q1E 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  32. 제3항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인의 서열이 VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 및 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  33. 제32항에 있어서, VH 도메인의 서열이 95번 위치 및 102번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 102번 위치의 잔기가 A, F, H, I, L, V 또는 Y로 치환되고, 95번 위치의 잔기가 E 또는 D로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  35. 제34항에 있어서, VH 도메인이 S102V 치환 및 R95D 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 추가로 94번 위치 및 100번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 94번 위치의 잔기가 R로 치환되고, 100번 위치의 잔기가 F로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  38. 제37항에 있어서, VH 도메인이 H94R 치환 및 V100F 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  39. 제3항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 면역글로불린의 VL 도메인의 서열이 37번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트 및 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 변이체 면역글로불린의 VL 도메인의 서열이 37번 위치 및 45번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 37번 위치의 잔기가 Q 또는 N으로 치환되고, 45번 위치의 잔기가 R, K 또는 E로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  42. 제41항에 있어서, VL 도메인이 L37Q 치환 및 Q45R 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  43. 제3항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 S102V 치환 및 R95D 치환을 포함하고, VL 도메인이 L37Q 치환 및 Q45R 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  44. 제3항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 VH 95번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환을 포함하고, VL 도메인이 45번 위치의 응집되기 쉬운 세그먼트에 하나 이상의 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  45. 제44항에 있어서, VH 도메인이 94번 위치 및 95번 위치에 치환을 포함하고, VL 도메인이 46번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  46. 제45항에 있어서, VH 도메인 중 94번 위치의 잔기가 R, K 또는 T로 치환되고, VH 도메인 중 95번 위치의 잔기가 E 또는 D로 치환되며, VL 도메인 중 46번 위치의 잔기가 K, R, H, F 또는 S로 치환된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  47. 제46항에 있어서, VH 도메인이 H94R 및 R95D 치환을 포함하고, VL 도메인이 L46R 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  48. 제3항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 면역글로불린의 VH 도메인이 VH CDR3 응집되기 쉬운 세그먼트에 2개 이상의 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  49. 제48항에 있어서, VH 도메인이 100d번 위치 및 102번 위치에 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  50. 제49항에 있어서, VH 도메인이 S100dF 및 P102V 치환; S100dM 및 P102V 치환; S100dF 및 P102Y 치환 또는 S100dM 및 P102Y 치환을 포함하는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 면역글로불린이 인간화된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 면역글로불린이 재조합 시스템에서 발현되는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 면역글로불린이 발현 후, 단리 및/또는 정제된 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 면역글로불린이 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제제화되는 것인 변이체 면역글로불린 또는 방법.
  55. 면역글로불린의 VL 도메인 중 37번 위치, 45번 위치 및 46번 위치, VH 도메인 중 1번 위치, 17번 위치, 94번 위치, 95번 위치, 96번 위치, 100번 위치, 100d번 위치 및 102번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 확인하는 단계로서,
    면역글로불린의 VL 도메인 중 37번 위치에 Q 이외의 잔기, 45번 위치에 E, K, R, Q 또는 V, 바람직하게 K 또는 R 이외의 잔기, 46번 위치에 L 또는 Y, 바람직하게 L 이외의 잔기가 존재한다는 것; 및/또는
    면역글로불린의 VH 도메인 중 1번 위치에 A, D, E, Q 또는 V 이외의 잔기, 17번 위치에 R 이외의 잔기, 94번 위치에 R 이외의 잔기, 96번 위치에 A 이외의 잔기, 100d번 위치에 F, G, L, M 또는 P, 바람직하게 F 또는 M 이외의 잔기, 102번 위치에 A, F, H, I, L, V 또는 Y, 바람직하게 V 또는 Y 이외의 잔기가 존재한다는 것은 면역글로불린의 제조성이 차선(sub-optimal)임을 시사하는 것인 단계를 포함하는, 면역글로불린의 제조성을 평가하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 면역글로불린의 제조성이 차선이고, 제1항 및 제3항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 면역글로불린의 제조성을 개선시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  57. 제1항 및 제3항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 변이체 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 제공하는 단계;
    상기 변이체 면역글로불린이 제조될 수 있도록 하는 조건하에서 상기 핵산을 발현시키는 단계, 및 이를 회수하는 단계
    를 포함하는, 제조성이 개선된 면역글로불린을 제조하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 변이체 면역글로불린을, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로 제제화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
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